PLOS ONE: Kvantifiering av Kitinas mRNA-nivåer i människa och mus vävnader genom realtids-PCR: artspecifik Expression av Sura Däggdjur Kitinas i magen vävnader

Abstrakt

Kitinas hydrolyserar kitin, som är en N
acetyl-D-glukosamin polymer som är närvarande i ett brett spektrum av organismer, inklusive insekter, parasiter och svampar. Även däggdjur innehåller inte någon endogen kitin, människor och möss uttrycka två aktiva kitinaser, chitotriosidasaktivitet (Chit1) och sura däggdjurs kitinas (AMCase). Eftersom nivån på uttrycket av dessa kitinaser ökas i många inflammatoriska tillstånd, däribland Gauchers sjukdom och musmodeller av astma, kan båda kitinaser spelar viktiga roller i de pathophysiologies av dessa och andra sjukdomar. Vi etablerade nyligen en kvantitativ PCR-system använder en enda standard-DNA och visade att AMCase mRNA syntetiseras på utomordentligt höga nivåer i mus magen vävnader. I denna studie, tillämpade vi denna metod för kvantifiering av kitinas mRNA i humana vävnader och fann att båda kitinas mRNA allmänt uttrycktes i normala humana vävnader. Chit1 mRNA höggradigt uttrycks i den mänskliga lungan, medan AMCase mRNA inte var överuttryckt i normala humana magen vävnader. Halterna av dessa mRNA i humana vävnader var betydligt lägre än de nivåer av hushållningsgener. Eftersom AMCase expressionsnivåerna var helt annorlunda mellan människa och mus magen vävnader, utvecklade vi en kvantitativ PCR-system för att jämföra mRNA-nivåer mellan människa och mus vävnader med hjälp av en human-mus-hybrid standard-DNA. Vår analys visade att Chit1 mRNA uttrycks på liknande nivåer i normal human och mus lunga. I motsats härtill AMCase expressionsnivån i människans mage var signifikant lägre än den uttrycksnivå observerades i mus mage. Dessa mRNA skillnader mellan människa och mus magen vävnader återspeglar skillnader i kitinolytisk aktiviteter och nivåer av proteinuttryck. Således, expressionsnivån av AMCase i magen är artspecifik

Citation:. Ohno M, Togashi Y, Tsuda K, Okawa K, Kamaya M, Sakaguchi M, et al. (2013) Kvantifiering av Kitinas mRNA-nivåer i människa och mus vävnader genom realtids-PCR: artspecifik Expression av Sura Däggdjur Kitinas i magen vävnader. PLoS ONE 8 (6): e67399. doi: 10.1371 /journal.pone.0067399

Redaktör: Emiko Mizoguchi, Massachusetts General Hospital, USA

Mottagna: 5 januari 2013, Accepteras: 15 maj 2013; Publicerad: 27 juni 2013

Copyright: © 2013 Ohno et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av projektbidrag från Institutet för vetenskap och teknik, Kogakuin University. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Kitin, som är en polymer av N
acetyl-D-glukosamin, är den andra mest förekommande polysackarid i naturen [1]. Det är en integrerad del av exoskelett av kräftdjur och insekter, de microfilarial höljen parasitiska nematoder och svampcellväggar [1], [2].

Kitinaser är enzymer som bryter ner kitin polymer. Även däggdjur inte producerar kitin, människor och möss har två gener som kodar aktiva kitinaser, chitotriosidasaktivitet (Chit1) och sura däggdjur kitinas (AMCase) [2], [3]. Chit1 var den första däggdjurs kitinas som skall renas och klonas [4], [5]. AMCase, vilket är den näst mest aktiva kitinas hos däggdjur, identifierades som en kompensations enzym för Chit1 och uppkallad efter sin optimala aktivitet under sura betingelser [6].

