PLoS ONE: Kvantifikacija razine chitinase mRNA u miša i čovjeka tkiva u realnom vremenu PCR: Species-specifičan izraz kisele sisavaca chitinase u želučanog tkiva

Sažetak pregled

hitinaza hidrolizira hitin, što je N pregled acetil-D-glukozamin polimer koji je prisutan u širokom rasponu organizama, uključujući kukce, parazite i gljivice. Iako sisavci ne sadrži bilo endogenog hitin, ljudi i miševa izražavaju dva aktivna hitinaza, chitotriosidase (Chit1) i kiseli hitinaze sisavaca (AMCase). Jer je razina ekspresije ovih hitinaze povećana u brojnim upalnim stanjima uključujući Gaucher bolesti i mišjim modelima astme, i hitinaze može imati važnu ulogu u pathophysiologies tih i drugih bolesti. Nedavno smo uspostavili kvantitativnog PCR sustav pomoću jednog standardnog DNK i pokazali da AMCase mRNA se sintetizira na iznimno visokoj razini u miša želučanog tkiva. U ovom istraživanju, primijenili smo ovu metodologiju za kvantifikaciju chitinase mRNA u ljudskim tkivima i utvrdili da su oba chitinase mRNA su vrlo izražen na normalnim ljudskim tkivima. Chit1 mRNA visoko izražen u humanim plućima, a AMCase mRNA nije izraženo u normalnim tkivima ljudskih želuca. Razine ovih mRNA u ljudskim tkivima bile su značajno niže od razine domaćih gena. Budući da je razina AMCase izraz bili su dosta različiti između miša i čovjeka želučanog tkiva, razvili smo kvantitativni PCR sustav za usporedbu razina mRNA između čovjeka i miša tkiva pomoću čovjeka miša hibridni standardne DNK. Naša analiza pokazala je da Chit1 mRNA izražena na sličnim razinama u normalnom ljudskom i mišjim plućima. Nasuprot tome, AMCase razina ekspresije u ljudskom želucu bila značajno niža od te razine ekspresije promatrana u miša želucu. Ove mRNA razlike između čovjeka i miša tkiva u želucu su odraz razlike u chitinolytic aktivnosti i razine ekspresije proteina. Prema tome, razina ekspresije AMCase u želucu svojstveni vrsti pregled

Izvor. Ohno M Togashi Y, Tsuda K, Okawa K, Kamaya M Sakaguchi M, et al. (2013) Kvantifikacija razine chitinase mRNA u miša i čovjeka tkiva Real-Time PCR: Species-specifičan izraz kisele sisavaca chitinase u želučanog tkiva. PLoS ONE 8 (6): e67399. doi: 10,1371 /journal.pone.0067399 pregled

Urednik: Emiko Mizoguchi, Massachusetts General Hospital, United States of America pregled

Primljeno: 5 siječnja 2013; Prihvaćeno: 15. svibnja 2013; Objavljeno: 27. lipnja 2013 pregled

Copyright: © 2013 Ohno et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane projekta potpore za istraživanje iz istraživačkog instituta za znanost i tehnologiju, Kogakuin Sveučilišta. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

hitin, koji je polimer N pregled acetil-D-glukozamina, je drugi najobilniji polisaharid u prirodi [1]. To je sastavni dio od egzoskelet od rakova i kukaca, od microfilarial futrole parazitskih nematoda i stanične stijenke gljivične [1], [2]. Pregled

hitinaze su enzimi koji sažeto hitina polimer. Iako sisavci ne proizvode hitin, ljudi i miševi imaju dva gena koji kodiraju aktivne hitinaza, chitotriosidase (Chit1) i kiselu chitinase sisavaca (AMCase) [2], [3]. Chit1 je prvi hitinaza sisavaca koji se pročišćava i klonira [4], [5]. AMCase, što je drugi najaktivniji hitinaza kod sisavaca, identificiran je kao kompenzacijskog enzim za Chit1 i imenovan za optimalnu aktivnost u kiselim uvjetima [6]. Pregled

