PLoS ONE: mælk fermenteret af Propionibacterium freudenreichii fremkalder apoptose af HGT-1 Den menneskelige Gastric Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

mavekræft er en af ​​de mest almindelige kræftformer i verden. Den "økonomisk udviklede lande" livsstil, herunder kost, udgør en risikofaktor begunstige denne kræftform. Kost modulation kan sænke fordøjelsessystemet kræfttilfælde. Blandt lovende fødevarekomponenter blev mejeri propionibakterier vist at udløse apoptose af humane colon cancerceller via frigivelse af kortkædede fedtsyrer acetat og propionat.

Metode /vigtigste resultater

En fermenteret mælk udelukkende gæret af P. freudenreichii
, blev for nylig designet. I dette arbejde blev det pro-apoptotiske potentiale i denne nye fermenteret mælk demonstreret på HGT-1 humane gastriske kræftceller. Fermenteret mælk supernatant induceret typiske træk ved apoptose, herunder kromatin kondensering, dannelse af apoptotiske legemer, DNA stigedannelse, cellecyklusstop og fremkomsten af ​​en subG1 befolkning, phosphatidylserin eksponering ved plasmamembranen ydre indlægsseddel, reaktiv ilt arter ophobning, mitokondrie transmembranpotentiale forstyrrelser, caspase aktivering og cytochrom c-frigivelse. Bemærkelsesværdigt, denne nye fermenteret mælk, der indeholder P. freudenreichii
forbedret cytotoksicitet camptothecin, et lægemiddel anvendt i gastrisk cancer kemoterapi.

Konklusioner /Signifikans

Sådanne nye probiotiske fermenteret mælk kan således være nyttige som del af et præventivt kost designet til at forebygge mavekræft og /eller som kosttilskud til at potensere kræft terapeutiske behandlinger

Henvisning:. fætter FJ, Jouan-Lanhouet S, Dimanche-Boitrel MT, Corcos L, jan G (2012) Mælk Fermenteret af Propionibacterium freudenreichii
fremkalder apoptose hos HGT-1 Menneskelig Gastrisk kræftceller. PLoS ONE 7 (3): e31892. doi: 10,1371 /journal.pone.0031892

Redaktør: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: November 15, 2011; Accepteret: 19 januar 2012; Udgivet: 19 marts, 2012 |

Copyright: © 2012 Fætter et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Conseil Régional de Bretagne gennem CBB développement indkaldelse af projekter og af Center national interprofessionnel de l'Économie LAITIERE (CNIEL) gennem af den Videnskabelige Komité for Syndifrais indkaldelse af projekter. Forskning i IRSET gruppen blev støttet af tilskud fra Ligue Nationale Contre le Cancer (Côte d'Armor, Ille-et-Vilaine, Morbihan, Vendée og Sarthe komiteer), INSERM, University of Rennes 1 og Region Bretagne. FJC modtaget en bevilling fra CNIEL (ph.d. stipendium). SJL blev støttet af Association pour la Recherche sur le Cancer (ph.d. stipendium). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kost modulerer risikoen for at udvikle mavekræft

kræft er den hyppigste dødsårsag i økonomisk udviklede lande som følge af kræft-associerede livsstilsvalg herunder rygning, fysisk inaktivitet, og "vestlig" kost [ ,,,0],1]. Faktisk er den rolle, kost i udviklingen af ​​kræft støttes stærkt af epidemiologiske undersøgelser, især med hensyn til kræft i fordøjelseskanalen. Gastrisk cancer (GC) repræsenterer den tredje type af dødelige kræftformer for mænd i verden. I 2008 blev 640.600 tilfælde af GC anslået, forårsager 464.400 dødsfald på verdensplan [1]. Denne sygdom er særlig hyppig i det østlige Asien, og i Central- og Østeuropa. De vigtigste ætiologiske faktorer involveret i gastrisk carcinogenese er kost og Helicobacter pylori
infektion. Betydelige beviser, hovedsageligt fra case-control studier, tyder på, at risikoen for at GC øges ved højt indtag af saltede, syltede eller røget traditionelt fødevarer, samt tørret fisk og kød. Tværtimod fibre, friske grøntsager og frugt, måske på grund af deres C-vitamin-indhold, viste sig at være omvendt forbundet med GC risiko [2], [3]. Virkningen af ​​naturlige /fødevarekomponenter på carcinogenese af maven er således blevet undersøgt i løbet af de seneste årtier [4] - [6]. Blandt disse, probiotika og deres evne til at hæmme udviklingen af ​​kræft tiltrak videnskabelig interesse [7], [8]. Probiotisk defineres generelt som "en levende mikroorganisme, som, når de indgives i tilstrækkelige mængder, giver en sundhedsmæssig fordel til værten" [9]. Mens nogle mikroorganismer som H. pylori
kan begunstige GC, andre kan have en gavnlig virkning ved at forebygge fordøjelsesproblemer kræftformer. Især kan udvalgte stammer af probiotiske bakterier begrænse udviklingen af ​​kræft i dyremodeller af carcinogenese [10]. Dette blev især dokumenteret for tyktarmskræft hvorimod er kendt mindre på de mulige virkninger af probiotika på GC. En mulig mekanistisk forklaring på en sådan beskyttende virkning er den situ
frigivelse af anti-kræftfremkaldende metabolitter, såsom kortkædede fedtsyrer (SCFA'er).