Båda enzymerna uppvisar sekvenshomologi med bakterie kitinaser och tillhör familj 18 av glykosylgrupper hydrolaser, som även omfattar kitinas-liknande proteiner som är strukturellt besläktade med kitinaser men saknar kitinolytisk aktivitet [2], [3]. Den murina AMCase visar sekvenshomologi med Chit1, med en identitet av 52% och en likhet på 60% [6]. Den geometriska orten för den humana Chit1 genen hittas på kromosom 1q32 [7], medan human AMCase genen är belägen på kromosom 1p13 [6]. Båda generna består av 12 exoner och kodar olika splits isoformer [6] - [9]. Sekvenshomologin och bevarandet av intron-exon gränser mellan Chit1 och AMCase gener tyder på att dessa gener uppstod från en dubblering av en uråldrig gen [3], [6].

Nya studier har visat samband mellan uttrycket av de däggdjurs kitinaser och inflammatoriska tillstånd. Till exempel, är nivåerna av Chit1 förhöjda i plasma hos patienter med Gauchers sjukdom, den bronkoalveolär sköljvätska av rökare och patienter med kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) och cerebrospinalvätskan hos patienter med Alzheimers sjukdom [9] - [12] . AMCase expression och aktivitet är också uppregleras under allergiska luftvägssvar i musmodeller av astma [13]. Polymera kitin inducerar AMCase uttryck och rekrytering av immunceller som är förknippade med allergi och astma [14]. Dessutom är flera genetiska varianter av AMCase förknippas med bronkialastma hos människa [15], [16]. Dessa resultat tyder starkt på att de kitinolytisk enzymer spelar viktiga roller i svaret på sjukdomen. Men deras patofysiologiska funktioner förblir dåligt förstådda.

Kvantifiering av Chit1 och AMCase mRNA-nivåer är ett viktigt steg mot att förstå In vivo
reglering av kitinaser i däggdjur. Vi etablerade nyligen en kvantitativ PCR-system använder en enda standard-DNA för att kvantifiera och jämföra uttrycksnivåerna av kitinas och referens gener i samma skala [17]. I vår tidigare papper, visade vi att AMCase är ett stort transkript i musen magen och uttrycks på nivåer som är jämförbara med dem av pepsinogen C [17].

Här tillämpade vi vår metodik för kvantifiering av mRNA-nivåer av däggdjurs kitinaser i normala humana vävnader, vilket är en förutsättning för att förstå deras patologiska roller i sjuka vävnader. Dessutom har vi etablerat en kvantifiering system för att jämföra mRNA-nivåer av flera gener mellan ett antal humana och mus vävnader med hjälp av en human-mus-hybrid standard-DNA. Vår studie visar kvantitativt att Chit1 mRNA uttrycks på liknande höga nivåer i normala humana och mus lungorna. Däremot är AMCase övervägande överuttryckt i mus men inte människans mage.

Resultat

Upprättande och validering av en Real-time PCR system för detektion av Kitinaser i mänskliga vävnader

vi tidigare etablerat en realtids-PCR-system som är i stånd att bestämma mRNA-nivåerna av de två däggdjurs kitinaser i mus vävnader och av en jämförelse av dessa nivåer med de för referensgener med användning av samma skala [17]. I denna studie ville vi jämföra genuttryck nivåer av Chit1 och AMCase gener över normala humana vävnader (Figur 1A). Som i mus vävnader [17] använde vi housekeeping-gener glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) och β-aktin som referensgener eftersom de uttrycks konstitutivt på höga nivåer i de flesta celler [18]. Dessutom valde vi pepsinogen C (även känd som progastricsin) som referens-gen i magen på grund av att nivån av AMCase mRNA i mus magen var jämförbar med mRNA-nivån av pepsinogen C, som utgör en huvudkomponent i magslemhinnan [ ,,,0],19]. Med hjälp av dessa tre referensgener, utvärderade vi genuttryck nivåer av Chit1 och AMCase i normala humana vävnader (Figur 1A).

Vi har utformat flera uppsättningar av primers för kvantitativ PCR och utvärderas deras lämplighet beroende på om de uppvisade en enda smälttemperatur (Tm) och ett enda band på en 10% polyakrylamidgel [17]. Såsom visas i fig S1A-E, dissociationen kurvorna för de fem cDNA uppvisar endast en topp vardera. Gelelektrofores visade tydligt enstaka band vid den förväntade storlekar för Chit1 (55 bp), AMCase (62 bp), GAPDH (57 bp), β-aktin (57 bp) och pepsinogen C (61 bp) (Figur S1F). Således bekräftade vi att rätt PCR-produkter amplifierades från det humana vävnads-cDNA-blandning.