Oba enzima pokazuju homologiju sekvence bakterijske hitinaze i pripadaju obitelj 18 glikozil hidrolaza, što uključuje i hitinaze nalik proteine ​​koji su strukturalno povezane s hitinaze ali nedostatak chitinolytic aktivnost [2], [3]. Mišji AMCase pokazuje homologiju sekvence Chit1, s identitetom 52% i sličnost od 60% [6]. Lokus ljudskog Chit1 gena pronađen na kromosomu 1q32 [7], dok je AMCase Ljudski gen je lociran na kromosomu 1p13 [6]. Oba gena sastoje se od 12 eksona i kodiranje različitih splice 'izoforme [6] - [9]. Homologija slijed i očuvanje granica introna-eksona između Chit1 i AMCase gena ukazuju da su ti geni nastao iz dupliciranja predaka gena [3], [6]. Pregled

Nedavne studije su pokazale povezanost između ekspresija hitinaze sisavaca i upalnih stanja. Na primjer, razine Chit1 su povišene u plazmi pacijenata sa Gaucherovom bolesti, bronhoalveolarnom iscjetku pušača i pacijenata s kroničnom opstruktivnom plućnom bolesti (COPD) i likvoru bolesnika s Alzheimerovom bolešću [9] - [12] , AMCase izražavanje i aktivnost također izraženi su tijekom alergijskih reakcija dišnih putova u mišjim modelima astme [13]. Polimerni hitin inducira ekspresiju AMCase i zapošljavanje imunoloških stanica koje su povezane s alergijom i astmom [14]. Osim toga, nekoliko genetske varijante AMCase povezane s bronhijalne astme kod ljudi [15], [16]. Ovi rezultati jasno ukazuju da su chitinolytic enzimi igraju važnu ulogu u kao odgovor na bolest. Međutim, njihove patofiziološke funkcije ostaju slabo razumio. Pregled

Kvantifikacija Chit1 i razine AMCase mRNA je važan korak prema razumijevanju in vivo
regulaciji hitinaze u sisavaca. Nedavno smo uspostavili kvantitativnog PCR sustav pomoću jednog standardnog DNA kvantificirati i usporedbu razina izraz chitinase i referentnih gena na istoj razini [17]. U našem prethodnom radu, pokazali smo da AMCase je glavni transkript u miša želucu i izražava na razinama koje su usporedive s onima pepsinogen C [17]. Pregled

Evo, primijenili smo našu metodologiju za kvantifikaciju razine mRNA hitinaze sisavaca u normalnim ljudskim tkivima, što je preduvjet za razumijevanje njihove patološke uloge u oboljelim tkivima. Nadalje, utvrdili smo kvantifikaciju sustav za usporedbu razine mRNA više gena između brojnih humanih i mišjih tkiva pomoću čovjeka miša hibridni standardne DNK. Naše istraživanje je kvantitativno pokazuje da Chit1 mRNA se izražava na sličan način visokoj razini u normalnim ljudskim i mišjim plućima. Za razliku od toga, AMCase pretežno izraženo u miša, ali ne i ljudskom želucu. Pregled

Rezultati pregled

Uspostavljanje i validacija real-time PCR sustav za detekciju hitinaze u ljudskim tkivima pregled

Mi smo ranije osnovana u realnom vremenu PCR sustav koji je sposoban za određivanje razine mRNA dva hitinaze sisavaca u mišjim tkivima i usporedbom tih razina s onima referentnih gena koristeći istu skalu [17]. U ovom istraživanju željeli smo usporediti razine ekspresije gena Chit1 i AMCase gena preko normalnih ljudskih tkiva (Slika 1a). Kao u mišjim tkivima [17], koristili smo domaćih gena gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) i p-aktin kao referentne gene jer su konstitutivno eksprimiran u visokoj razini u većini stanica [18]. Osim toga, mi smo izabrali pepsinogen C (također poznat kao progastricsin) kao referentna gena u želucu, jer je razina AMCase mRNA u miša želucu bila je usporediva s razinom mRNK od pepsinogen C, koji predstavlja glavnu komponentu želučane sluznice [ ,,,0],19]. Korištenjem ove tri referentne gene, procijenjena je razina ekspresije gena Chit1 i AMCase u normalnim ljudskim tkivima (Slika 1A). Pregled

Mi dizajniran nekoliko setova početnica za kvantitativne PCR i ocijeniti njihovu prikladnost temelju da li su izlaće temperatura jedan taljenja (Tm) i jedan bend na 10% poliakrilamid gel [17]. Kao što je prikazano na slici S1A-E, krivulje disocijacije pet cDNA pokazuju samo jedan maksimum svaka. Gel elektroforeza jasno pokazao jednu vrpce na očekivanim veličinama Chit1 (55 bp), AMCase (62 bp), GAPDH (57 bp), β-aktin (57 bp) i pepsinogen C (61 bp) (Slika S1F). Dakle, utvrdili smo da su ispravni PCR produkti umnoženi iz ljudske cDNA tkiva smjesu. Pregled