kortkædede fedtsyrer inducerer apoptose af cancerceller i

SCFA, herunder acetat, propionat og butyrat, er vigtige anioner af tarmindholdet og deres koncentration kan moduleres ved kosten. De blev vist at spille en central rolle i vigtige fysiologiske funktioner, herunder modulering af fordøjelsessystemet epitelceller proliferation /apoptosis balance. Dette indebærer SCFA-medieret celle-cellecyklusstandsnings, histon deacetylase hæmning og apoptose stimulering i transformerede celler, men også stimulering af differentiering i raske celler [11], [12]. Det er også blevet rapporteret, at SCFA'er butyrat og propionat både inducere apoptose i humane gastriske carcinoma cellelinier [13] - [15]. Apoptose er en naturlig fysiologisk proces tillader celle nummer regulering og udgør et mål for anti-cancer kemoterapi [16]. Apoptose tillader udtømning af cancerceller i en "ren" måde. Cancerceller fragmentet i en koordineret kædereaktion, og resterne absorberes af tilstødende væv og immunsystem [17], [18]. To vigtige apoptotiske veje er blevet beskrevet: det ydre vej, som medieres ved aktivering af dødsreceptorer og caspase 8, og den indre vej, hvor mitokondrier og caspase 9 er involveret, [16]. Generelt i cancerceller, er den apoptotiske funktion mangler, hvilket kan forklare deres vedvarende proliferation og følgelig dannelsen af ​​tumorer. Evnen til at inducere apoptose af cancerceller er således anerkendt for sin terapeutiske potentiale [16]. Da mejeriprodukter propionibakterier er i stand til at producere gavnlige pro-apoptotiske SCFA'er, kan de vise sig nyttig i forebyggelse eller behandling af kræft.

Propionibacterium freudenreichii
kan favorisere apoptotiske udtømning af fordøjelsessystemet kræftceller

Denne probiotiske Propionibacterium mejeri viste sig at inducere celledød af forskellige humane tyktarmskræft cellelinjer gennem apoptose induktion, i co-kulturer [19]. De aktive forbindelser, der udskilles i mediet, udløser den indre mitokondrielle apoptosecyklus i dyrkede humane colorektale cancerceller. Især SCFA'er acetat og propionat udgivet af P. freudenreichii
inducere apoptose ved at virke på den mitokondriske adeninnukleotid translokatoren, forårsager mitokondrier depolarisering og permeabilisering, lækage af cytochrom c og caspaseaktivering [19], [20]. Men propionibakterielle supernatanter stadig mere pro-apoptotisk end SCFA'er acetat og propionat, anvendes i de koncentrationer målt i supernatanter, hvilket antyder, at andre forbindelser kan være involveret i denne virkning. Udvalgte stammer af P. freudenreichii
forblive levende og metabolisk aktive i tarmen hos mennesker og menneskelige rotter mikrobiota-associerede hvor de producerer SCFA'er [21], [22]. Derfor blev de vist sig at øge apoptose i transformerede kolonepitelceller på sådanne rotter fodret med kræftfremkaldende 1,2-dimethylhydrazin (DMH), men ikke i kontrol sunde dem [23]. Propionibacteria kunne udgøre probiotika favoriserer tyktarmskræft forebyggelse, forudsat de når deres mål i live og metabolisk aktive. I denne sammenhæng vektoren, eller probiotiske leveringskøretøjet, blev vist at bestemme propionibakterier overlevelse og aktivitet [21], [24], [25]. Komplekse mejeriprodukter såsom yoghurt og ost, navnlig beskytte propionibakterier fra stress, men indeholder en kompleks blanding af bakterier. Det er således ikke muligt at tilskrive den gavnlige effekt til en bestemt stamme.