Vi konstruerade nästa en standardmall-DNA för realtids-PCR genom att ligera de fem målfragment i ett ett-till-ett-förhållande (Figur 1B och figur S2). Den 1396-nukleotider lång standardmall DNA bestod av fem cDNA-fragment som täckte PCR målregionen och 60-143 baser de flankerande regionerna och innehöll Bgl
II, Sal
I, Xho
i och inte rekommendera i restriktionsställen (Figur 1B och figur S2).

kvantifiering av både kitinaser och referens mRNA bygger på standardkurvor. Vi använde standardkurvor för att jämföra och utvärdera de realtid PCR kvantifiering strategier. Varje standardkurva genererades med användning av 10-faldiga seriespädningar av det humana standard-DNA och de fem olika primerpar (Figur S3A-E, röd fyllda cirklar). Genom att använda standardmall DNA innehållande de fem humana cDNA-fragment, kan lika mängder tilldelas alla fem gener i varje utspädning är hållbar att konstruera standardkurvor (figur S3A-E, röd fyllda cirklar).

För att testa likheten av kurvorna, en känd koncentration av den humana hela den kodande cDNA amplifierades och analyserades därefter som ett okänt prov. Denna analys utfördes för att verifiera att varje testad spädning resulterade i den förväntade mängden. Såsom visas i fig S3A-E, blå slutna romber, var lika kvantiteter observerades för varje testad spädning; Dessa användes för att konstruera standardkurvan.

kvantifiering av lågprisflyg överflöd transkript och rikliga transkript tillåter oss att validera känslighet och tillförlitlighet realtids-PCR, vilket tyder på att vår realtids-PCR-metoden har en stor dynamiska området för kvantifiering, hög noggrannhet och hög känslighet (Figur S3A-E). Således ger vår realtids-PCR-metoden tillförlitliga värden för de två humana kitinas gener och de tre humana referens gener på samma skala.

Uttryck av Chit1 och AMCase i normala humana vävnader

För att studera in vivo
reglering av uttrycket av de humana Chit1 och AMCase gener framställdes totalt RNA från olika normala humana vävnader analyserades med användning av en kvantitativ realtids-PCR-analys med den särskilt utformade standard-DNA (figur 1). De erhållna värdena uttrycktes som molekyler per 10 ng av totalt RNA i y-axeln (figur 2 och figur 3).

Både Chit1 och AMCase mRNA var brett uttryckt i normala humana vävnader (figur 2A och 2B). De högsta nivåerna av Chit1 mRNA detekterades i human lunga, följt av mjälte, fetal lever och tymus (Figur 2A). De högsta nivåerna av AMCase mRNA detekterades i lunga, följt av fetal hjärna, lever, sköldkörtel och hjärta (figur 2B). Även AMCase mRNA uttrycktes vid utomordentligt höga nivåer i musens mage [17], dess expressionsnivå i den mänskliga magen var mycket lägre än de i lunga, fetal hjärna, fetal lever, sköldkörtel och hjärta (figur 2B). I andra vävnader, var både Chit1 och AMCase mRNA uttrycks i låg, men lätt detekterbara nivåer över bakgrunden (Figur 2A och figur 2B).

I jämförelse med AMCase mRNA-nivåer, Chit1 mRNA uttrycktes vid relativt högre nivåer i mjälte och fetal lever. I motsats, fetal hjärna, prostata och lever uttryckte en större mängd AMCase mRNA än Chit1 mRNA (Figur 2).