Sljedeći izgrađena standardnu ​​šablonu DNA za real-time PCR vezanjem pet ciljnih fragmente u jedan-na-jedan odnos (Slika 1B i Slika S2). 1396-nukleotid-dugo standardni predložak DNA se sastoji od pet cDNA fragmenti koje su prekrivale PCR ciljano područje i 60-143 bazama bočnim područjima i sadržavao je Bgl pregled II, Sal pregled sam, Xhol pregled i i Ne
sam restrikcijskih mjesta (Slika 1B i Slika S2). pregled

kvantifikacija oba hitinaze i referentnih mRNA se oslanja na standardne krivulje. Koristili smo standardne krivulje usporediti i vrednovati u realnom vremenu PCR kvantifikacije strategije. Svaki Standardna krivulja je generiran s 10-struko serijsko razrjeđenje humanog standardne DNK i pet različitih klica (Slika S3A-E, crveni zatvoreni krugovi). Koristeći standardnu ​​šablonu DNA koja sadrži pet ljudskih fragmenta, jednake količine se mogu dodijeliti svih pet gena u svakoj upotrebi razrjeđivanje za konstrukciju standardne krivulje (Slika S3A-E, crvena zatvoreni krugovi). Pregled

Za testiranje jednakost krivulja, i poznata koncentracija humanog Čitav kodirajući cDNA je, te analizirana kao nepoznatog uzorka. Ova je analiza provedena kako bi provjerili da je svaki testirani razrjeđivanje rezultirala očekivanim količinama. Kao što je prikazano na slici S3A-E, plave zatvorene rombova, jednake količine su promatrani za svaki testirani razrjeđivanja; oni su se koristili za izgradnju standardne krivulje. pregled

Kvantifikacija niske brojnosti transkripata i obilje transkripata omogućuje nam da provjeriti osjetljivost i pouzdanost u realnom vremenu PCR, što znači da je naše real-time PCR metoda nudi veliki dinamički raspon kvantifikacije, visoke točnosti, te visoka osjetljivost (Slika S3A-E). Dakle, naše real-time PCR metoda daje pouzdane vrijednosti za dva ljudska chitinase gena i tri ljudske referentnih gena na istoj razini. Pregled

Izražavanje Chit1 i AMCase u normalnim ljudskim tkivima

Da proučiti in vivo
regulaciju ekspresije ljudskog Chit1 i AMCase gena, ukupna RNA iz različitih normalnih ljudskih tkiva analizirana je pomoću kvantitativne realnom vremenu PCR s posebno dizajniranom standardnom DNA (Slika 1). Rezultirajuće vrijednosti su izražene u molekula po 10 ng ukupne RNA u osi y (slika 2 i slika 3). Pregled

I Chit1 i AMCase mRNA, izražen na normalnim ljudskim tkivima (slika 2a i 2b). Najviše razine Chit1 mRNA otkrivene su u ljudskom pluća, nakon čega slijedi slezena, fetalne jetre i timusa (slika 2a). Najviše razine AMCase mRNA otkrivene su u plućima, nakon čega slijedi fetalnog mozga, jetre, štitne žlijezde i srca (slika 2b). Iako AMCase mRNA je izražena na iznimno visokim razinama u miša želuca [17], njegova razina ekspresije u ljudskom želucu bila znatno niža od one u pluća, mozga fetusa, jetri fetusa, štitnjače i srca (slika 2b). U drugim tkivima, i Chit1 i AMCase mRNA su izraženi u niske, ali lako otkriti razine iznad pozadine (slika 2A i Slika 2B). Pregled

U usporedbi s razinama AMCase mRNA, Chit1 mRNA je izražena na relativno višim razinama u slezeni i jetri fetusa. Nasuprot tome, fetalni mozak, prostate i jetre izrazili veću količinu AMCase mRNA od Chit1 mRNA (Slika 2). Pregled

Analiza razine ekspresije Chit1, AMCase, GAPDH, ß-aktin i Pepsinogen C mRNA u normalni ljudski pluća i želuca Tkiva

