Протеомный изменения в желудочной аденокарциномы от японских пациентов

Протеомный изменения в желудочной аденокарциномы от японских пациентов
Аннотация
фон
Желудочные аденокарциномы представляют собой один из распространенных видов раковых заболеваний в азиатских странах, включая Японию. Всестороннее белок профилирование спаренных хирургических образцов первичных желудочных аденокарцином и nontumor слизистая, полученных из японских пациентов проводилось с помощью двумерного гель-электрофореза (2D-EP) и жидкостной хроматографии-электроспрея ионной тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС-ЭРИ) чтобы установить рак желудка специфические белки, как мнимых клинических биомаркеров и молекулярных мишеней для химиотерапии.
Результаты
Относительно общие изменения в экспрессии белка были обнаружены в тканях опухоли. наблюдались Увеличение марганца дисмутазы и негистоновых хромосомного белка HMG-1 (ГМГ-1), тогда как снижение углекислых anhydrases I и II, глутатион-S-трансферазы и foveolin предшественник (gastrokine-1) (FOV), желудка 18-кД -специфический белок с мнимым супрессора опухоли активностью, были обнаружены. ОТ-ПЦР анализ также показал значительную понижающую регуляцию экспрессии мРНК FOV в опухолевых тканях.
Заключение
Возможный патологическую роль для понижающей регуляции FOV в канцерогенез желудка была продемонстрирована. Оценка специфических уменьшается в экспрессии генов и белка FOV у пациентов могут быть использованы в качестве клинических биомаркеров для эффективной диагностики и оценки рака желудка.
Фон
Желудочные аденокарциномы включают в себя один из распространенных видов рака в азиатских странах, в том числе Япония, уступая только раку легких по числу смертельных случаев это вызывает. Несмотря на недавнее развитие диагностических методов, большинство больных раком желудка диагностируется на продвинутой стадии, и имеют очень низкий коэффициент выживаемости на пять лет (менее 10%) [1]. Это частично из-за отсутствия специфических и чувствительных биомаркеров для диагностики и мониторинга прогресса заболевания на ранней стадии, хотя некоторые желудочные опухолевые маркеры, включая карциноэмбриональному антиген, были использованы и частично эффективны. Поскольку желудочный канцерогенез является многоступенчатым процессом, комплексный анализ также необходим для отдельных случаев, в которых различные молекулярные события происходят в каждом канцерогенного процесса.
Недавно протеомики анализ был использован для изучения всесторонне экспрессии белка в жидкостях организма, тканей и клеток [ ,,,0],2-4]. Такой подход, как и клинической протеомики, очень полезно для выявления заболеваний ассоциированных белков, которые показывают изменения в экспрессии и модификации, соответствующие болезненного состояния [5, 6]. Эти заболевания, связанные с белками, как ожидается, будут биомаркеров для диагностики и предполагаемых целевых белков для лечения [7-9]. С другой стороны, всесторонний анализ Транскриптом в опухолевых тканей от различных онкологических больных с использованием ДНК-микрочипов и чипы генов были выполнены в последние годы [10]. Тем не менее, отсутствие корреляции между изменениями в мРНК и канцерогенеза было продемонстрировано, и количественные и качественные изменения посттрансляционно модифицированных белков в качестве конечных продуктов гена считаются более информативными, чем мРНК в опухолевых тканях для изучения молекулярных событий в канцерогенеза. Протеомные исследования для выявления опухолевых белков, ассоциированных с раком желудка в увеличиваются, и протеома базы данных для желудка тканей [11] и клеточных линий [12] были построены. Большинство из них касаются специфических белков или антигенов, которые отражают химио- и термостойкие свойства рака желудка [13-15], и которые связаны с Helicobactor пилори
[16, 17]. В настоящем исследовании мы провели всесторонний анализ протеома опухоли и nontumor тканей у японских пациентов с желудочных карцином, и идентифицированы несколько белков, из которых уровни экспрессии обычно изменены в клинических случаях. В частности, было предложено, чтобы быть как под транскрипционной и трансляционной контролируют экспрессию gastrokine-1 (GKN-1).