Analys av expressionsnivåer av Chit1, AMCase, GAPDH, β-aktin och Pepsinogen C mRNA i normal Human lungorna och magen vävnader

Eftersom många studier på patofysiologin av däggdjurs kitinaser har utförts med hjälp av lungorna och magen [6], [8], [9], [13], [14], [20 ] - [23], jämförde vi expressionsnivåer av de kitinaser och referens generna i dessa två humana vävnader. De kvantitativa data visas i Figur 3. normalisera Chit1 nivån till 1,0, de relativa expressionsnivåer av AMCase, GADPH, och p-aktin-mRNA i human lungvävnad var 0,8, 39 och 343, respektive (figur 3A). GAPDH och p-aktin-gener är välkända hushållningsgener och är konstitutivt uttryckta vid höga nivåer i de flesta vävnader [18]. Våra resultat visar att Chit1 och AMCase mRNA uttrycks på liknande nivåer i normal human lungvävnad, även om Chit1 expressionsnivån var mycket lägre än de för de två housekeeping-gener (jämför icke-log-kurva med log-kurva i fig 3).

normalisera Chit1 nivån till 1,0, de relativa expressionsnivåerna av den AMCase, GAPDH, β-aktin och pepsinogen C i normal human magvävnad var 1,5, 323, 1736 och 3962, respektive (figur 3B). Här, var de expressionsnivåer av både Chit1 och AMCase mycket lägre än de för GAPDH och β-aktin. Även pepsinogen C mRNA starkt uttryck i människans mage prover AMCase mRNA var jämförbar med Chit1. Dessa resultat tyder på att Chit1 och AMCase expressionsnivåerna är relativt låg i de mänskliga vävnader undersökts och att AMCase uttrycksnivån i magen skiljer sig betydligt mellan människa och mus.

Upprättande och validering av en kvantifiering system för mänskliga rättigheter och mus Kitinas mRNA med hjälp av en human-mus hybrid-DNA

Vi sökte bredvid jämföra uttrycksnivåerna för de två kitinaser mellan människor och möss i samma skala med hjälp av en realtids-PCR-system (Figur 4A). Vi konstruerade därför ett human-mus-hybrid standard-DNA för realtids-PCR genom att ligera de standardmall DNA från människa och mus (Figur 4B). Den resulterande 2305-nukleotider lång mall-DNA innehöll tio cDNA-fragment som täckte PCR målregionen och 9-143 baser de flankerande regionerna av de humana och mus-gener (se detaljer i figur S4).

valideringar för standardkurvan och kvantitativ realtids-PCR-system utfördes såsom visas i Figur S5, fig S6 och figur S7. Serieutspädningar av human-mus-hybrid standard-DNA användes för att konstruera en standardkurva. Varje standardkurva genererades med användning av 10-faldiga seriella spädningar av standard-DNA och de fem olika primerpar (Figur S5A-E, röd slutna cirklar). Med hjälp av standardmall-DNA innehållande de fem cDNA-fragment, kan lika mängder tilldelas alla de fem humana gener med användning av humant-specifika primerpar i varje spädning som användes för att konstruera standardkurvor (figur S5A-E, röd fyllda cirklar ). På samma sätt kan lika stora mängder tilldelas alla de fem murina gener (Figur S6A-E, lila fyllda trianglar).

För att testa lika kurvorna, en känd koncentration av hela den kodande cDNA förstärktes och analyserades därefter som ett okänt prov. Lika mängder av humana hela kodnings cDNA observerades för varje testad utspädning; dessa kvantiteter användes därefter för att konstruera standardkurvan (Figur S5A-E, blå slutna romber). På samma sätt, lika mängder av mus hela kodnings cDNA observerades också (Figur S6A-E, gröna kors). Kvantifieringen av lågprisflyg överflöd transkript och rikliga transkript tillåter oss att validera känslighet och tillförlitlighet realtids-PCR, vilket tyder på att vår realtids-PCR-metoden erbjuder ett stort dynamiskt område av kvantifiering, hög noggrannhet och hög känslighet (Figur S5A- E och Figur 6A-E).

Dessutom fyra rader (två standardkurvor och två utspädningskurvor för kända koncentrationer av mänskliga och mus hela kodnings cDNA respektive) överlappade (Figur S7A-E). Således ger vår realtids-PCR-metoden tillförlitliga relativa värden för de fyra kitinas generna och de sex referens gener (Figur 4B).