Budući da mnoga istraživanja o patofiziologiji hitinaze sisavaca su provedena pomoću pluća i želuca [6], [8], [9], [13], [14], [20 ] - [23], dok je razina ekspresije hitinaze i referentne gene u ta dva ljudskim tkivima. Kvantitativni podaci su prikazani na Slici 3. normalizaciju razine Chit1 do 1.0, relativne razine ekspresije AMCase, GADPH i P-aktin mRNA u ljudskom tkivu pluća bilo 0,8, 39 i 343, respektivno (Slika 3A). Je GAPDH i P-aktin geni su dobro poznati domaćih gena i konstitutivno eksprimiran u visokoj razini u većini tkiva [18]. Naši rezultati pokazuju da Chit1 i AMCase mRNA su izraženi na sličnim razinama u normalnom ljudskom tkivu pluća, iako je Chit1 razina ekspresije bila je znatno niža od one dvojice domaćih gena (usporediti ne-log zemljište sa log zemljište na slici 3).

normalizaciju razine Chit1 do 1.0, relativne razine ekspresije od AMCase, GAPDH, p-aktin i pepsinogen C u normalnom ljudskom tkivu želuca su 1,5, 323, 1.736 i 3962, odnosno (slika 3B). Evo, razine ekspresije i Chit1 i AMCase bile znatno niže od onih GAPDH i P-aktin. Iako pepsinogen C mRNA vrlo je izražen u uzorcima ljudske želuca, AMCase mRNA bila je usporediva s Chit1. Ovi rezultati pokazuju da su Chit1 i AMCase razine ekspresije su relativno niske u ljudskim tkivima pregledanih i da je razina AMCase izraz u želucu značajno razlikuje između čovjeka i miša. Pregled

Uspostavljanje i validacija kvantifikaciju sustava za čovjeka i miš chitinase mRNA Korištenje Hybrid DNA čovjeka i miša pregled

sljedeći nastojao usporediti razine ekspresije dvaju hitinaze između ljudi i miševa na istoj razini pomoću PCR sustav u stvarnom vremenu (slika 4a). Stoga konstruirao ljudski miša hibridni standardne DNK za real-time PCR povezivanjem čovjeka i miša standardnog predloška DNA (slika 4b). Nastali 2305-nukleotid-dugo DNA kalupa sadržavao deset cDNA fragmente koji su obuhvaćeni PCR ciljano područje i 9-143 baza bočnih regijama gena čovjeka i miša (vidi detalje u slici S4). Pregled

potvrđivanje standardne krivulje i kvantitativnom realnom vremenu PCR sustavu su izvedene kao što je prikazano na slici S5, S6 slici i na slici S7. Serijska razrjeđenja ljudsko-mišjeg hibridni standardnim DNA korištene su za konstrukciju standardne krivulje. Svaki Standardna krivulja je generiran s 10-struko serijsko razrjeđenje standardne DNA i pet različitih klica (Slika S5-E, crveno obojani kružići). Koristeći standardnu ​​šablonu DNA koja sadrži pet cDNA fragmente, jednake količine se mogu dodijeliti svih pet ljudskih gena koji koriste ljudski specifičan par klica u svako razrjeđenje koje se koriste za izradu standardnih krivulja (Slika S5-E, crvena zatvorene krugove ). Isto tako, jednake količine se mogu dodijeliti svih pet mišjih gena (Slika S6A-E, ljubičasta zatvorene trokuta). Pregled

Kako bi se ispitala jednakost krivulja, poznatu koncentraciju cijele kodiranje cDNA je pojačan i zatim analizirana kao nepoznatog uzorka. Jednake količine ljudskog cijele kodirane cDNK su promatrani za svaki testirani razrjeđenje; ove količine su potom korišteni za izradu standardne krivulje (Slika S5-E, plava zatvorena rombova). Isto tako, jednake količine cijelog kodiranje cDNA mišem i su primijećeni (Slika S6A-E, zeleni križevi). Kvantifikacija niske brojnosti transkripata i obilje transkripata nam omogućuje provjeru valjanosti osjetljivost i pouzdanost u realnom vremenu PCR, što znači da je naše real-time PCR metoda nudi veliki dinamički raspon kvantifikaciju, visoke točnosti, te visoka osjetljivost (Slika S5A- E i Slika 6A-E). pregled