En fermenteret mælk blev evalueret som propionibakterier levering køretøj i denne sammenhæng

I denne undersøgelse anvendte vi en ny fødevare-grade fermenteret mælk, der kun indeholder P. freudenreichii
som eneste mikroflora. Da dette produkt indeholder både levende propionibakterier og deres aktive metabolitter, bør det bringe dem i kontakt med den gastriske slimhinde, når de indtages. Denne fermenterede mælk blev undersøgt med hensyn til HGT-1 humane gastrisk cancerceller apoptose induktion. Faktisk er propionibakterier kendt for at dræbe humane coloncancer-celler, men deres virkning på gastriske cancerceller er ukendt. Den fermenterede mælk dræbt HGT-1-celler på en tids- og dosisafhængig måde. blev observeret typiske træk ved apoptose processen, herunder levedygtigheden drop, kromatin kondensering, apoptotiske legemer 'dannelse, DNA stigedannelse, ROS produktion, mitokondrielle membranpotentiale forstyrrelse, caspase aktivering, cellecyklusstop og fremkomsten af ​​en subG1 befolkning.

Resultater

P. freudenreichii
fermenteret mælk dræber menneskelig gastrisk og kolon kræftceller

P. freudenreichii
ITG P9 voksede i 72 timer ved 30 ° C i suppleret mælk og suppleres mælk ultrafiltrat at nå til endelig population af 9,43 log _{10 kolonidannende enheder (cfu) /ml og 9,35 log 10 cfu /ml. De SCFA-koncentrationer var 26,21 mM acetat og 54,47 mM propionat (2,08 propionat /acetat forhold) i mælk fermenteret supernatant mens de var 24,00 mM og 53,32 mM (2,22 forholdet) i fermenteret mælk ultrafiltrat supernatant. Disse forhold blev forventet for propionibakterier, som generelt producerer dobbelt så meget propionat som acetat [26]. Tolv andre levnedsmiddelkvalitet mejeri Propionibacteria stammer blev også testet (se tabel S1 og figur S1). Under anvendelse af disse stammer, blev opnået tolv gærede mælk. Propionat koncentrationer varierede fra 36 til 67 mm og Propionibacteria befolkninger 9,0-9,7 log 10 cfu /ml, for de mindre og for den mest effektive belastning hhv.}

Den cytotoksiske potentiale supernatanter fremstillet af mælk eller mælk ultrafiltrat, både gæret af P. freudenreichii
ITG P9, blev undersøgt. HT-29 human colon cancerceller og HGT-1 humane gastriske cancerceller blev behandlet med disse supernatanter. Forskellige fortyndinger i området fra ½ til blev testet. Desuden blev cytotoksiciteten af ​​en blanding af 15 mM acetat og 30 mM propionat testet i koncentrationer tæt på disse ½ fortyndede supernatanter. Som positive kontroller af apoptose induktion blev kemoterapi narkotika camptothecin (4 uM) og etoposid (100 uM) anvendes til HGT-1 og HT-29-celler, hhv. Tre forskellige metoder til celledød overvågning blev sammenlignet. Som vist i figur S2, methylenblåt, MTT og trypanblåteksklusion assays gav lignende kinetik for døden. Følgelig blev methylenblåt assay anvendt i denne undersøgelse for yderligere at vurdere cellernes levedygtighed. De ikke-fermenterede mejeriprodukter (mælk eller mælk ultrafiltreringstallene) havde ingen effekt, hverken på HT-29, og heller ikke på HGT-1 cellelevedygtighed (fig. 1 A, B). Supernatanten mælk eller mælk ultrafiltrat fermenteret af P. freudenreichii
inducerede et lignende cytotoksicitet i en tidsafhængig måde i HT-29 og HGT-1-celler, og tæt på cytotoksiciteten induceret af lægemidler eller af acetat /propionat blanding. Halvmaksimal drab af HGT-1-celler forekom efter 24 timer og 26 timer ved behandling med den fermenterede mælk og fermenteret mælk ultrafiltreringstallene supernatanter henholdsvis efter 17 timer af behandlingen med camptothecin og efter 24 timers behandling med SCFA-blanding (Fig. S3) . Desuden cytotoksicitet fermenteret mejeriprodukt supernatanter i HGT-1-celler var dosisafhængig (fig. 1C). For hver undersøgt fortynding, faldet i HGT-1 cellelevedygtighed induceret af den fermenterede mælk eller fermenteret mælk ultrafiltrat var meget ens (fig 1C &.. Fig S3). Det er derfor, de næste skridt i undersøgelsen vi kun udføres med den syrnede mælk ultrafiltrat supernatant. Taget sammen indikerer disse data, at propionibakterier effektivt dræbe human colon og gastriske cancerceller, i det mindste delvist via produktionen af ​​propionat og acetat (fig. 1). Nogle andre gærede mælk, fermenteret af forskellige mejeri Propionibacteria stammer, viste lignende cytotoksiske virkninger på cancerceller (tabel S2). P. freudenreichii
ITG P9 er kendt for sin metaboliske aktivitet in vivo
[22], den tilsvarende fermenteret mælk blev yderligere undersøgt.