Результаты разделения белков и идентификации
фиг.1А показан обзор изображения типичного мастер-геля для желудка опухолевой ткани. Около 200 белковых пятен окрашивали кумасси бриллиантовым синим (СВВ) Р-250 были хорошо разделены в гелях. Пронумерованные пятна на рисунке 1В и 1С, вырезали из геля, обрабатывали трипсином и затем подвергают жидкостной хроматографии-электронный спрей ионизации тандемной масс-спектрометр (LC-ESI-МС /МС) анализа. Семьдесят два из них, представляющих 69 различных видов белка были идентифицированы. В таблице 1 перечислены все белки, идентифицированных с помощью пептидной согласования с алгоритмом поиска талисмана. Точность в белковом профилирования оценивали как значения суммы баллов (выше 37). Рисунок 1 (А) Обзор изображение геля мастер 2D для опухолевой ткани, полученной из пациента с аденокарциномой желудка. (В) и (С) Пронумерованные пятна белка были идентифицированы с помощью LC-ESI-MS /MS и сопоставления белков, как показано в виде увеличенных фигур.
Таблица 1 Профиль Протеин обнаружен в опухолевой ткани, полученной из японского пациента с желудочным аденокарциномы.
пятно No.

номер Присоединение

идентификации белков
<бр> Масс

SC (%)

