Hospedar invasão celular e infecção oral por cepas de T. cruzi de grupos genéticos TcI e TCIV de pacientes chagásicos

Hospedar invasão celular e infecção oral por Trypanosoma cruzi
cepas de grupos genéticos TcI e TCIV de pacientes chagásicos arte abstracta
Fundo
surtos de doença de Chagas aguda por infecção oral têm sido relatados com frequência ao longo dos últimos dez anos , com maior incidência no norte da América do Sul, onde Trypanosoma cruzi
linhagem TcI predomina, sendo responsável pela maior causa de doença humana ressurgente, e uma pequena porcentagem é identificado como TCIV. Mecanismos de infecção oral e invasão da célula hospedeira por estes parasitas são mal compreendidos. Para abordar essa questão, analisamos T. cruzi
cepas isoladas de pacientes chagásicos na Venezuela, Guatemala e Brasil.
Métodos
Trypanosoma cruzi
metacíclica tripomastigotas foram inoculados por via oral em ratos. O estômago de rato recolhidos quatro dias mais tarde, bem como o estômago e o coração recolhidas 30 dias pós-infecção, foram processados ​​para análise histológica. Ensaios para imitar parasita migração através da camada de muco gástrico foram realizados por contagem dos parasitas que atravessadas filtros Transwell revestidas com mucina gástrica. Para ensaios de invasão celular, as células HeLa epiteliais humanas foram incubadas com formas metacíclicas e o número de parasitas internalizadas foi contado.
Resultados
Todos TcI e TCIV T. cruzi
cepas foram mal infectante por via oral. Parasitas ou eram indetectáveis ​​ou foram detectados em pequenas quantidades no estômago de rato, quatro dias após a administração oral. Replicação de parasitas foram encontrados no estômago e /ou no coração 30 dias pós-infecção. Em comparação com TcI linhagem, a capacidade de migração de TCIV parasitas através do filtro revestido com mucina gástrica foi superior, mas inferior ao exibido por formas metacíclicas TcVI anteriormente mostrado ser altamente infecciosos por via oral. A expressão de gp90 pepsina resistente, a molécula de superfície celular que regula negativamente a invasão, foi maior do que em TCI TCIV parasitas e, em conformidade, a capacidade de invasão de formas metacíclicas TCIV foi maior. moléculas gp90 espontaneamente liberados por formas metacíclicas TCI inibiu a entrada do parasita em células hospedeiras. parasitas TCI exibiu taxa de replicação intracelular baixo.
Conclusões
Nossas descobertas indicam que a fraca capacidade de TcI linhagem, e, em menor grau de parasitas TCIV, ao invadir o epitélio gástrico após a infecção oral de ratos pode estar associada com a ineficiência de formas metacíclicas, em particular de parasitas TCI, a migrar através da camada de muco gástrico, para invadir células epiteliais alvo e para replicar intracelularmente.
Palavras-chave
cruzi
TCI e TCIV linhagens tripomastigotas metacíclicos infecção oral de células anfitrião Trypanosoma Background invasão
o resultado da infecção por Trypanosoma cruzi
, o agente da doença de Chagas, podem variar muito: 20-30% dos pacientes cronicamente infectados desenvolvem miocardite grave, alterações do trato digestivo (megaesôfago e /ou megacólon) ocorrem com menos frequência, enquanto a maioria permanece assintomática para a vida. O fundo genético e o estado imunológico do hospedeiro, bem como a heterogeneidade da população de parasitas podem contribuir para esta diversidade [1] e, possivelmente, a via de infecção e a dose infecciosa. De acordo com a nomenclatura intra-específica estabelecida em 2009, T. cruzi
cepas são classificadas em seis unidades de digitação discretos (DTUs), TCI-TcVI [2]. Nos países do Norte da América do Sul e na região amazônica, onde megaesôfago e megacólon são cardiomiopatia rara e chagásica é comum, a TCI é o agente predominante da doença de Chagas, em contraste com a TC II, que foi isolado a partir de a maioria dos pacientes na região central do leste brasileira onde T. cruzi
infecção é geralmente associada a síndromes de mega [1, 3]. TcI tem sido apontado como a principal causa de doença humana ressurgente no norte da América do Sul, com base na genotipagem para a resolução em escala fina da distribuição geográfica, usando um grande painel de marcadores polimórficos de microssatélites [4]. Nos últimos anos, os surtos de doenças de Chagas aguda por infecção oral têm sido relatados na Venezuela [5, 6], Colômbia [7, 8] e na Amazônia brasileira [9, 10], onde TcI é prevalente e uma pequena porcentagem tem sido identificados como TCIV.