Nadalje, četiri voda (dva standardna krivulja i dvije krivulje razrjeđenja od poznatih koncentracija cijele kodirane cDNA ljudskih i mišjih, respektivno) preklope (Slika S7A-E). Dakle, naše real-time PCR metoda daje pouzdane relativne vrijednosti za četiri chitinase gena i šest referentnih gena (slika 4b). Pregled

Usporedba Chit1 i AMCase mRNA razinama između normalnog čovjeka i miša tkiva pregled

koristili smo Human ukupne RNK Master Panel II i miša ukupne RNK Master Panel (Clontech Laboratories) kao izvora ukupne RNA za ovu studiju. Postoje četiri tkiva (pluća, jetra, slezena i bubrega) koje se međusobno isprepliću između čovjeka i miša panela i srodne astme i Gaucherovom bolesti. Budući da su istaknute razlike u ekspresiji chitinase u želucu tkiva, također pogledao razinama ekspresije tih hitinaze u drugim probavnih organa, žlijezde slinovnice, želuca, tankom i debelom crijevu između čovjeka i miša. kvantificirane smo i usporedili razine ekspresije u tim tkivima koriste ljudski miš hibrid standardne DNA (slika 4b); Kvantitativni podaci su prikazani na Slici 5. pregled

Pronašli smo najvišu razinu ekspresije mRNA u Chit1 miša (ali ne ljudi) želuca, nakon čega humanih pluća tkiva. Sve u svemu, Chit 1 mRNA je izražena na višim razinama u ljudskim tkivima nego u mišjim tkivima, osim za želudac (Slika 5a). Najviša razina ekspresije AMCase mRNA je u miša želucu, nakon čega slijedi miša slinovnice. U drugim ljudskim i mišjim tkivima, razine AMCase mRNA bile su niske u ljudskim tkivima (slika 5B). Oba Chit1 i AMCase mRNA razine u tankom i debelom crijevu su vrlo niska u oba čovjeka i miša tkiva (Slika 5), ​​koji su u skladu s prethodnim podacima dobivenim Northern blot '[6], [21]. Pregled

utvrdio da AMCase mRNA je izražena na niskim razinama u normalnom ljudskom želucu, ali je vrlo izražena u mišjim želučanog tkiva (Slika 5b). Stoga smo usporedili razinu ekspresije hitinaze i referentne gene pomoću cDNA koje su pripremljene iz pluća i želuca tkiva.

normalizaciju razine ljudskog Chit1 u plućnom tkivu 1,0, relativne razine ekspresije mišjeg Chit1, ljudska i mišja AMCase AMCase mRNA bila 0,3, 0,3 i 7, redom (slika 6a). Murine AMCase je vrlo izražena u mišjim plućima. Razina Chit1 mRNA u humanim plućima je oko 3 puta veća od one u mišjim plućima. U Chit1 i AMCase količine bile su znatno niže od razine ekspresije gena GAPDH i ß-aktin (slika 6a). Pregled

normalizaciju ljudskoj razini Chit1 u želucu to1.0, relativne razine ekspresije miša Chit1, ljudsko AMCase i miša AMCase mRNA bila 10, 0,7 i 1978 respektivno (Slika 6b). Pepsinogen C je glavni probavni enzima u želucu. Razina ekspresije AMCase u miševa bila mnogo veća od onih GAPDH i P-aktin i bila je usporediva s razinom pepsinogen C, a ljudski želudac je pokazao vrlo nisku razinu ekspresije AMCase mRNA. Relativna razina ekspresije mRNA u miša i čovjeka želudac bili 1.0 i 2826, respektivno. Pregled

Kako bi se provjerilo jesu li razlike na razini mRNA između miševa i kod ljudi su se odrazili na razini proteina, što sljedeći put analizirali enzimsku aktivnost tih hitinaze u želucu tkiva. Prvo smo analizirali AMCase aktivnost u miša i čovjeka želučanog tkiva. Miš AMCase pokazuje dvostruku pH optimuma s glavnim optimum oko pH 2 i sekundarne optimum oko pH 5 [6], a ljudski AMCase pokazuje široki optimalan pH na pH 2~pH 5 [16], [24]. Tako, izmjerili smo aktivnost chitinolytic pri pH 2,0 i pH 5,0 koristeći sintetski supstrat 4-metilumbeliferil P-D-N, N'-diacetylchitobiose (4MU-chitobiose) [6], [21]. Otkrili smo robusni chitinolytic aktivnost u ekstraktu miša želucu na pH 2.0 i jako djelovanje na pH 5.0. Nasuprot tome, nema aktivnost detektirana je u humanoj pri pH 2,0 i vrlo niska aktivnost opažena kod pH 5,0 (slika 7A, lijevo). Pregled

