características clínicas e papéis prognósticos de mutações KRAS, BRAF, PIK3CA e as ARN no cancro gástrico avançado

características clínicas e papéis prognósticos de mutações KRAS, BRAF, PIK3CA e as ARN no cancro gástrico avançado da arte abstracta
Fundo
RAS-RAF-MEK-ERK e PI3K-AKT formam uma cascata significativa para o potencial da terapia alvo molecular em cancro avançado. O significado clínico de mutações nestes genes no cancro gástrico avançado (AGC) é incerto.
Métodos
Nós recolhidos formalina-fixo, amostras de tumores congelados embebidos em parafina e frescos de pacientes AGC e analisaram o KRAS, ARN, BRAF Comprar e PIK3CA
mutações por direct-sequenciação. Nós investigados retrospectivamente as características clínico-patológicas dessas mutações em pacientes AGC e pacientes selecionados com câncer gástrico metastático.
Resultados
Entre 167 pacientes AGC, mutações do KRAS
códons 12/13 (N = 8
/164, 4,9%), PIK3CA
(N
= 9/163, 5,5%), e as ARN
códon 12/13 (N
= 3/159, 1,9%) foram detectados. Comparação das características clinicopatológicas dos KRAS, PIK3CA, as ARN
genes mutantes com um tipo all-selvagem destes genes mostrou que a frequência do tipo intestinal foi significativamente maior em pacientes cujo tecido tumoral contido KRAS
mutações (P
= 0,014). Entre 125 pacientes com câncer gástrico metastático, os pacientes com as ARN
códon 12/13 mutações em seus tumores tinham sobrevida global mais curto em comparação com as ARN
pacientes do tipo selvagem (MST: 14,7 vs 8,8 meses, P = 0,011
). Por análises multivariadas, as ARN
códon 12/13 mutação foi um indicador de mau prognóstico em pacientes com câncer gástrico metastático (HR ajustado 5,607, 95% CI: 1,637-19,203).
Conclusões
Nosso estudo indicou que mutações do KRAS, PIK3CA
e as ARN
eram raros na AGC. De ARN
mutações eram propensos a associar-se com mau prognóstico no estado metastático de pacientes AGC, mas é necessária uma validação adicional de outras pesquisas.
Fundo
O câncer gástrico é a segunda principal causa de morte por câncer em todo o mundo, com aproximadamente 989.600 novos casos e 738,000 mortes por ano, representando cerca de 8 por cento dos novos cancros [1]. As taxas de incidência mais elevadas são na Ásia Oriental, as regiões andinas da América do Sul e Europa Oriental, enquanto as taxas mais baixas estão na América do Norte, Europa do Norte, ea maioria dos países da África e do Sudeste Asiático.
Devido ao desenvolvimento de sistémica quimioterapia, o tempo de sobrevivência para o câncer gástrico avançado (AGC) foi melhorado na última década. Um regime de fluoropirimidina e platina é um padrão de quimioterapia de primeira linha em pacientes HER2-negativos cancro gástrico metastático (MGC), e trastuzumab adicionado a XP é um padrão de quimioterapia em doentes MGC HER2-positivos no Japão [2-5]. Embora alguns pacientes AGC obtido benefício clínico de quimioterapia sistémica, a maioria dos pacientes não atingir um resultado clinicamente satisfatória. foi necessário um tratamento Novel de MGC com regimes mais eficazes e menos tóxicos da quimioterapia.
Fase III de ensaios de terapia molecular com inibidor de mTOR, anticorpo anti-VEGF, anticorpos anti-EGFR foi relatada em AGC ou cancro gastro-esofágico, mas estas drogas não pode ser demonstrada a eficácia significativa [6, 7]. Recentemente, ramcirumab, anticorpo monoclonal anti-alvo VEGFR, foi relatado para melhorar a sobrevivência em pacientes de quimioterapia MGC-refractário. Seria uma vantagem terapêutica significativa para identificar biomarcadores eficazes, a fim de coincidir com as células cancerosas sensíveis com o f ãrmaco alvo molecular apropriado e elucidar os mecanismos associados com a resistência à quimioterapia.
A proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK) é parte de uma via de sinal intracelular importante que regula diversas funções celulares, incluindo a proliferação celular, a regulação do ciclo celular, sobrevivência celular, angiogénese, e a migração celular [8]. As proteínas Ras foram inicialmente identificados como os componentes de transformação de vírus oncogénicos, enquanto as ARN
foi identificado como o componente de transformação de um neuroblastoma. ras são encontrados em até 30% de todos os cancros e são particularmente comuns em cânceres de pâncreas e cólon. Raf é recrutada para a membrana celular através da ligação a Ras é activada e em um processo complexo que envolve a fosforilação e vários cof actores. BRAF
mutações têm uma distribuição estreita, mas são prevalentes em algumas malignidades específicas, tais como melanoma, câncer de tireóide papilar, e de ovário de baixo grau [9-11]. A importância da fosfoinositida 3-quinase (PI3K) no cancro foi confirmado pela descoberta de que o gene PIK3CA
, que codifica para a subunidade catalítica de PI3K p110α, é frequentemente mutado em alguns dos tumores humanos mais comuns [12]. Estas alterações genéticas de PIK3CA
compostas exclusivamente por mutações missense somáticas agrupadas em dois "hotspot" regiões em exons 9 e 20, correspondentes aos domínios helicoidais e quinase de p110α, respectivamente [13].
Recentemente, o uso de KRAS
, BRAF
, PIK3CA
e as ARN
como biomarcadores para a terapia alvo molecular em tumores sólidos tem sido amplamente discutida. Vários biomarcador pequena escala análises de KRAS
, BRAF Comprar e PIK3CA
mutações foram relatados anteriormente em AGC [14-16]. O significado clínico destas mutações em pacientes com AGC já não está esclarecida, e novas investigações dessas alterações moleculares intracelulares são obrigatórios.
No presente estudo, foi realizada uma análise genômica de KRAS
, BRAF
, PIK3CA
e as ARN
mutações a fim de investigar as características clínicas e papel prognóstico de mutações genéticas em pacientes AGC.
Métodos
pacientes e colheita de amostras
Todos os dados foram extraídos do banco de dados de nossa departamento, e carta de revisão foi feito para cada paciente, a fim de obter informações importantes. Foram coletadas amostras de tecido para análise do estado de mutação de gene de KRAS, BRAF, PIK3CA
e as ARN
. As amostras de tecido consistiu em amostras utilizadas na pesquisa anterior biomarcador em nossa instituição [2, 17] e de amostras de tecido fresco congelado, que foram obtidos a partir de ressecções cirúrgicas anteriores do AGC em nossa instituição. amostras de tecido tumoral de 173 pacientes AGC estavam reunidos, mas amostras insuficientes, em 6 pacientes foram excluídos. Por fim, utilizou-se 167 amostras de tecido de pacientes AGC e investigou mutações no gene KRAS de
, BRAF
, PIK3CA
e as ARN
pelo método de sequenciação directa (coorte inteira). Entre 167 pacientes AGC, 42 pacientes foram submetidos à ressecção cirúrgica sem quimioterapia sistémica (coorte não metastático como grupo A) e 125 pacientes com câncer gástrico metastático receberam quimioterapia sistémica (coorte metastático como o grupo B). Um diagrama do presente estudo é mostrado na Figura 1. O consentimento informado do uso de tecidos tumorais do paciente foi confirmada de todos os pacientes que participaram do estudo, que foi realizado com a aprovação da Institutional Ethical Review Board do Centro Nacional do Câncer, em conformidade com a declaração de Helsínquia, de 1975 (revista em 1983). Figura 1 Diagrama deste estudo.
Genomic análises de KRAS, BRAF, PIK3CA e as ARN
amostras de DNA foram extraídos, cortes de tecido de tumor fixados em formol-embebidos em parafina (FFPE) e frescos congelados. áreas ricas em células de tumor na secção de hematoxilina e eosina foram marcados sob um microscópio, e foi riscada tecido a partir da área de outra secção não corado desparafinizados. ADN a partir de pedaços da amostra de tecido riscado foi isolado utilizando o Kit de tecidos FFPE QIAamp DNA (QIAGEN KK, Tóquio, Japão). O exão 2 (codão 12, 13), exão 3 (codão 61), exão 4 (codão 146) do gene KRAS
e o exão 15 (codão 600) de BRAF
gene e o exão 9 (codão 542, 545) , exão 20 (codão de 1047) de PIK3CA gene
e o exão 2 (codão 12, 13), o exão 3 (codão 61) do gene de ARN
foram amplificadas por PCR (o termociclador GeneAmp PCR System 9700). Os produtos de PCR foram visualizados por electroforese em gel de agarose com brometo de etídio e directamente sequenciado utilizando um ABI 3130X /Genetic Analyzer (Life Technologies Japão (Applied Biosystems), Tóquio, Japão) de acordo com as instruções do fabricante.