ИЭТ

оценка

1
24308169
axonemal тяжелой цепи динеин тип 3
473776
0
6,04
37 страница 2 15010550
белок теплового шока gp96 предшественник
90309
7
4,73
62 страница 3 из 72222
белка теплового шока 90 -β
83584
14
4,97
176 4
5729877
теплового шока 70 кДа белка 8 изоформы 1
71082
19
5,37
283 страница 5 38044288
gelsolin изоформы б
80876 страница 5 из 5,58
63
6
4826960
глутаминил-тРНК синтетазы <бр> 88655
1
6,71
44
7
4501867
аконитазы 2
86113
10
7.36
231
8
119717
ezrin
69470
7
5.94
75
9
4557871
transferrin
79280
9
6.81
97
10
16507237
heat шок 70 кДа белка 5
72402
15
5,07
165
11
24234686
белка теплового шока 70 кДа белок 8
53598
16
5,62
160
12
4885431
теплового шока 70 кДа белок 1B
70267
11
5,48
143
13
1082886
опухоли некроза типа фактор 1 рецептор-ассоциированный белок TRAP-1
75694
13
8,43
288
14
31542947
шаперонина, митохондриях белка P1, P60 лимфоцитами белка <бр> 61187
13
5,7
299
15
28592
сыворотки albumin
71316
23
6.05
292
16
340219
vimentin
53738
18
5.03
79
17
4503729
similar к FK506-связывающего белка 4
49031
5
5.6
36
18
32709
IFP53
53559
21
5.93
277
19
4502643
chaperonin-containing TCP1, subunit6A (дзета-1)
58444
6
6,23
79
20
7106439
тубулина, β5
50095
14
4.78
125
21
37492
α-tubulin
50810
13
5.02
94
22
125604
pyruvate киназа, М2 isozyme
58447
5
7.95
234
23
4557014
catalase
59947
6
6.9
120
24
4503483
eukaryotic перевод фактор элонгации 2
96246 4
6,41
56
25
179279
АТФ-синтазы β субъединиц
56861 страница 5 из 5,39
59
26
7657041
вниз регулируется в метастазирования
320846 страница 2 7,07
40
27
4504169
глутатион синтетазы, GSH synthetase
52523
5
5.67
99
28
12017952
GE36
73327
2
5.2
37
29
34234
laminin-binding Белок
31888
12
4,84
51
30
16359158
актина, бета
42078
14
5,29
171
31
6635125
KIAA0284 белок
161473 страница 2 6,36
47
32
5803225
14-3-3 эпсилон
29326
8
4,63
49
33
4504707
инозитол полифосфатов 4-фосфатазы, тип II, 105 кД
105749
1
5,87
37 <бр> 34
35038601
гипотетический белок DKFZp761A078
74864
2
7.27
47
35
12017952
GE36
73327
1
5.2
38
36
4505877
plectin 1 изоформы 1
520111
1
5,57
44
37
38158018
центросомных белок 1, ассоциированный белок центриоля, centriolin
269874
1
5,44
39
38
30157438
СТД-связывающий SR-подобный белок RA9
180240
1
9.15
41
39
4503471
эукариотической перевод фактор элонгации 1 α1
50451
12
9.1
191
40
4757810
АТФ-синтазы
59828
17
9,16 <бр> 178
41
693933
2-phosphopyruvate-гидратаза α-энолаза
47421
22
7,01
240
42
123576
47 кДа предшественник белок теплового шока
46352
14
8,27
177
43
5032069
сплайсинга фактор 3b, субъединиц 4
44414 страница 3 8,54
58
44
4503471
эукариотических элонгации трансляции фактор 1 α1
50451 4
9.1
47
45
5921789
цитрат-синтазы, митохондриальная предшественник
51959
12
8,13
114
46
4505763
фосфоглицераткиназы 1
44985
14
8.3
87 <бр> 47
4504069
аспартатаминотрансферазы 2-предшественник
47844
6
9,14
52
48
7669492
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
36201
13
8,57
49
49
4757756
аннексина A2
38808
9
7,57
87
50
6648067
малатдегидрогеназа, митохондриальная предшественник
35965
7
8,92
60
51
5031857
лактатдегидрогеназы
36950
6
8,44
43
52
238427
порин 31 HM
30737
29
8,63
124
53
5174447
гуаниновый нуклеотид-связывающий белок
35511
8
7.6
65
54
34740329
гетерогенная ядерная рибонуклеопротеиновый A3
39799
7
9.1
43
55
4504983
galectin-3
26229
12
8.58
42
56
4504447