P. freudenreichii
fermenteret mælk inducerer typiske mærker af apoptose i humane gastriske kræftceller

Nucleus morfologi HGT-1 celler inkuberet i tilstedeværelse af P. freudenreichii
fermenteret mælk ultrafiltrat blev analyseret ved fluorescensmikroskopi efter Hoechst 33342-farvning (Fig. 2A). Den nukleare fluorescens af ubehandlede celler (kontrol) forblev uændret under tidsforløbet af eksperimentet med blå normale kerner (tid 0 timer, fig. 2aa). Under behandlingen HGT-1-celler viste de kondenserede kromatin og fragmenterede kerner karakteristika apoptotiske kerner (fig. 2AB, c), efterfulgt af fremkomsten af ​​apoptotiske legemer efter 72 timer (fig. 2AD). Inter-nukleosomal DNA fragmentering resulterer i DNA stigedannelse, et typisk tegn på apoptose [27], blev også overvåges under fermenteret mælk ultrafiltrat behandling. DNA-fragmentering blev observeret fra 24 timers behandling med fermenteret mælk ultrafiltrat (fig. 2B), og i mindre grad med camptothecin (Fig. S3). DNA-indholdet blev også kvantificeret ved flowcytometri efter propidiumiodid mærkning for at undersøge virkningen af ​​fermenteret mælk ultrafiltrat på HGT-1 cellecyklusfordeling (fig. 2C). Ubehandlede HGT-1-celler præsenteret en cellecyklusfordeling (fig. 2Ca) uden subG1 fase, som forblev uændret under tidsforløbet af eksperimentet (data ikke vist). Procentdelen af ​​celler i subG1 fase, indikerer en apoptotisk proces, steg betydeligt med tiden under fermenteret mælk ultrafiltrat behandling (fig 2C-B, Cc, Cd.): Efter 24 timer (39.24 ± 4.87%), efter 48 timer (91,63 ± 0,28 %) og efter 72 timer (94,79 ± 0,45%). Ved 48 timer og 72 timer behandling var alle cellerne var i subG1 cellecyklusfase, angivelse af den fulde død HGT-1-celler. Som en kontrol, camptothecin inducerede lignende apoptotiske kendetegnende i HGT-1-celler (fig. S4).

For at bekræfte apoptoseinduktion, phosphatdylserine translokation fra den indre til den ydre blad af plasmamembranen blev vurderet ved farvning HGT- 1-celler med en kombination af Annexin V-FITC (AV) og 7-AAD, efterfulgt af flowcytometri fluorescens analyse (fig. 3). Ubehandlede celler (0 h) præsenteret en høj andel af levende celler (AV ^{- /7AAD -; 92%) og kun 5% af cellerne blev farvet med Annexin V (Fig 3B.). Disse procentdele, i ubehandlede celler ikke ændre sig under tidsforløbet af eksperimentet (data ikke vist). Under behandlingen af ​​HGT-1-celler med ½ fortyndet fermenteret mælk ultrafiltrat i DMEMc, procentdelen af ​​celler farves kun med 7-AAD (indikerer nekrose) var meget lav (fig. 3B). Men de procentdele af celler farvet med Annexin V signifikant forøget i en tidsafhængig måde og nåede 80% efter 72 timer (fig. 3B). Derfor HGT-1 celler undergik apoptose efter behandling med P. freudenreichii
fermenteret mælk ultrafiltrat, kendetegnet ved først AV positiv farvning, hvilket indikerer phosphatidylserin eksponering, og derefter både AV- og 7-AAD positiv farvning, hvilket indikerer en senere tab af membranintegritet. Som en kontrol, camptothecin inducerede lignende apoptotiske kendetegnende (Fig S5.)}