tripomastigotas metacíclicos estão implicados nos casos de T. cruzi por via oral
infecção acima referido. Com base na existência de ninhos de amastigotas dentro de secções de mucosa gástrica, mas nenhuma evidência para T. cruzi
invasão dentro da orofaringe ou esófago de animais desafiados oralmente com formas metacíclicas derivado de insectos, a invasão do epitélio da mucosa gástrica foi sugerida como sendo um portal único de entrada para T. cruzi
infecção sistêmica [11]. As experiências com estirpes de TC II e TcVI de chagásicos revelaram que as moléculas de superfície metacíclica específico de fase gp82 e gp90, que actuam como promotor e o inibidor de invasão alvo celular, respectivamente [12, 13], têm um papel central na infecção oral [14, 15]. Gp82, que se liga selectivamente a mucina gástrica [16] é altamente conservada entre T. cruzi geneticamente divergentes
linhagens [17] e é resistente à digestão por pepsina a pH ácido, enquanto que as isoformas com gp90 susceptibilidade diferencial de digestão péptica pode ser expressa em diferentes estirpes de modo que a infectividade de alta ou baixa, por via oral está associado com a expressão de pepsina-sensível ou resistente à pepsina-gp90 isoforma [14, 15]. Se uma tal diversidade na expressão de gp90 e infecciosidade oral também é encontrada em IAC e TCIV DTUs continua a ser investigado. Não há nenhuma informação sobre a infecção experimental por via oral por estes parasitas, os dados disponíveis referem-se a ratinhos injectados com tripomastigotas ou formas metacíclicas pela via intraperitoneal [18] que é um modo não natural de infecção. Aqui analisamos tripomastigotas metacíclicos de linhagens TCI e TCIV isoladas de pacientes chagásicos em diferentes regiões geográficas, no que respeita à gp82 e expressão gp90, a capacidade de migrar através da camada de mucina gástrica e invadir o epitélio da mucosa gástrica após a administração oral em ratos. Para clarificar os mecanismos de invasão do parasita, in vitro
foram realizados ensaios de invasão de células, utilizando células epiteliais humanas. Como antigénios de superfície espontaneamente derramado a partir tripomastigotas derivados de cultura de tecido [19] foram relatados para desempenhar um papel na infecção por T. cruzi
[20], nós examinamos se a moléculas de superfície foram libertadas por formas metacíclicas e influenciado invasão da célula hospedeira.
Métodos
ensaio de parasitas e invasão da célula hospedeira
Trypanosoma cruzi
cepas da coleção tripanosomatídeo Cultura (TCC), do Departamento de Parasitologia da Universidade de São Paulo, foram gentilmente cedidas pelo Dr. Marta MG Teixeira. Eles foram isoladas de pacientes chagásicos em diferentes regiões geográficas: TCC: 28 (Amazonas, Brasil), TCC: 515 (Venezuela), TCC: 588 (Guatemala), TCC: 1522 (Paraíba, Brasil), TCC: 1434 (Amapá, Brasil ). As estirpes 28, 515, 588 e 1522 foram TcI e estirpe 1434, isolada a partir de um indivíduo infectado por via oral, foi TCIV. Como um controlo, a estirpe CL (TcVI) foi utilizado em diversas experiências. Os parasitas foram mantidos ciclicamente em ratinhos e em meio de infusão de triptose fígado. Para estimular a diferenciação, parasitas foram cultivados por uma passagem em TC100 (Vitrocell, Brasil) ou de meio de Grace (Invitrogen) e formas metacíclicas foram purificados por passagem através de uma coluna de DEAE-celulose, tal como descrito [21]. células HeLa, as células epiteliais derivadas de carcinoma humano, foram cultivadas a 37 ° C em Dulbecco Meio Essencial Mínimo (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS), estreptomicina (100 ug /ml) e penicilina (100 U /ml) numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 atmosfera. ensaios de células de invasão foram realizadas como descrito em outro lugar [22], por sementeira tripomastigotas metacíclicos purificadas em cada poço de placas de 24 poços contendo 13 mm de diâmetro lamelas de vidro redondas revestidas com 1,4 × 10 5 células HeLa, quer em DMEM com 10 % FCS (D10) ou em PBS ++ (PBS contendo por litro: 140 mg CaCl 2, 400 mg KCl, 100 mg MgCl 2,6H 2O, 100 mg MgSO 4.7H 2O, 350 mg NaHCO 3). Após 1 h de incubação com os parasitas, as lamelas em duplicado foram fixados em solução de Bouin, coradas com Giemsa, e sequencialmente desidratado em acetona, uma série graduada de acetona: xilol (9: 1, 7: 3, 3: 7) e xilol. O número de parasitas intracelulares foi contado em um total de 250 células.