Standardna Chit1 Enzimski test je izveden je upotrebljavajući 4-metilumbeliferil β- DN, N ', N' '- triacetylchitotriose (4MU-chitotriose) pri pH 5,2 [6], [10], [21], [25]. Za praćenje učinka AMCase na aktivnost Chit1, analizirali smo chitinase aktivnost pomoću 4MU-chitotriose na pH 2,0. Relativno jak hitinaza djelovanje protiv 4MU-chitotriose je otkriven u ekstraktu miša želuca pri pH 2,0 (Slika 7A desno), a također otkriti slabu chitinase aktivnost pri pH 5,2 (Slika 7A desno). Jer AMCase ima drugu optimuma na oko pH 5, ovi rezultati pokazuju da je većina chitinolytic aktivnosti kod pH 5.2 može biti zbog AMCase nego Chit1 i da miš AMCase može hidrolizirati 4MU-chitotriose kao supstrat pri pH 2.0. Uzeti zajedno, većina chitinase aktivnosti u mišjem želucu posljedica AMCase aktivnosti. U ekstraktu ljudskom želucu također uočeno je vrlo slaba, ali mjerljive razine od chitinolytic aktivnosti na pH 2.0 i pH 5.2 (Slika 7A, desno, donji dio slike). Hitinaza aktivnost pri pH 5,2 bio je usporediv s onim kod pH 2.0, što ukazuje na Chit1 ekspresiju u ljudskom želucu, pregled

Konačno, analizirali smo razine ekspresije proteina pomoću Western blot uporabom antitijela AMCase. Anti-AMCase protutijela su generirani od ranije izvijestili miša peptida [14] i ljudske kolege. Anti-mišji AMCase antitijela prepoznali robustan jednu proteinsku vrpcu u ekstraktu od miša želudac, ali ne od čovjeka (Slika 7B, lijevo). Slično anti-humani AMCase antitijela također prepoznao jednu vrpcu u ekstraktu miša (Slika 7B, desno). U ljudskom ekstrakta su blijedih vrpci nešto veće molekularne težine koje su priznate obje ljudske i mišjih antitijela (slika 7b). Budući da nije bilo značajnog hitinaza aktivnost na oba pH 2,0 ili pH 5,0 prati pomoću 4MU-chitobiose u ekstraktu ljudskom želucu, ovi bendovi ne mogu biti u vezi s ljudskom AMCase. Prema tome, chitinolytic aktivnosti i relativne razine ekspresije proteina između miša i ljudskih želučanog tkiva su bili u skladu s našim podacima dobivenim na razini mRNA.

Rasprava

Prethodne studije o in vivo
reguliranje Chit1 i AMCase u čovjeka i miša su provedena upotrebom Sjeverno bugačenje, semi-kvantitativni PCR u realnom vremenu PCR [6], [8], [9], [13], [14], [22] [23]. Iako ove metode imaju nekoliko prednosti u odnosu na ispitivanje ekspresije gena obrazaca, nisu za usporedbu razina različitih prijepisa gena na istoj razini. U trenutnoj studiji, koja se primjenjuje smo našu metodologiju [17] istražiti razinu ekspresije ovih hitinaze u ljudskim tkivima. Nadalje, za procjenu razine ekspresije hitinaze u miša i čovjeka tkiva, razvili smo kvantifikaciju sustav pomoću jednog čovjeka i miša hibridni standardne DNK. Pokazali smo tkivno i izraz za vrstu specifične dviju aktivnih hitinaze sisavaca, Chit1 i AMCase. Naši podaci općenito podržava prethodne studije objavljene od strane Boot et al [6], [21]. Međutim, naša analiza je dovoljno osjetljiv za otkrivanje mRNA i pruža sveobuhvatan pregled genske ekspresije obrascima hitinaze u miša i čovjeka tkiva na istoj razini. Pregled