Som SCFA virke direkte på mitokondrier blev tre vigtige mitokondriske parametre også bestemt:. Den ATm indre membran potentiale, og generering af ROS, ved hjælp af to fluorescerende prober, DiOC (6) 3 (som er A ^ m-sensitive) og DHE (som registrerer O _{2 ^{- niveau), og lokalisering af cytochrom c. Ubehandlede celler (0 h) udviste en høj fluorescens (høj A ^ m) og en lav DHE fluorescens (lav produktion af O 2 -) (. Figur 4A, B). Efter behandling med fermenteret mælk ultrafiltrat, en tidsafhængig nedgang i inkorporering af DiOC6 (3) fluorescerende probe blev observeret, afslører et tab af ATm og dermed mitochondriemembran depolarisering (fig. 4A). Procentdelene af behandlede HGT-1-celler med formindsket indre membran potentiel øget i en tidsafhængig måde at nå 96% af cellerne ved 72 timer. FCCP behandling blev anvendt som en positiv kontrol med mitokondriemembran depolarisering. Dette tab af ATm blev bekræftet af den karakteristiske tab i rød fluorescens efter JC-1-farvning (fig. 4B). Med hensyn til ROS produktion i HGT-1 celler, fermenteret mælk ultrafiltratet behandling induceret akkumulering af O 2 - betydeligt efter 48 h og 72 h behandling (figur 4C.). Denne ROS ophobning kan delvis forhindres, hvis celler er forbehandlet af ROS scavenger TEMPOL (fig. S6). Cytochrom c-frigivelse fra mitochondrier til cytoplasmaet er en central cellulær begivenhed af den apoptotiske program. Immunoblotting undersøgelse af cytoplasma-berigede fraktioner for tilstedeværelsen af ​​cytochrom c bekræftede en ændring i dets subcellulære lokalisering (fig. 4D). Cytochrom c blev påvist i cytoplasmaet fraktion fra 24 timers behandling, hvilket indikerer flytning af dette protein (Fig. 4D). Denne relocalization af cytochrom c i cytoplasmaet blev bekræftet ved immunfarvning, viser diffuse immunfarvning hele cellen efter behandling, mens afbrudte farvning før behandling (Fig. 4E).}}

P. freudenreichii
fermenteret mælk aktiverer caspaser Salg

For at bekræfte de apoptotiske mekanismer fremkaldt af fermenteret mælk ultrafiltrat i HGT-1-celler, blev behandling af caspaser 3, 8 og 9 analyseret ved western blotting og tilsvarende enzymatiske aktiviteter overvågning i HGT -1 celleekstrakter (fig. 5). Den ikke-fermenteret mælk ultrafiltrat inducerede ikke caspaseaktivering i HGT-1-celler; kun proformer af caspase-3 og -9 blev detekteret på western blot (. Figur 5A) og ingen caspase blev målt (Fig 5B.). Den fermenterede mælk ultrafiltrat supernatant, samt camptothecin eller blandingen af ​​propionat og acetat i en [2: 1] molforhold, inducerede spaltning af pro-caspase 3 og frembringelsen af ​​de aktive former af caspase-3, underenhederne p17 og p12 (fig. 5A). Aktiveringen af ​​caspase-3, som er et effektor caspase bekræftede apoptose induktion. Desuden fermenteret mælk ultrafiltrat induceret spaltning af procaspase-9, der fører til de 35 og 37 kDa processerede former. Caspase-8 blev ikke påvist i kontrol ubehandlede HGT-1-celler. Men behandling med propionibakterielle supernatanter eller C2 /C3 blandingen ført til en klar påvisning af 54 kDa proform, efterfulgt af spaltning efter 48 timer af behandlingen,

kvantificering af caspase-3, -8 og. - 9 enzymatiske aktiviteter bekræftet caspaseaktivering af både propionibakterielle metabolitter og ved camptothecin. Faktisk blev caspase-9 og -3 aktiveret på de tidligste stadier af behandlingen, mens caspase-8 syntes aktiveret senere (fig. 5B). Camptothecin og SCFA blandingen aktiveret alle de tre undersøgte caspaser. Disse data bekræftede aktiveringen af ​​indre vej af apoptose ved fermenteret mælk ultrafiltrat behandling, med en tidlig aktivering af caspase-9 og derefter af caspase-3 og -8.