Infecção Oral
Cinco a seis do sexo feminino camundongos BALB /c semanas de idade, criados no biotério da Universidade Federal de São Paulo, foram utilizados. Todos os procedimentos e experiências conformado com o regulamento do Comitê de Ética institucional para a experimentação animal, eo estudo foi aprovado pelo Comitê (Protocolo nº 0234/12). Os ratinhos foram infectados com T. cruzi
formas metacíclicas por via oral (5 × 10 7 parasitas em 0,1 ml de PBS por animal), utilizando 1 mL de seringa com agulha de gavagem que foi inserido na boca dos animais. Para a detecção de parasitas no epitélio da mucosa gástrica, o estômago de ratinhos inoculados oralmente com formas metacíclicas foi recolhido 4 dias após a infecção, fixadas com 10% de formol neutro durante 24 h. Após o processamento por desidratação gradual numa série graduada de solução de etanol, seguido de imersão em xileno e incorporação de parafina, de série 5 ^ M secções de tecido foram cortadas e coradas com hematoxilina e eosina. Num outro conjunto de experiências, as formas metacíclicas foram administrados por via oral em ratos (1 × 10 6 parasitas em 0,1 ml de PBS por animal) e, começando no dia 10 pós-inoculação, a parasitemia foi monitorados duas vezes por semana, examinando 5 amostras de sangue ul recolhido a partir da cauda, ​​na microscopia de contraste de fase. Em 30 dia após a infecção, o estômago, coração e fígado foram coletadas e processadas para preparações histológicas, como descrito acima.
Ensaio da migração parasita através da camada de mucina gástrica
filtros Transwell de policarbonato (3 mm poros, 6,5 mm de diâmetro , Costar) foram revestidas com 50 ul de uma preparação contendo 10 mg de mucina gástrica /ml em água. formas metacíclicas, suspensa em 600 ul de PBS, foram adicionados ao fundo de placas de 24 poços (1 × 10 7 parasitas /cavidade), os filtros Transwell revestidas de mucina foram colocados em poços contendo parasitas e 100 ul de PBS eram adicionados à câmara de filtro. Depois de 30 min e /ou 1 h de incubação a 37 ° C, 10 ul amostras foram recolhidas a partir da câmara do filtro para a contagem de parasitas.
Citometria de fluxo e ensaios de imunofluorescência indirecta
tripomastigotas metacíclicos vivos (1 × 10 7 ) foram incubadas em gelo durante 1 h com anticorpo monoclonal 1G7 ou 3 F6, dirigidos, respectivamente, a molécula especifica para a fase metacíclica superfície gp82 ou gp90. Depois disso, os parasitas foram fixadas com 4% de paraf ormaldeido durante 20 min. Após lavagens em PBS, os parasitas foram incubadas com Alexa Fluor 488 conjugado com anti-IgG durante 1 h à temperatura ambiente e o número de parasitas fluorescentes foi estimada com um BD AccuriTM C6 citómetro de fluxo. parasitas de controlo foram incubadas com o anticorpo secundário única. Para visualizar os lisossomas de células HeLa, lamelas com as células aderentes foram incubadas durante 1 h a 37 ° C em D10 ou em PBS ++, ou foram incubados com parasitas em D10 durante 1 h. Após fixação com 4% de p-formaldeído em PBS durante 30 min, as células foram tratadas com 50 mM de NH 4Cl em PBS durante 30 min e lavadas em PBS. As células foram então incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com LAMP2 rato anti-humano diluído de 1: 8 (v /v) numa solução de PBS contendo 0,15% de gelatina, 0,1% de azida de sódio e 1% de saponina (PGN-saponina). Após lavagens em PBS, as lamelas foram incubadas durante 1 h com Alexa Fluor 568 conjugado com anti-rato IgG (Invitrogen), diluído 1: 300 em PGN-saponina contendo 500 ng /ml de faloidina-FITC e 10 ug /m DAPI (4 ', 6'-di-hidrocloreto de 1-diamino-2-fenilindole), seguido por lavagens em PBS e subsequente montagem de lamelas em Prolongar ouro (Invitrogen). imagens confocais foram adquiridos em uma Leica TCS SP8 microscópio de varredura a laser (Leica, Alemanha) usando uma imersão em óleo objectivo Plan-Apochromat 63X (abertura numérica 1.4). A série de imagens obtidas a partir de z-pilhas confocal foram processados ​​e analisados ​​utilizando Leica LAS AF (Leica, 2012, Alemanha) e software Imaris (Bitplane).