Jedan primjetna karakteristika ekspresiju hitinaze sisavaca je konzervirana izraz Chit1 između čovjeka i miša pluća tkiva. otkrili smo da Chit1 izražena na relativno visokoj razini u humanim i mišjim tkivima pluća koji su gotovo usporediti jedni s drugima, što ukazuje da je razina ekspresije mRNA Chit1 očuvana. U plućima, Chit1 može djelovati kao dio obrambenog sustava domaćina koja štiti od patogena hitina koji sadrže, kao što su gljivice i grinje [25]. Očuvanje ekspresije Chit1 gena u ljudi i miševa pokazuje fiziološku ulogu Chit1 u plućima. Pregled

Ekspresija hitinaze u želucu je od posebnog interesa. AMCase mRNA je sintetiziran na izvanredno visokim razinama u miša želudcu, ali ne u ljudskom želucu (Slika 6B). Usporedba tih razina ekspresije pokazala da je razina AMCase mRNA u ljudskom želucu je oko 1/2800 u koji je na mišjem kolega. Potvrdili smo da je razina ekspresije pepsinogen C mRNA i dva održavanje geni bili su vrlo visoko u miša i čovjeka želučanog tkiva (Slika 6b). Tako, smanjena razina ekspresije AMCase mRNA u ljudskom želucu nisu zbog degradacije RNA tijekom pripreme cDNA. Nadalje, utvrdili smo da je miš u želucu izrazio veliku količinu AMCase, dok ljudski pandan nije (slika 7). Ovi rezultati pokazuju da je razina izraz AMCase u želucu tkiva značajno se razlikuje između ljudi i miševa. Pregled

Želudac je važan organ koji ima temeljnu ulogu u probavi hrane i zaštite od štetnih organizama. Klorovodične kiseline se luči u želucu, stvarajući kiselim uvjetima (pH = ~2) prikladne za probavu proteina pepsinskom [19], [26]. Murine AMCase pokazuje stabilnost duboku kiseline te je najaktivniji na oko pH 2 [6]. Miš u želucu stvara ogromnu količinu AMCase mRNA [17] i prijevod proizvoda (slika 7). Prema tome, AMCase može funkcionirati kao probavni enzim koji razgrađuje hrane hitin sadržava u mišjem želuca. Pregled

Suprotno, razina ekspresije AMCase mRNA i njegove produkt su relativno niske u ljudskom želucu (slika 5, Slika 6 i Slika 7). To nije neočekivano, jer su moderni ljudi ne jedu značajnu količinu hrane hitina koji sadrže. Ovi rezultati sugeriraju da AMCase ne može igrati ulogu u obrani od organizama hitina sadržava u ljudskom želucu. Mnoge bolesti želuca su povezane s infekcijom bakterijama egzogenim organizama. Jačina gastritisa povezane infekcija, kao što su Helicobacter pylori pregled može korelirati s djelovanjem endogenih enzima [23]. Tako ostaje pitanje rasprave je li niska razina AMCase u ljudskom želucu sudjeluje u odgovoru na želučanih poremećaja. Pregled

Visoka razina chitinolytic aktivnosti zabilježene su u ekstraktima miša želuca i crijeva [6] , Budući da postoje istaknute razlike u razinama chitinase izražavanja u želucu između čovjeka i miša, ispitali smo razine ekspresije tih hitinaze u drugim probavnim organima, uključujući i žlijezde slinovnice i malih i velikih crijeva. Naši rezultati pokazuju da su oba Chit1 and AMCase mRNA razine u tankom i debelom crijevu su vrlo niska u oba čovjeka i miša tkiva, iako je miš žlijezde slinovnice i želučane proizvedene visoke razine oba hitinaze mRNA (Slika 5). Ovi rezultati sugeriraju da hitinaza proteina sisavaca na mišjem crijeva vjerojatno proizlazi iz gornjih dijelova gastrointestinalnog trakta, kao što su žlijezde slinovnice i želuca, što je u skladu s prethodnim pojam po dizanje i suradnika [6], [21].