heterogeneous ядерная рибонуклеопротеиновый A2 /B1 изоформы A2
36041
7
8,67
40
57
86901
АТФ-зависимая ДНК хеликаза RAP30 /74 цепи RAP30
26350 <бр> 3
9,46
41
58
230445
карбоангидразы I
28903
12
6,44
67
59
455739 <бр> карбоангидразы II
29285
8
6,87
82
60
26892090
бета-глобина цепи вариант
16101
40
7,86 <бр> 121
61
34709
марганцевой супероксиддисмутазы
24891
10
8,35
111
62
4507645
triosephosphate изомеразы 1
26938
17
6,45
47
63
38488935
foveolin предшественник
20546
16
5,65
95
64
478813
негистоновых хромосомных белков HMG-1
25139
13
5,41
60
65
2204207
глутатион S-transferase
23595
34
5.43
73
66
178755
proapolipoprotein
28944
8
5.45
103
67
37267
transketolase
68435
4
7.9
59
68
189998
M2-type пируваткиназа
58447
10
7,95
157
69
825605
глутатион S-трансферазы
25650
10
8,51
65
Эти белки могут быть разделены на несколько категорий в зависимости от их функций, в том числе цитоскелета белков, связанных со стрессом и chaperoning белков, белков острой фазы, гликолитических ферментов, ферментов, участвующих в обмене веществ и пролиферации клеток, опухолевых супрессоров белков и желудка специфических белков .
Общие изменения экспрессии белка между опухолью и nontumor тканей у больных раком желудка
Diverse изменений в протеомов были обнаружены между опухолью и nontumor тканей из одних и тех же пациентов. Как показано на рисунке 2, были обнаружены среди пяти японских больных раком желудка (Случаи А до Е) несколько общих изменений. Марганец супероксиддисмутазы (MnSOD), негистоновых хромосомный белок ГМГ-1 (ГМГ-1), фосфоглицераткиназа 1 (ПГК-1), карбоангидразы I и II (СА I и II) foveolin предшественник FOV (gastrokine-1), аспартат аминотрансферазы 2-предшественник (АСТ), и глутатион-S-трансферазы (GST), выставлены общие изменения в экспрессии между опухолевыми и nontumor тканей, в том числе среди идентифицированных белков. Выражение белка MnSOD и HMG-1 как было показано, повышающей регуляции в опухолевых тканях по сравнению с в nontumor тканях. С другой стороны, СА I И II, FOV, АСТ и GST белки были выявлены быть понижающей регуляции в опухолевых тканях. В кратные изменения в экспрессии этих белков по отношению к количеству GAPDH суммированы в таблице 2. Наиболее заметное снижение было показано на уровне FOV во всех случаях. Степень снижения экспрессии белка GST была почти такой же, что и в FOV (случаи В, D и Е), хотя не наблюдалось в двух других случаях. С другой стороны, увеличение HMG-1 было отмечено в трех случаях (A, C, и D), хотя такое различие в экспрессии не наблюдалось в двух других случаях. MnSOD проявляли тенденцию к увеличению в опухолевых тканях трех пациентов (случаи A, C, и D), а относительное снижение также наблюдалось по делу В. Что касается ПГК-1, значительная взаимосвязь между складчатых изменения в экспрессии белка и патологическое градацию опухолей почти не наблюдалось. Рисунок 2 Подробные модели переделки белков. (А) Nontumor и (В) опухолевые белки, включая CAI (No.58), CaII (No.59), MnSOD (№ 61), FOV (№ 63), HMG-1 (№ 64), и GST (No.65). (С) Nontumor и (D), опухолевые белки, включая PGK-1 (№ 46), АСТ (№ 47), и GST (No.69). GAPDH, в кружке, был использован в качестве эталонного белка.
Таблица 2 раскладные изменения в экспрессии белка между nontumor и опухолевых тканей, полученных из пяти пациентов с желудочной аденокарциномой.
<СОР> <СОР> <СОР> <СОР> Белок