Preparação de parasita meio condicionado
formas metacíclicos (10 8) foram incubadas a 37 ° C durante 1 h em 100 ul de meio completo D10, nutriente PBS-privados ++ ou PBS. Após centrifugação, o sedimento foi descartado e o sobrenadante (meio condicionado) foi recolhido. Para utilização em ensaios de invasão de células do meio condicionado foi diluído 1: 100 em PBS ou D10 ++ e por Western blot 10 ul foi carregado
Produção e purificação de proteína recombinante gp82
A proteína recombinante contendo a. de comprimento completo T. cruzi
sequência de gp82 (GenBank TM base de dados, número de acesso L14824) em grelha com glutationa S-transferase (GST), foi produzido em E. coli DH5-α
e purificado como detalhados em outros lugares [23].
análise estatística
teste t
do aluno, como implementado no software GraphPad (versão 6.01), foi empregada.

resultados da infecção oral de ratos com T. cruzi
formas metacíclicas
a capacidade de parasitas TCI para infectar ratos por via oral foi examinada em um conjunto de experimentos. Quarenta ratinhos foram divididos em 8 grupos de cinco animais. Em uma série de experiências, com o objetivo de verificar a invasão do epitélio gástrico por tripomastigotas metacíclicos, 4 grupos foram utilizados e cada grupo de cinco ratos recebeu uma cepa do parasita diferente (5 × 10 7 parasitas por animal). Quatro dias após a administração oral, o estômago de ratos foi recolhido e processado para preparações histológicas. Um elevado número de parasitas foi usada neste caso porque em estudos anteriores com estirpe TcI G, do ciclo de transmissão selvagem, que tinha verificado que, mesmo com um elevado inoculo muito poucos ninhos de amastigotas, que correspondem a intracelularmente amastigotas replicantes, eram detectáveis ​​a 4 dia após a infecção oral. Apesar do grande inóculo, não foi possível detectar ninhos de amastigotas por análise microscópica de cortes histológicos do estômago (Tabela 1). Um outro conjunto de experimentos foi realizada para determinar se havia alguma diferença no tropismo tecido entre T. cruzi
estirpes. Para esse efeito, os restantes 4 foram utilizados grupos e cada grupo de cinco ratinhos receberam uma estirpe de parasita diferente (1 × 10 6 parasitas por animal) e o curso da infecção foi seguido durante 30 dias. Começando no dia 10, os níveis de parasitemia foram monitorados duas vezes por semana, e no dia 30 o estômago, coração e fígado foram colhidos para análise histológica. Neste caso, o inoculo foi menor porque fundamentado que, após vários ciclos de invasão celular e replicação intracelular, ninhos de amastigotas seria detectável. A parasitemia não era detectável em todo o período de observação, mas foi confirmada a infecção em todos os grupos por detecção de ninhos de amastigotas no estômago e /ou no coração de ratos (Tabela 1), mas não no fígado. Destaca-se que, no estômago de ratinhos infectados com a estirpe 1522, que derivada de um paciente de Chagas crónica com insuficiência cardíaca de fase terminal [24], os parasitas foram encontrados no coração, mas não no estômago ao passo que o oposto aplicado à infecção pela estirpe 28 (Tabela 1). ninhos de amastigotas estavam presentes em números elevados no estômago de alguns ratinhos infectados com a estirpe 28 ou 588 (Tabela 1), presumivelmente resultante a partir de múltiplas rondas de invasão e replicação intracelular do epitélio gástrico. O facto de que os parasitas não foram detectados no estômago do rato em quatro dias após a administração oral, mas apenas em um ponto de tempo mais tarde, após os ciclos de replicação intracelular, sugeriu qualquer uma migração ineficiente de formas metacíclicas através da camada de muco, invasão ineficiente das células epiteliais alvo e /ou intracelular multiplicação do parasita. Em adição às estirpes de TCI, examinámos uma estirpe TCIV, 1434, derivado de um doente infectado por via oral. ninhos de amastigotas, em pequenas quantidades, foram detectados em 3 ratinhos a 4 dias pós-infecção nas secções histológicas do estômago, mas não foram encontrados parasitas no estômago ou no coração 30 dias após a infecção (Tabela 1). A parasitemia foi negativo durante todo o curso da infecção de 30 dias. hemocultura positiva confirmada a infecção por todas as estirpes. Preparações histológicas também foram examinados para a presença de processos inflamatórios. Independentemente da cepa do parasita, focos inflamatórios eram dificilmente detectável no estômago no dia 4 ou 30 pós-infecção, ou no coração no dia 30.Table 1 infecção oral de ratos com formas metacíclicas de T. cruzi
strainsa
T. cruzi
estirpe
(origem)
mouse
amastigotas ninhos (número de secções de tecido)
estômago (dia 4)

estômago (dia 30)
coração (dia 30)
28
(Brasil Amazon)
1

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