Jämförelse av Chit1 och AMCase mRNA-nivåer mellan normal människa och mus vävnader

Vi använde Human total RNA master Panel II och musen total RNA huvudpanel (Clontech Laboratories) som källor till total RNA för denna studie. Det finns fyra vävnader (lunga, lever, mjälte och njure) som överlappade mellan människa och mus paneler och relaterad till astma och Gauchers sjukdom. Eftersom det inte fanns framträdande skillnader i kitinas uttryck i magen vävnader, har också tittat vi på de nivåer av uttryck av dessa kitinaser i andra matsmältningsorgan, spottkörtel, mage, tunntarm och tjocktarm mellan människa och mus. Vi kvantifieras och jämförde uttrycksnivåer i dessa vävnader med hjälp av human-mus-hybrid standard-DNA (figur 4B); de kvantitativa data visas i Figur 5.

Vi fann den högsta expressionsnivån av Chit1 mRNA i mus (men inte human) mage, följt av humana lungvävnader. Totalt sett var Chit ett mRNA uttrycks vid högre nivåer i de humana vävnader än i mus-vävnader utom för mage (figur 5A). Den högsta expressionsnivån av AMCase mRNA var i mus mage, följt av mus-spottkörtel. I andra humana och mus vävnader, de AMCase mRNA-nivåerna var låga i humana vävnader (figur 5B). Både Chit1 och AMCase mRNA-nivåer i tunntarm och tjocktarm var mycket låga i både humana och mus vävnader (Figur 5), som överensstämde med tidigare data som erhållits genom Northern blotting [6], [21].

Vi funnit att AMCase mRNA uttrycktes i låga halter i normal human mage men var högt uttryckt i mus magen vävnader (Figur 5B). Således, även jämfört vi de expressionsnivåer av de kitinaser och referensgener med användning av de cDNA som framställdes från lungan och magen vävnader.

normalisera den humana Chit1 nivån i lungvävnaden till 1,0, de relativa expressionsnivåerna av mus Chit1, humant AMCase och mus AMCase mRNA var 0,3, 0,3 och 7, respektive (figur 6A). Murin AMCase var mycket uttrycks i mus lungan. Nivån av Chit1 mRNA i den mänskliga lungan var ca 3 gånger högre än den i muslunga. De Chit1 och AMCase mRNA-nivåer var signifikant lägre än de expressionsnivåer av GAPDH och p-aktin-gener (figur 6A).

normalisera humana Chit1 nivån i magen till 1,0, de relativa expressionsnivåer av musen Chit1, den mänskliga AMCase och mus AMCase mRNA var 10, 0,7 och 1978 respektive (Figur 6B). Pepsinogen C är en stor mag enzym i magen. Uttrycksnivån för AMCase i möss var mycket högre än de för GAPDH och β-aktin och var jämförbar med nivån av pepsinogen C, medan den mänskliga magen uppvisade en mycket låg nivå av AMCase mRNA-expression. De relativa uttrycksnivåerna av mRNA i den mänskliga och mus mage var 1,0 och 2826, respektive.

För att kunna kontrollera om skillnaderna de mRNA-nivå mellan mus och människa återspeglades på proteinnivå, nästa analyserade vi enzymatisk aktivitet av dessa kitinaser i magen vävnader. Vi analyserade första AMCase aktivitet i mus och mänskliga magen vävnader. Musen AMCase visar en dubbel pH-optimum med en större optimum runt pH 2 och en sekundär optimum runt pH 5 [6], medan human AMCase visar brett optimalt pH vid pH 2~pH 5 [16], [24]. Sålunda mätte vi kitinolytisk aktivitet vid pH 2,0 och pH 5,0 med användning av det syntetiska substratet av 4-metylumbelliferyl β-D-N, N'-diacetylchitobiose (4MU-chitobiose) [6], [21]. Vi upptäckt robust kitinolytisk aktivitet i mus mage extrakt vid pH 2,0 och stark aktivitet vid pH 5,0. Däremot var ingen aktivitet detekterades i den för humant vid pH 2,0 och mycket låg aktivitet observerades vid pH 5,0 (figur 7A, vänster).