Tratamento Um
total de 125 pacientes do grupo B recebeu quimioterapia sistémica. Regimes de quimioterapia de primeira linha consistia de PB (n = 42, 33,6%), S-1 (n = 39, 31,2%), 5-FU (n = 10, 24,0%), uma combinação de 5-FU e metotrexato (n = 10, 8,0%), o paclitaxel (n = 3, 2,4%) e PE e /ou bevacizumab (n = 1, 0,8%). Principais drogas anti-cancro no Japão para AGC são fluoropirimidina (5-FU, S-1, a capecitabina), cisplatina, irinotecano e taxano. Durante todo o ciclo de quimioterapia sistémica, no grupo B, as proporções de doentes a receber 5-FU, cisplatina, irinotecano e taxano eram 85,6% (n = 107/125), 52,8% (n = 66/125), 60,8% (n = 76/125), 36,0% (n = 45/125), respectivamente. Além disso, 22 pacientes (17,6%) receberam todas as principais drogas anti-câncer, 37 pacientes (29,6%) receberam 3 dos medicamentos essenciais, 30 pacientes (24,0%) receberam 2 dos medicamentos essenciais, e 36 pacientes (28,8%) recebeu apenas uma das principais drogas anti-cancro. Os horários e doses de CP, S-1 e 5-FU foram baseados nos relatórios anteriores [17]. O paclitaxel em monoterapia, foi repetido três vezes por semana durante 4 semanas e o docetaxel em monoterapia, foi administrada por infusão intravenosa analisa uma vez a cada 3 semanas.

Estatística Avaliou-se a proporção de cada
KRAS, BRAF
, PIK3CA
e as ARN
mutação no coorte inteiro e os valores prognósticos destas mutações, que foram ajustados variáveis ​​de características dos doentes em termos de sobrevida global (oS) no grupo B. metastático oS foi definido como o intervalo entre o início de quimioterapia de primeira linha até a morte ou o último acompanhamento.
Foram realizadas análises estatísticas pelo software estatístico SPSS versão 19 (IBM, Tóquio, Japão). As diferenças na distribuição das variáveis ​​foram avaliadas por meio do teste exato de Fisher ou teste do qui-quadrado, conforme o caso. tempo médio de sobrevivência (MST) foi estimada pelo método e sobrevivência curvas de Kaplan-Meier foram comparadas pelo teste de log-rank. Todos os testes foram em frente e verso e um valor de p < 0,05 foi definido como estatisticamente significativo. Nós estimamos taxa de risco (HR) e do correspondente intervalo de confiança de 95% (CI) para OS usando univariada e multivariada pelos modelos proporção de risco de Cox. Variáveis ​​nesta análise foram: idade (≥median /< mediana), gênero (masculino /feminino), ECOG PS (0 /1-2), tipo histológico da classificação Lauren (tipo intestinal /tipo difuso), número de sítios metastáticos ( resultados individuais /múltipla).