Случай A

Случай B

Случай C

Случай D

Case E

CA I
-6,5
-1,6
-3,3
-4,3 -2,6

CA II
-2.6
-1.3
-26
-4.3
-13
FOV
-13
-13
-26
*
-26
MnSOD
+1.7
-2.6
+6.5
+1.4
+1.1
HMG-1
+13
*
+3.7
+13
*
PGK1
+1.6
+1.1
-1.2
+2.6
-1.4
AST
-13
-1.6
-6.5
-3.7
-2.6
GST
*
-26
*
-13
-13
CA I, карбоангидразы I.
CA II, карбоангидразы II.
FOV, foveolin предшественника.
MnSOD, марганец супероксиддисмутазы.
ГМГ-1, негистоновых хромосомный белок.
PGK1, фосфоглицераткиназы 1.
АСТ, аспартатаминотрансферазы 2-предшественник.
GST, глутатион S-трансферазы.
*, не определено.
анализ ОТ-ПЦР Ру по ОТ-ПЦР, изменения в мРНК выражение в опухоли и nontumor тканей, полученных от больных раком желудка, анализировали на белки, которые выставляются изменения в экспрессии белка, в том числе FOV, MnSOD и HMG-1. Как показано на рисунке 3, FOV мРНК значительно уменьшилась в опухолевых тканях в четырех у всех больных (случаи А, В, С и Е), в то время как оно не было обнаружено ни nontumor или опухолевых тканей у другого пациента (Случай D) , С другой стороны, MnSOD мРНК значительно увеличивалась у четырех пациентов (случаи B, C, D, и Е), хотя небольшая разница в уровне мРНК между nontumor и опухолевых тканей в случае, если обнаружено. Тем не менее, почти не наблюдалось взаимосвязь между экспрессии мРНК ГМГ-1 и патологических фенотипов опухолей. Рисунок 3 Сравнение экспрессии мРНК белков, возможно, связано с канцерогенеза между nontumor и опухолевых тканей, полученных из пяти пациентов с желудочной аденокарциномы (случаи от А до Е), с помощью ОТ-ПЦР. N и Т указывают на nontumor и опухолевых тканей, соответственно.
Обсуждение
В данном исследовании мы провели анализ Протеомические опухоли и nontumor тканей, полученных от японских пациентов аденокарциномы желудка. Шестьдесят девять различных белков в опухолевой ткани из желудка случае рака были идентифицированы с помощью 2D-EP и LC-ESI-MS /MS, который включал стресс-белки, Hsp70, Hsp90 и chaperonine содержащих TCP1 (ССТ), для самозащиты; ферменты гликолиза, триозофосфатизомеразу 1, α-энолаза и ПГК-1, для потребности растущей энергии; белки цитоскелета, Эзрин, gelsolin изоформы б и виментин; белков, участвующих в дифференцировке и пролиферации клеток, Галектин-3 и трансферрина; и белки, экспонирование предполагаемую активность подавителя опухоли, FOV. Многие из этих белков, как сообщается, связаны с онкогенеза желудка аденокарциномы с участием нескольких шагов и факторов [18, 19].
Мы также показали, что уровни экспрессии некоторых белков в опухолевых тканях обычно изменяются в пяти японских пациентов с желудочной аденокарциномы, по сравнению с теми, в nontumor тканях. Общее увеличение экспрессии белка в опухолевых тканях произошло для MnSOD, HMG-1 и ПГК-1, в то время как общее снижение в опухолевых тканях произошло для FOV, GST и АСТ
супероксид (O <суб> 2 . - ), свободный радикал, имеет важное значение для антимикробного действия гранулоцитов и моноцитов. Супероксиддисмутазы (СОД) быстро снимает избыточное количество супероксида, произведенных в стресс и биологических реакций в естественных условиях
путем катализа конверсии супероксида с Н + Н <к югу> 2О <суб> 2 и О <к югу> 2. MnSOD, один из дерна, находится в митохондриях и способствует защите митохондриальной ДНК от повреждений. Сообщалось, что усиленную экспрессию MnSOD в прогрессивном рака желудка должна быть связана с выживаемостью 5 лет после операции [20] и чувствительности к химиотерапии [21]. В этом исследовании, экспрессия белка MnSOD была повышающей регуляции у 4 из 5 больных раком желудка, что указывает на самозащиту ответ. С другой стороны, повышающая регуляция MnSOD в опухолевых тканях было рассмотрено, чтобы мешать эффективной химиотерапии основан на радикальной продукции, что может привести к снижению чувствительности к противоопухолевых препаратов и определить серьезность рака.
Ингибиторы HMG-1 регулирует транскрипцию различных генов и структурной стабилизации хромосом в качестве белка ДНК-связывающим. Ингибиторы HMG-1, как сообщается, связаны с канцерогенеза и метастазирования при колоректальном раке и раке молочной железы [22].
Транскрипционная повышающей регуляции HMG-1 при раке желудка была также продемонстрирована [23]. Экспрессия ГМГ-1 в опухолевых тканях было предложено быть связаны с устойчивостью к цисплатин [24]. Мы показали здесь увеличение этого белка в трех случаях.
GST является препарат метаболизировать фермент, который катализирует конъюгацию восстановленного глутатиона к лекарственным средствам и метаболитов, а также способствует детоксикации канцерогенов. Таким образом, снижение активности может быть фактором риска для канцерогенеза. Инфицирование Helicobacter Pylori, как сообщалось, вызывают уменьшение экспрессии GST [25], предполагая, что уменьшение GST активности может быть причиной рака желудка. В этом исследовании, наблюдалось снижение экспрессии белка GST в трех случаях. Снижение экспрессии белка GST может быть использовано в качестве биомаркера для диагностики опухолей желудка.