razina ekspresije gena Chit1 u tkivu pluća konzervira između ljudi i miševa. Nasuprot tome, razina ekspresije AMCase u želucu tkivima svojstveni vrsti. Rezultati pokazuju da regulacija ekspresije Chiti1 mRNA u plućima sačuvana tijekom evolucije, dok je smanjena ekspresija AMCase u ljudskom želucu može biti rezultat utišavanja gena. Ispitivanje regulaciji ekspresije ovih hitinaze sisavaca mogu dati uvid u patofiziološkim uloga tih enzima. Detaljan karakterizacija promotora regijama Chit1 i AMCase gena i identifikacija cis pregled - i TRANS
-acting faktori će biti potrebna za razumijevanje selektivnog gena ekspresije ovih hitinaze kod ljudi i miševa. pregled

izraz Chit1 i AMCase mRNA je inducirana u različitim patološkim stanjima. Korištenje kvantitativni sustav opisan ovdje, mi ćemo biti u mogućnosti usporediti razine hitinaza mRNA preko čovjeka i miša tkivima u realnom vremenu PCR. Ova analiza za bolje razumijevanje biološke funkcije ovih hitinaza, osobito u patofiziološkim studijama humane bolesti uporabom na životinjskim modelima. Naša metodologija primjenjuje se na kvantificiranje mRNA iz više gena između čovjeka i miša primjeraka koji koriste istu skalu. Praktična primjena ovog usporednog unakrsno vrsta ekspresije gena podataka je usporedba ljudskih bolesti s mišem i kulture stanica modela. Pregled

materijali i postupci

RNA i priprema cDNA pregled

Ljudski Ukupna RNA Master Panel II i miš Ukupna RNA Master Panel (Clontech Laboratories) kako bi se ispitala distribuciju transkripata u različitim tkivima. Humani tankog crijeva Ukupna RNA je kupljen od Clontech Laboratories. Osim toga, RNA je izolirana iz slinovnice i tankom i debelom crijevu od 3 mjeseca stari mužjaci miševa. C57BL /6J (Clear Japan) su uzgojeni u području odlagališta Riken Brain Science Institute životinja. Svi su pokusi na životinjama su provedeni u skladu s institucionalnim smjernicama. Protokol je odobren od strane Odbora za etiku u životinjama iz Riken Brain Science Institute (Odobrenje br H19-2B013). Sve operacije se izvode pomoću dietil-eter kao anestetik, a učinjeni su svi napori kako bi se smanjili patnju. Tkiva za pripremu mRNA pružili su DRS. Miyazaki i Nukina na Riken Brain Science Institute. Pripravljena je ukupna RNA iz slinovnice i tankom i debelom crijevu pomoću Trizol reagensa (Invitrogen) prema uputama proizvođača. Analizirali smo 21 različitih ljudskih tkiva i osam odraslih miša tkiva. Za uklanjanje tragova kontaminirajućih genomske DNK, uzoraka ukupne RNA pomiješa se s RQ1 RNaza-slobodne DNaze (Promega) prema preporukama proizvođača. Svaki od uzoraka ukupne RNA je podvrgnuta reverzna transkripcija pomoću slučajnih heksamera primera, kao što je prethodno opisano [17]. Pregled

Real-time PCR pregled

Osnivanje i validacija u realnom vremenu PCR sustav za ljudska tkiva su izvedeni kao što je opisano [17]; jedina iznimka je uporaba ljudskih primera. Nukleotidne sekvencije primera koje su odabrane za realnom vremenu PCR za humani sustava prikazani su na Tablici S1. Svaki uzorak je bio pojačan u tri primjerka, a svaki pokus ponovljen najmanje dva puta. Pregled

Izgradnja Standard DNA ljudskim i priprema pet ljudskih cDNA pokrivajući cijelo područje kodiranja pregled

Gradnja standardna DNA kalupa za ljudskih gena i pripravu pet humanih cDNA koji pokrivaju cjelokupnu kodirajuću regiju su izvedeni u osnovi kao što je opisano [17]; jedina iznimka je uporaba ljudskih primera. U naprijed i natrag primeri navedeni su u tablici S2. Produkti PCR-a digestirani su s odgovarajućim restrikcijskim enzimima i legirani pomoću T4 DNA ligaze. Ligirani fragmenti su amplificirani pomoću forward primer 5'-CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATG-3 'i reverznog primera 5' CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3 'i klonira u pGEM-T vektor Easy (Promega). Potvrđeni sekvence cDNA prikazani su na slici S2. Ne.

• PLoS ONE: Želudac Temperaturni rekordi otkriti Njega ponašanju i prelaska na Solid Potrošnja hrane u Unweaned sisavaca, lučke Seal Pup (Phoca vitulina)
• PLoS ONE: Serum apolipoproteina CI i C-III su smanjene u želuca bolesnika: Rezultati MALDI-Based Peptidome i Immuno-Based Klinička Assays