sequenciação directa de amostras de tecido no grupo B determinaram a proporção de cada um KRAS
, BRAF
, PIK3CA
e as ARN
(Tabela 1). As mutações de KRAS
codão 12 (3,7%, n = 6/164) e KRAS
codão 13 (1,2%, n = 2/164), PIK3CA
exão 9 (4,9%, n = 8 /163), PIK3CA
exão 20 (0,6%, n = 1/163) e as ARN
mutações (1,9%, n = 3/159) foram detectados. Por outro lado, mutações no KRAS
códon 61, KRAS
códon 146, BRAF V600E
, e as ARN
códon 146 não foram detectados. KRAS
codão 12 mutações consistiu de G12D (35G > A, n = 4), G12S (34G > A; n = 1) e G12N (34 35GG > AA; n = 1), e o codão 13 mutações consistiu de G13S (37G > A; n = 1) e G13V (38 39GC > TT; n = 1). PIK3CA
exão 9 mutações consistiu de E542K (1624G > A; n = 2), E545K (1633G > A; n = 5), e E545D (1635G > C; n = 1), e o exão 20 mutações consistiu em H1047R (3140A > G; n = 1). De ARN
mutações consistiu de G12S (34G > A; n = 1) e G13S (37G > A; n = 1). Havia 70 pacientes cujo tecido tumoral contido tipos todo-selvagens de KRAS
(exon2, 3, 4), BRAF
(exão 15), PIK3CA
(exon9, 20) e as ARN
(exon2 , 3). Entre os pacientes AGC cujo tumor de tecido continha mutações genéticas, várias mutações do KRAS
códon 13, PIK3CA
códon 545 e as ARN
códon 12 foram detectados em apenas uma case.Table 1 Resultados de mutações no gene de KRAS, BRAF, PIK3CA e as ARN em pacientes AGC
As mutações genéticas
Proporção (%)
amostras de DNA insuficientes
KRAS códon 12
6/164 (3,7)
3/167
KRAS códon 13
2/164 (1,2)
3/167
KRAS códon 61
0/131 (0,0)
36/167
KRAS códon 146
0/137 (0,0)
30/167
BRAF V600E
0/136 (0,0)
31/167
PIK3CA exon 9
8 /163 (4,9)
4/167
PIK3CA exão 20
1/163 (0,6)
4/167
ARN códon 12
1/159 (0,6)
8 /167
ARN códon 13
2/159 (1,3)
8/167
ARN códon 61
0/135 (0,0)
32/167
As características clinicopatológicas de cada mutação genética em comparação com o tipo all-selvagem estão resumidos na Tabela 2. a idade média dos pacientes cujo tecido tumoral continha mutações do KRAS
, PIK3CA
e as ARN
(54,5, 58,0 e 56,0 anos, respectivamente) foram menores do que os pacientes que contenham tipos de todo-selvagens de KRAS, BRAF, PIK3CA
e as ARN
(idade média, 64,0 anos).
não houve diferença significativa, exceto para tipo histológico, entre variáveis ​​de características clinicopatológicas, tais como sexo, idade, PS ECOG e os números de sítios metastáticos. Em comparação com os pacientes do tipo all-selvagens, as proporções de tipo intestinal foram maiores nos pacientes com KRAS
códon 12/13 mutação (p = 0,014). O tipo histológico do tumor em todos os pacientes cujo tecido tumoral contido de ARN
mutações era do tipo difuso de adenocarcinoma.Table 2 Comparação de recursos clinocopathological por status mutações genéticas em comparação com todos os tipo selvagem em pacientes com pacientes AGC
All-tipo selvagem
KRAS
códon 12/13
PIK3CA
exão 9/20
ARN
codon12 /13

KRAS, BRAF, ARN, PIK3CA
tipo mutante
P
-valor
tipo mutante
P viajantes - valor
tipo mutante
P
-valor
Número de pacientes
70
8
9 Sims 3
Median idade
64,0
54,5
58,0
56,0
Sexo (%)
Masculino
49 (70,0)
7 (87,5)
0,429
8 (88,9)
0,432 Página 2 (87,5)
1.000
Feminino
21 (30,0)
1 (12,5)
1 (11,1)
1 (12,5)
ECOG PS (%)
0
38 (54,3) Sims 3 (37,5)
0,466
4 (44,4)
0,727
1 (33,3)
0,476
1 ≦
32 (45,7)
5 (62,5)
5 (55,6)
2 (66,7)
tipo histológico (%)
intestinal tipo
20 (28,6)
6 (75,0)
0,014
4 (44,4)
0,443
0 (0,0)
0,556 tipo
difusa
50 (71,4) Página 2 (25,0)
5 (55,6) Sims 3 (100,0)
No. do sítio metastático (%)
1

• úlceras gástricas e duodenais superiores baixa dose associado à aspirina em pacientes japoneses sem história prévia de úlceras pépticas
• níveis do gene survivin no sangue periférico de pacientes com câncer gástrico prever de forma independente os níveis do gene survivin survival