P. freudenreichii
fermenteret mælk øger camptothecin cytotoksicitet

Campthotecin er et cytotoksisk quinolin alkaloid, der inhiberer DNA-enzymet topoisomerase I (Topo I) og er meget udbredt i den kemoterapeutiske behandling af GC. Vi har vist ovenfor, at propionibakterielle metabolitter inducere apoptose i HGT-1-celler via mitokondrie død pathway. Vi næste undersøgt apoptose induceret af kombinationen af ​​både camptothecin og fermenteret mælk ultrafiltrat i HGT-1-celler. Forhøjede koncentrationer af camptothecin (0, 0,25, 0,5, 1, 2 uM) i kombination med øgede koncentrationer af fermenteret mælk ultrafiltrat (0,, ⅛, ¼) blev testet på HGT-1 cellelevedygtighed og begge inducerede tab af HGT-1 levedygtighed , i en dosisafhængig måde (fig. 6). Endvidere tilsætning af fermenteret mælk ultrafiltrat forbedret betydeligt cytotoksiciteten af ​​camptothecin i HGT-1-celler (fig. 6). For eksempel 0,25 uM camptothecin og fermenteret mælk ultrafiltrat fortyndet til ⅛ førte til et tab på 8,6% og 18,6%, henholdsvis levedygtighed. Kombinationen af ​​disse to forbindelser førte til et tab cellernes levedygtighed på 29,8% (fig. 6), hvilket antyder en tilføjet cytotoksicitet virkning, når camptothecin blev kombineret med fermenteret mælk ultrafiltrat i HGT-1-celler. Derfor kombinationen index (CI), beregnet som tidligere [28], har en værdi på 1, hvilket indikerer en additiv effekt af camptothecin og fermenteret mælk ultrafiltreringstallene behandlinger.

Diskussion

En ny fermenteret mælk, der indeholder P. freudenreichii
som en eneste bakterie, blev udviklet med henblik på yderligere at undersøge den probiotiske potentiale af dette præparat mejeri af propionibakterier (revideret i [29]). I denne undersøgelse rapporterer vi, at den vandige fase af denne fermenterede mælk dræber human colon og gastriske cancerceller via metabolitter, herunder propionat og acetat, udgivet af denne bakterie. Dette begreb er baseret på de observerede cytotoksiske virkninger af P. freudenreichii
fermenteret mælk supernatanter på dyrkede HT-29 og HGT-1 cancerceller. Denne virkning blev opnået med ultracentrifugering supernatanter, dvs. den fermenterede mælk vandige fase, blottet for kaseiner, af bakterier, der viser, at de aktive forbindelser udskilles, som tidligere beskrevet for propionibakterier [19]. Af denne grund blev de fleste eksperimenter i dette arbejde udføres med fermenteret mælk ultrafiltrat (fig. 1). Vi viste for første gang, at P. freudenreichii
fermenteret mælk supernatant induceret apoptose af HGT-1 celler på en tids- og dosisafhængig måde med udseendet af klassiske morfologiske og biokemiske træk ved apoptose (kondenseret og fragmenteret chromation, DNA laddering og akkumulering af celler i subG1 cellecyklus fase).