АСТ является аминотрансферазы, который действует на аминокислоты и α-кето-кислоты, который широко распространен в человеческих органах. АСТ высвобождается в кровоток из-за повышенной проницаемости и деструкции тканей. Повышенная концентрация белка АСТ сообщается в крови больных гепатитом, злокачественных опухолей, включая гепатомы и leuchemia. экспрессии генов GST также продемонстрировано, повышающей регуляции в тканях колоректальных опухолей [26]. Тем не менее, снижение экспрессии белка AST было обычно наблюдается во всех тканях опухолей, полученных из нынешних пяти пациентов с желудочной аденокарциномой. Дальнейшее исследование должно быть выполнено с целью выяснить, является ли уменьшение белка AST специфически наблюдается в желудочном опухолевых тканях или нет.
Повышенная экспрессия PGK-1, который является одним из ферментов в гликолиза и который катализирует дефосфорилирование 1,3-bisphosphoglycerate для производства АТФ, наблюдается во многих злокачественных опухолевых тканях, которые зависят от АТФ в качестве основного источника энергии. Солидные опухоли, как полагают, нуждаются в перепроизводство АТФ для поддержания усиленной пролиферации. Повышающая регуляция ферментов гликолиза, в том числе ПГК-1 при раке легких [27] и М2-типа пируваткиназы в колоректального рака [28], было сообщено, и предложил, чтобы быть полезным для скрининга рака. Тем не менее, в данном исследовании, была едва ли обнаружена значимая связь между экспрессией белка ПГК-1 и фенотипы желудка аденокарциномы. Поэтому ПГК-1 считался не подходит для диагностики рака желудка.
Углеродные anhydrases (КАС) являются цинк-содержащие ферменты, которые широко распространяются в различных органах и которые составляют большую семью, включая CA-I СА иш. Они катализируют гидратацию CO <подразделам> 2 для промежуточного обмена и поддержания рН и ионного равновесия в организме. До сих пор существует прямая связь была продемонстрирована между злокачественной трансформации и экспрессии белка для УЦ I через VII [29]. Два более ранние исследования показали, что экспрессия обоих CA-I и CA-II был значительно снижен в колоректальных опухолей по сравнению с нормальной ободочной эпителии или слизистыми оболочками [30]. В другом докладе представлены результаты, показывающие, что снижение экспрессии CA-I и CA-II коррелировала с биологической агрессивностью колоректального рака и синхронном отдаленных метастазов [31]. Как было предложено ранее [32], желудка и ободочной карциномы могут совместно использовать аналогичный механизм пролиферации клеток и слизистых оболочек злокачественности, и может стать биомаркером для этих карцином, так как также наблюдались общие снижение экспрессии белка CA-I и CA-II в данном исследовании.
FOV, который идентичен желудка специфических 18-кДа антрального слизистую оболочку белка! (AMP-18) [33, 34], GKN1 [35], а также фактор трилистника взаимодействия (г) (TFIZ) [36], было показано, что резко понижающей регуляции или отсутствует в желудочном больных аденокарциномы в этом исследовании. Человек АМР-18 и carcinoantigenic продукт гена CA11 человек, который кодирует аминокислотную последовательность, которая отличается от таковой AMP-18 только в одном остатке [37, 38], функцию в виде секретируемых факторов роста частично отвечает за поддержание нормального функционального желудка эпителий [33]. Оба АМР-18 и продукт гена CA11 Сообщалось, что интенсивно выражена в нормальной ткани желудка, но не в большинстве рака желудка [33, 37, 38]. Иммуногистохимических исследований показали, что АМР-18, кажется, присутствует в эпителиальных клетках слизистых оболочек нормального человеческого желудка антрального отдела и двенадцатиперстной кишки [33]. В последнее время было показано, TFIZ действовать в качестве регулятора роста эпителиальных клеток желудка путем образования гетеродимера с коэффициентом трилистника 1 (TFF1) [36]. Наши нынешние данные дополнительно подтвердили высокую экспрессию FOV в nontumor желудочных тканей и значительное подавление белка в желудочном adnocarcinomas, указывая, что FOV играют роль в поддержании нормальной дифференцировки эпителиальных клеток и супрессии опухолей, но не в опухолевых тканях. Кроме того, мы показали, что транскрипция мРНК FOV также обычно понижающей регуляции у больных раком желудка, что свидетельствует о том, что заметное снижение белка FOV было вызвано подавлением экспрессии генов FOV. Кроме того, у одного пациента, белок не был обнаружен в тканях nontumor, предполагая, что уровень экспрессии белка FOV у людей, может определить аденокарциномы желудка фенотип. Соответственно, уровень экспрессии FOV как биомаркер может быть информативным для оценки рака желудка.