Standarden Chit1 enzymatisk analys har utförts med användning av 4-metylumbelliferyl β- DN, N ', N' '- triacetylchitotriose (4MU-chitotriose) vid pH 5,2 [6], [10], [21], [25]. Att övervaka effekterna av AMCase på Chit1 aktivitet, analyserade vi kitinasaktivitet använder 4MU-chitotriose vid pH 2,0. Relativt stark kitinas aktivitet mot 4MU-chitotriose detekterades i musen magen extraktet vid pH 2,0 (figur 7A höger), och vi har upptäckt också svag kitinasaktivitet vid pH 5,2 (figur 7A höger). Eftersom AMCase har en andra optimum vid omkring pH 5, dessa resultat indikerade att det mesta av kitinolytisk aktivitet vid pH 5,2 kan bero på AMCase stället Chit1 och den mus AMCase kunde hydrolysera 4MU-chitotriose som substrat vid pH 2,0. Tagna tillsammans, majoriteten av kitinasaktivitet i mus magen resulte från AMCase aktivitet. I människans mage extrakt vi observerade också mycket svaga men detekterbara nivåer av kitinolytisk aktivitet vid pH 2,0 och pH 5,2 (figur 7A, höger, lägre panelen). Kitinas aktivitet vid pH 5,2 var jämförbar med den vid pH 2,0, vilket indikerar Chit1 expression i människans mage.

Slutligen analyserade vi nivåerna av proteinuttryck genom Western blotting med användning av antikroppar mot AMCase. De anti AMCase antikroppar genererades mot den tidigare rapporterade mus peptiden [14] och mänskliga motsvarighet. Anti-mus AMCase antikropp erkänt en robust enda proteinband i utdrag ur mus mage men inte från människa (figur 7B, vänster). På liknande anti-human AMCase antikropp kände också igen ett enda band i mus extrakt (figur 7B, höger). I människo extraktet fanns svaga band av något högre molekylvikt som redovisats av både mänskliga och mus-antikroppar (Figur 7B). Eftersom det inte fanns någon signifikant kitinasaktivitet vid antingen pH 2,0 eller pH 5,0 övervakas med hjälp av 4MU-chitobiose i människans mage extrakt, kan dessa band inte vara knuten till den mänskliga AMCase. Följaktligen kitinolytisk aktiviteter och de relativa proteinexpressionsnivåer mellan mus och mänskliga magen vävnader överensstämde med våra data som erhållits på mRNA-nivå.

Diskussion

Tidigare studier på In vivo
reglering av Chit1 och AMCase i människa och mus utfördes med hjälp av Northern blotting, semi-kvantitativ PCR och realtids-PCR [6], [8], [9], [13], [14], [22] [23]. Även om dessa metoder har flera fördelar jämfört med den undersökning av genuttryck mönster, misslyckades de att jämföra halterna av de olika gentranskript i samma skala. I den aktuella studien, tillämpade vi vår metodik [17] för att undersöka uttrycksnivåer av dessa kitinaser i mänskliga vävnader. Vidare att utvärdera uttrycksnivåerna av kitinaser i humana och mus vävnader, har vi utvecklat en kvantifiering system med en enda människa och mus hybrid standard-DNA. Vi visade vävnads- och artspecifika uttryck av de två däggdjurs aktiva kitinaser, Chit1 och AMCase. Våra data stöder generellt tidigare studier som rapporterats av Boot et al [6], [21]. Men är vår analys är tillräckligt känslig för att detektera mRNA och ger en omfattande undersökning av genuttryck mönster av kitinaser i humana och mus vävnader på samma skala.

En märkbar egenskap av uttrycket av däggdjurs kitinaser är den konserverade uttryck av Chit1 mellan människa och mus lungvävnad. Vi fann att Chit1 uttrycktes vid relativt höga nivåer i människa och mus lungvävnader som var nästan jämförbara med varandra, vilket indikerar att uttrycksnivån för Chit1 mRNA är konserverad. I lungorna, kan Chit1 fungera som del av värdens försvarssystem, som skyddar mot kitin-innehållande patogener, såsom svampar och kvalster [25]. Bevarande av Chit1 genuttryck i människor och möss antyder den fysiologiska betydelsen av Chit1 i lungan.