Vi kiggede derefter hvis de cellulære mekanismer involveret i HGT-1 celledød vej lignede den mitokondrielle død vej udløst i Caco-2 og HT-29 humane tyktarmskræft celler ved P. freudenreichii
DMEMc kultursupernatanterne [19], [20]. De sub-cellulære og biokemiske begivenheder i behandlede HGT-1 celler med fermenteret mælk ultrafiltratet var ens og, i det mindste, mitokondrie Aijjm tab, ROS (O _{2 ^{-) generation, caspaser behandling og aktivering, cytochrom c flytning ind i cytoplasmaet (fig. 3, 4, 5). Fermenteret mælk supernatant induceret forarbejdning og aktivering af caspase-8, i tillæg til caspaser -3 og -9. Desuden 4A viser, at caspase-8 ikke registreres i kontrol- ubehandlede celler og i celler behandlet med camptothecin eller ikke-fermenteret mælk ultrafiltratet, på linje med manglen på sit mRNA (C. Le Jossic-Corcos, Faculty of Medicine, Brest , Frankrig, personlig kommunikation). Det skal bemærkes, at der eksisterer en tilsyneladende uoverensstemmelse mellem enzymatiske resultater, hvilket tyder caspase-8-aktivitet i camptothecin-behandlede celler, mens der ikke caspase-8 påvises i disse celler ved Western blotting. Dette kan forklares ved den manglende specificitet af Ac-IETD-AMC-substrat, som kan behandles af andre enzymer, såsom caspase -3 og -10 eller granzym B, især hvis koncentrationen af ​​sådanne enzymer er forhøjet [30], [31]. Derimod P. freudenreichii
fermenteret mælk ultrafiltrat og blandingen af ​​SCFA både forårsagede ekspression og aktivering af caspase-8. De involverede her mekanismer er ikke belyst; imidlertid caspase-8 vides at være under-udtrykt i nogle cancerceller som følge af DNA-methylering [32], [33]. Dets ekspression kan genetableres på RNA og protein niveau ved demethylering, såsom decitabin [34] og HDAC-inhibitorer [35], hvilket resulterer i demethylering af den regulatoriske sekvens af caspase-8, en stigning i caspase-8 promotoraktivitet og i re -expression af caspase-8 [32]. SCFA, såsom propionat, er HDAC-inhibitorer, hvilket fører til hyperacetylering af histoner [36]. Dette begunstiger transkription via en ændring i DNA-konformation [37] og kunne genoprette caspase-8-ekspression. Andre fødevarer fødte forbindelser blev allerede vist at genoprette caspase-8-ekspression. En injicerbar ekstrakt af Sæd coicis
(en slægtning af majs) ekstrakt viser anti-tumor aktivitet øger udtryk for caspase 8 og inducerer apoptose i HepG2-celler [38]. Diallyl disulfid, fundet i hvidløg, forøger ekspression af caspase-8, Fas og FasL i leukæmi K562-celler. En sådan regulering kan således være involveret i de pro-apoptotiske virkninger af mejeriprodukter propionibakterier og af gærede produkter, der indeholder dem. Western blotting bevisbaserede restaureret ekspression og derefter sent aktivering af caspase-8 i propionibakterielle metabolitter-behandlede HGT-1-celler, som kan forekomme som et resultat af caspase-8-aktivering af en anden caspase såsom caspase-9. Faktisk afgangen fra cytochrom c, en del af den mitokondrielle pathway, blev vist at aktivere flere caspaser herunder 2, 3, 6, 7, 8 og 10 [39]. Endvidere blev caspase-9-aktivering vist resultat i downstream-caspase-8-aktivering [40]. Følgelig caspase-9 blev vist in vitro
at aktivere caspase-3, som på skift aktiverer caspase-6, der er ansvarlig for caspase-8-aktivering [41]. Alt i alt, vores resultater bekræfter, at propionibakterielle metabolitter til stede i P. freudenreichii
fermenteret mælk fremkalde flere sub-cellulære mekanismer, der fremmer apoptose. Sådan en reaktivering af caspase-8 udtryk kunne føre til en større apoptotisk respons i HGT-1 celler behandlet med døde domæne receptorer agonister (f.eks Trail eller Fas).}}

Så vidt vi ved, er dette den første arbejde rapporterer specifikke induktion af gastrisk cancercellelinie apoptose ved et fermenteret mejeriprodukt. Fermenterede mælk, herunder yoghurt, blev foreslået at være anvendelige i forebyggelsen af ​​tyktarmskræft. Epidemiologiske data om de beskyttende virkninger af mælk og mejeriprodukter på tyktarmskræft sats gav modstridende resultater [42]. Mælk og total mejeriprodukter forbrug er forbundet med en reduktion i colorektal risiko cancer. Men dette er ikke tilfældet for alle former for mejeriprodukter og effekter varierer meget. Syrnede mælkeprodukter kan udgøre effektive levering køretøjer til at målrette beskyttende molekyler eller mikroorganismer til specifikke steder såsom fordøjelsessystemet epitel [43]. Bovint lactoferrin, en bestanddel af mælk, inducerer apoptose af colon [44] og gastriske [45] cancerceller. Udvalgte stammer af mikroorganismer til stede i gærede mælk kan også modvirke kolon carcinogenese. Følgelig yoghurt og mælkesyrebakterier udviste anti-cancer egenskaber i dyremodeller for colon carcinogenese [46]. Men lidt arbejde fokuseret på fermenterede mejeriprodukter og mavekræft. Vores arbejde tyder på, at P. freudenreichii
kunne spille en rolle i denne sammenhæng, da det ville levere både levende propionibakterier og pro-apoptotiske metabolitter til maveslimhinden. I denne forbindelse skal det bemærkes, at P. freudenreichii
klæber til fordøjelsesproblemer epitelceller og slim [47], [48]. Det blev også vist at inhibere adhæsion af agens af gastrisk cancer Helicobacter pylori
fordøjelsessystem epitelceller samt H. pylori
inducerede skader [49]. Disse egenskaber tyder på en rolle P. freudenreichii
fermenteret mælk ved profylakse af mavekræft.