Заключение
Protein профилирования опухоли и nontumor тканей, полученных от японских пациентов с желудочной аденокарциномы проводили с использованием 2D-EP и ЖХ ESI-МС /МС. Идентифицированные белки включены молекулярные шапероны, производящие энергию ферменты, белки цитоскелета, и так далее. Обычные изменения белка были обнаружены в больных раком желудка. Протеин экспрессия MnSOD и HMG-1 повышается, тогда как у GST, АСТ и FOV подавлялась в желудочном опухолевых тканях. Установлена ​​корреляция между изменением этих белков и их экспрессии транскрипционного при раке желудка почти не наблюдалось в этом исследовании, так как в случае FOV за исключением того. Оба экспрессии белка и ген FOV, желудка специфических секреторных фактор роста для нормальных эпителиальных клеток желудка, заметно подавляется в опухолевых тканях, полученных от японских пациентов с желудочной аденокарциномы. Мониторинг уровней экспрессии этого желудка конкретного белка в клинических образцах может дать полезную информацию для диагностики рака желудка в качестве специфического биомаркера и для лучшего понимания рака желудка.
Методы
материалы
ДНКазы I, РНКаза А, 2-меркаптоэтанол (2-ME), стеклянные бусы (212-300 мкм), Нонидет Р-40, акриламид, N, N, N ', N'
-tetramethylenediamine (TEMED), додецилсульфата натрия (ДСН ), йодацетамида и дитиотреитола (DTT) были приобретены у Sigma (St. Louis, MO). Агарозном для Изоэлектронный фокусировки (IEF), и фармалит ИЭТ 3-10, 4-6,5 и 8-10.5 были от Amersham Bioscience (Piscataway, NJ). Трипсин (секвенирование сорта) был от Roche (Manheim, Германия). Фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), тиомочевины, сорбитол, пирофосфат натрия, персульфат аммония, D, L-аспарагиновая кислота, трихлоруксусная кислота, дигидрат сульфосалициловой кислоты, уксусной кислоты, ацетонитрил, муравьиную кислоту и трифторуксусную кислоту (ТФК) были от компании Wako Pure Chemicals (Осака , Япония). Мочевина был из Катаяма химических веществ (Осака, Япония). Пепстатин А и леупептина были из Peptide института (Осака, Япония). NH <суб> 4HCO <суб> 3 и N, N'-метилен были из Nacalai Tesque (Киото, Япония). CBB R-250 был от ICN Biomedicals Inc. (Aurora, OH). Молекулярные стандарты были массовые от APRO Science, Inc. (Токусима, Япония). Тризол реагент от компании Life Technologies (Фредерик, MD). Олиго (дТ) 12-18 праймер, дезоксинуклеотиды (дНТФ), и RNaseOUT были от компании Invitrogen (Carlsbad, CA). M-MLV обратной транскриптазы и Taq ДНК-полимеразы из Promega (Madison, WI).
Тканей и подготовка проб
Первичные желудка аденокарциномы и прилегающих к ним nontumor слизистыми оболочками были собраны на гастрэктомии и при условии кафедра хирургии, Высшая школа медицины, университет Токусима, Токусима, Япония. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации, и был одобрен комитетом по этике Университета Токусима. Информированное согласие было также дано всем пациентам, предоставивших клинические образцы. Ткани были заморожены в сухом льду метанольной бане, как можно скорее после того, как рассечение и хранить в морозильной камере глубокого (-80 ° С) перед использованием. Для анализа мРНК, ткани были сначала погружают в RNAlater (Takara, Токио, Япония) перед замораживанием. Подробное клинико-патологическими данные, включая стадии опухоли (в соответствии с системой AJCC), сайт и дифференциации, и гистологических данных на образцах ткани, приведены в таблице 3. Ни один из этих случаев не были отнесены к категории скиррозных типа, и опухолевая ткань была явно distinguishted от неопухолевой одной в каждом конкретном случае. Для двумерного гель-электрофореза (2D-EP), экстракции белка из тканей осуществляли с помощью следующей процедуры. Замороженные блоки (20-30 мг сырого веса) гомогенизируют с пластмассовым пестиком (Toyobo, Токио, Япония) в присутствии стеклянных шариков в 10 об /сырого веса диализного буфера, содержащего 5 М мочевины, 1 М тиомочевины, 10 мМ Nappi , 1,67 мкл /мл 2-МЕ, 0,005% ДНКазы I, 0,05 мг /мл РНКазы а, 20 мкМ лейпептин, 1 мМ ЭДТА, 2 мМ PMSF и 20 мкМ pepstatinA, а затем центрифугировали при 50000 оборотах в минуту в течение 30 мин при температуре 4 ° С (Бекман -Coulter, Фуллертон, СА). Полученный в результате супернатант использовали в качестве экстракта ткани. Концентрации белка определяли с помощью анализа белков комплекта Брэдфорда (Bio-Rad, Hercules, CA) с использованием бычьего гамма-глобулина в качестве standard.Table 3 Клинические особенности у больных с желудочной аденокарциномы.
Case