Uttrycket av kitinaser i magen är av särskilt intresse. AMCase mRNA syntetiseras vid utomordentligt höga nivåer i musens mage, men inte i den mänskliga magen (Figur 6B). Jämförelsen av dessa uttrycksnivåer visade att AMCase mRNA-nivån i människans mage var ca 1/2800 av den i mus motsvarighet. Vi bekräftade att uttrycksnivåer pepsinogen C-mRNA och de två hushållning gener var mycket hög i människa och mus magen vävnader (Figur 6B). Således är inte beror på RNA-nedbrytning under cDNA-framställning den minskade expressionsnivån av AMCase mRNA i människans magsäck. Dessutom fann vi att mus mage uttryckte stor mängd AMCase, medan den humana motsvarigheten inte (Figur 7). Dessa resultat tyder på att uttrycksnivån för AMCase i magen vävnader skiljer sig avsevärt mellan människor och möss.

Magen är ett viktigt organ som spelar grundläggande roller i matsmältningen av livsmedel och skydd mot skadliga organismer. Saltsyra utsöndras i magsäcken, vilket skapar sura förhållanden (pH = ~ 2) som är lämpliga för nedbrytning av proteiner genom pepsin [19], [26]. Murin AMCase visar djup syrastabilitet och är mest aktiva vid omkring pH 2 [6]. Musen magen producerar en enorm mängd AMCase mRNA [17] och dess translationsprodukt (Figur 7). Följaktligen kan AMCase fungera som en mag enzym som bryter ned kitin-innehållande livsmedel i musens mage.

I motsats härtill var relativt låga i den mänskliga magen (Figur 5 uttrycksnivån för AMCase mRNA och dess produkt, Figur 6 och figur 7). Detta är inte oväntat eftersom moderna människor inte äter en betydande mängd kitin-innehållande livsmedel. Dessa resultat tyder på att AMCase inte kan spela en roll i försvaret mot kitin-innehållande organismer i den mänskliga magsäcken. Många magsjukdomar är förknippade med infektion av exogena organismer. Svårighetsgraden av gastrit relaterade infektioner såsom Helicobacter pylori
kan korrelera med aktiviteten av endogena enzymer [23]. Det återstår alltså en fråga för debatt om den låga AMCase i människans mage deltar i svaret på magsjukdomar.

En hög kitinolytisk aktiviteter har påvisats i extrakt av mus mage och tarm [6] . Eftersom det finns framträdande skillnader i nivåerna av kitinas uttryck i magen mellan människa och mus, undersökte vi nivåer av uttryck av dessa kitinaser i andra matsmältningsorganen, inklusive spottkörtel och tunntarm och tjocktarm. Våra resultat visar att både Chit1 och AMCase mRNA-nivåer i tunntarm och tjocktarm var mycket låga i både humana och mus vävnader, även om mus spottkörtel och mage producerade höga halter av både kitinaser mRNA (Figur 5). Dessa resultat tyder på att däggdjur kitinas proteiner i mus tarmarna är troligen härstammar från de övre delarna av mag-tarmkanalen, såsom salivkörtel och mage, vilket överensstämmer med den tidigare uppfattningen av Boot et al [6], [21].

de uttrycksnivåer Chit1 genen i lungvävnader är bevarad mellan människor och möss. I kontrast, expressionsnivån av AMCase i magen vävnader är artspecifik. Resultaten tyder på att regleringen av uttrycket av Chiti1 mRNA i lungan har bevarats under evolutionen, medan den minskade expressionen av AMCase i den mänskliga magen kan vara resultatet av geners uttryck. Undersökningen av regleringen av uttrycket av dessa däggdjurs kitinaser kan ge insikter i patofysiologiska rollerna av dessa enzymer. En detaljerad beskrivning av promotorregionerna i Chit1 och AMCase gener och identifieringen av cis
- och trans
verkande faktorer kommer att krävas för att förstå den selektiva genuttrycket av dessa kitinaser hos människor och möss.