Endelig vores fermenteret mælk potentialized pro-apoptotiske virkning af lægemidlet camptothecin på gastriske cancerceller. Følgelig blev levende kulturer af probiotiske lactobaciller tidligere vist at sensibilisere LS513 kolorektal cancerceller til 5-fluorouracyl [50]. Men i dette tilfælde er de probiotika alene havde ingen proapoptotiske virkning. I dette arbejde, lave doser af lægemidlet camptothecin anvendt i gastrisk cancer kemoterapi var ineffektive i at slå gastriske cancerceller. Men i overværelse af lave doser af P. freudenreichii
fermenteret mælk, de dræbte de samme celler effektivt (fig. 6). Propionibakterielle metabolitter inducerer den intrinsiske apoptose pathway ved at virke direkte på mitokondrier, mens camptothecin virker på DNA-niveau. Dette er i overensstemmelse med deres samlede potentiale i apoptoseinduktion når disse pro-apoptotiske inducere kombineres. Desuden den fermenterede mælk indeholder SFCAs, kendt som HDAC-inhibitorer kan modulere apoptose og cellecyklus i gastriske cancerceller [13], [51] samt ekspressionen af ​​cellecyklus relaterede og apoptotiske proteiner i andre cancerceller [52], [53]. Probiotika blev allerede anvendt i kliniske undersøgelser for at reducere bivirkninger af cancerkemoterapi [54]. P. freudenreichii
kan ifølge vores resultater, kan anvendes i sådanne kliniske studier. Dens synergistisk effekt kan bidrage til at sænke dosis narkotika og forbedre komforten for patienterne.

Som konklusion, en ny mælk, udelukkende fermenteret af P. freudenreichii
, induceret apoptose i HGT-1 humane gastriske kræftceller. Desuden er denne fermenteret mælk forøgede camptothecin cytotoksicitet aktivitet, stof, der anvendes i gastrisk cancer kemoterapi. Sådanne nye probiotiske fermenteret mælk kunne være af interesse som en funktionel mad for at forebygge mavekræft og /eller at potentialize terapeutiske behandlinger.

Materialer og metoder

Kemikalier

Camptothecin, etoposid , TEMPOL, acetat og propionat natriumsalte, og caspase substrater Ac-DEVD-AMC (N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-methylcoumarin), Ac-IETD-AMC (N-acetyl-Ile -Glu-Thr-Asp-7-amido-4-methylcoumarin) og Ac-LEHD-AFC (N-acetyl-Leu-Glu-His-Asp-7-amido-4-trifluormethylcoumarin) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Saint -Quentin Fallavier, Frankrig). Camptothecin blev opløst i DMSO. Slutkoncentrationen af ​​DMSO oversteg ikke 0,01%, en koncentration, der ikke inducerede nogen toksicitet. RNAse A, PI (propidiumiodid), Hoechst H33342, MitoTracker® Red CMXRos, TO-PRO-3, JC-1, 3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodid (DiOC6 (3)) og dihydroethidium (DHE) blev opnået fra Invitrogen ( Cergy-Pontoise, Frankrig). Annexin V-FITC (AV) kit og 7-aminoactinomycin-D (7-AAD) opløsning blev tilvejebragt af BD Biosciences (Pont-de-Claix, Frankrig).

• PLoS ONE: E-cadherin destabilisering Regnskab for Patogenicitet af missense mutationer i Arvelig Diffuse Gastric Cancer
• PLoS ONE: Identifikation af Serum MikroRNA'er som Novel Non-Invasive Biomarkører for tidlig påvisning af gastrisk kræft