Age

Sex

Locationa

Gradeb

Stage


A
63
Male
UM
G3
IIIA
T2N2M0H0
B
68
Female
L
G2
II
T2N2M0
C
76
Male
ML
G2
IV
T4N3M0
D
78
Female
L
G2
III
T2N0M0H0
E
77
Male
ML
G2
II
T2N1M0
Àu: верхний, M: средний, L: нижняя
BG2: умеренно дифференцированы, G3:. низкодифференцированная
Two-размерных гель-электрофорез
2D-EP проводили, как описано ранее [39]. Первая одномерная изоэлектрической фокусировкой проводили в 1% (вес /объем) гель агарозы (φ 2,6 × 180 мм) с рН 3-10 градиентом при 700 В в течение 18 часов при 4 ° С, а второй одномерная ДСН гель-электрофорез проводили с помощью 5-15% (вес /объем) акриламид градиент (M
R диапазон, 6-200 кД) в стандартном слябов геле (20 × 13 см), при 15 мА в течение 3 ч, а затем при 70 мА в течение 2 ч при комнатной температуре. Гели окрашивали СВВ R-250.
Образцы белка (500 мкг), извлеченный из центра опухоли и окружающих гистологически нормальной слизистой были подвергнуты 2D-EP и работать в парах, бок о бок.
Некоторые из окрашенных пятен вырезали из 2D-геле, в геле переваривают с помощью трипсина и затем подвергали анализу ЖХ-ESI-МС /МС, как описано ранее [40]. Пептид смесь разделяют с обращенной фазой системы nanoLC (известный, Swichos II, Ultimate, LC Packings, Саннивейл, Калифорния). Элюированные пептиды распыляется непосредственно в масс-спектрометр ESI (Esquire3000 Plus, Bruker-Daltonics, Fremont, CA).
Большой объем данных MS /MS была приобретена с DataAnalysis 3.1 программного обеспечения (Bruker-Daltonics), преобразуются в текст файлы в которых перечислены массовые значения родительских ионов, а также интенсивности и массы осколочных ионов, а затем обрабатываются с помощью алгоритма MASCOT (Matrix Science Ltd, Лондон, Великобритания), чтобы назначить пептиды в нерезервированном базе данных последовательностей NCBI с использованием таксономического ограничения, 'человек'. Поиск в базе данных была выполнена с параметрами, описанными Yoshimura и соавт. [40]. Анализ
изображений и MS пептидного секвенирования
Получение изображений и анализ были проведены с молекулярной Imager FXProPlus (Bio-Rad) и ImageMaster программного обеспечения (Bio-Rad). Сравнения были сделаны между гелевыми изображениями опухоли и соответствием nontumor образцов пары с помощью пары. Нормированные различия объема были статистически рассчитаны для всех пяти случаях. Содержание глицеральдегид 3-phosphodehydrogenase (GAPDH) белок использовали в качестве эталона для оценки кратное изменение экспрессии белка между опухолью и соответствием nontumor ткани как уровни мРНК GAPDH и белка не были изменены между тканями, полученными от пациентов. Стабильно и существенно разные места были выбраны для анализа с помощью LC-ESI-MS /MS. Белковые пятна! Вырезали из геля на мелкие кусочки, и подвергали в геле трипсином переваривания в течение ночи [40]. Масс-спектры регистрировали Пептидные и параметры для приобретения спектров были использованы, как указано ранее [40]. Точность при сопоставлении с белковой базе данных с помощью Mascot Поиск [41] был оценен как счет более 37, который был получен в большинстве анализов. Изоляция
РНК и ОТ-ПЦР анализ
опухолевой и соответствует nontumor образцов (прибл. 50 мг сырого веса) измельчали, а затем гомогенизируют вручную в 1 мл реагента TRIZOL (Invitrogen) на льду. РНК выделяли без лечения ДНКазы I в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, 0,2 мл CHCl <суб> 3 был добавлен в гомогенате, с последующим центрифугированием при 20600 • g в течение 15 мин. Равный объем 2-пропанола добавляли к полученному супернатанту, чтобы осадить РНК. После центрифугирования осадок промывали 75% этанолом /diethylpyridylchloride (ДЭФЦ) -обработанной водой, с последующей сушкой. Осадок растворяют в соответствующем объеме DEPC обработанной воды в качестве фракции общей РНК. Для обратной транскрипции (RT), 2 мкг РНК из каждого образца был расшифрован при 37 ° С в течение 1 ч в присутствии 200U из Molony вируса лейкоза обратной транскриптазы (Promega), олиго (дТ) <суб> 12-18 праймера, 0,5 мМ дНТФ и 50U из RNaseOUT. ДЗП для карбоангидразы-I и II, глутатион-S-трансферазы, FOV и GAPDH были выполнены в пределах линейного диапазона усиления с использованием выбранного набора праймеров и условий, а также ожидаемый размер продуктов, как представлено в таблице 4. ПЦР

• Вниз регулирование Thrombospondin2 предсказывает плохой прогноз у больных раком желудка
• Катехоламинов вверх регулирует экспрессию ММР-7 путем активации AP-1 и STAT3 в желудочном cancer