uttrycket av Chit1 och AMCase mRNA induceras under olika sjukdomstillstånd. Genom att använda kvantitativa system som beskrivs här, kommer vi att kunna jämföra de kitinas mRNA nivåer inom human- och mus vävnader genom realtids-PCR. Denna analys kommer att bidra till förståelsen av den biologiska funktionen av dessa kitinaser, särskilt i de patofysiologiska studier av mänskliga sjukdomar med hjälp av musmodeller. Vår metodik är tillämplig på kvantifieringen av mRNA för flera gener mellan människa och mus prover med samma skala. En praktisk användning av denna jämförande korsarter genuttryck uppgifter är jämförelsen av mänskliga sjukdomar med mus och cellodlingsmodeller.

Material och metoder

RNA och cDNA Förberedelse

Human Total RNA ledar- Panel II och Rått Total RNA ledar- Panel (Clontech Laboratories) användes för att undersöka fördelningen av transkript i olika vävnader. Människans tunntarm Totalt RNA köptes från Clontech Laboratories. Dessutom isolerades RNA från spottkörtel och tunntarm och tjocktarm av 3 månader gamla hanmöss. C57BL /6J-möss (CLEAR Japan) avlades vid RIKEN Brain Science Institute Animal Facility. Alla djurförsök utfördes i enlighet med de institutionella riktlinjerna. Protokollet godkändes av utskottet för etik djurförsök av RIKEN Brain Science Institute (godkännande nr H19-2B013). All kirurgi utfördes med användning av dietyleter som bedövningsmedel, och alla ansträngningar gjordes för att minimera lidandet. Vävnader för mRNA beredning tillhandahölls av Dr.. Miyazaki och Nukina vid RIKEN Brain Science Institute. Totalt RNA framställdes från spottkörtel och tunntarm och tjocktarm med användning av TRIzol Reagent (Invitrogen) i enlighet med tillverkarens instruktioner. Vi analyserade 21 olika mänskliga vävnader och åtta vuxna musvävnader. För att avlägsna spårmängder av kontaminerande genomiskt DNA, var den totala RNA-prov behandlades med RQ1 RNase-fritt DNas (Promega) enligt tillverkarens rekommendationer. Var och en av de totala RNA-prover underkastades omvänd transkription med användning av slumpmässiga hexamerer som primers, som tidigare rapporterats [17].

Real-time PCR

Etableringen och validering av realtids PCR-system för humana vävnader utfördes såsom beskrivits [17]; Det enda undantaget var användningen av mänskliga primers. Nukleotidsekvenserna för primrarna som valdes för realtids-PCR för det mänskliga systemet visas i tabell S1. Varje prov förstärks i tre exemplar, och varje experiment upprepades minst två gånger.

Byggandet av humant standard-DNA och framställning av fem mänskliga cDNA täcker hela Coding regionen

Konstruktionen av standardmall DNA för mänskliga gener och framställning av de fem mänskliga cDNA som täckte hela den kodande regionen utfördes väsentligen såsom beskrivits [17]; Det enda undantaget var användningen av mänskliga primers. Framåt och bakåt primers anges i tabell S2. PCR-produkterna digererades med de lämpliga restriktionsenzymerna och ligerades med användning av T4 DNA-ligas. De ligerade fragmenten amplifierades med användning av den framåtriktade primern 5'-CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATG-3 'och den omvända primern 5'-CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3' och klonades i pGEM-T Easy vektorn (Promega). De kontrollerade sekvenserna av cDNA visas i figur S2. Nej.

• PLOS ONE: Mage Temperatur Records Reveal Nursing Beteende och Övergång till fast föda Konsumtionen i en Diande däggdjur, hamnen Seal Pup (Phoca vitulina)
• PLOS ONE: Serum Apolipoproteiner CI och C-III reduceras i magcancer patienter: Resultat från MALDI-Based Peptidome och Immuno-Based Clinical Assays