Karakterisering af human gastrisk karcinom-relaterede methylering af 9 miR CpG øer og undertrykkelse af deres udtryk in vitro og in vivo

Karakterisering af human gastrisk karcinom-relaterede methylering af 9 miR
CpG øer og undertrykkelse af deres udtryk vitro
in vivo
Abstrakt
Baggrund
Mange MIR
gener er placeret inden for eller omkring CpG øer. Det er uklart, om methylering af disse CpG øer undertrykker miR
transskription regelmæssigt. Formålet med denne undersøgelse er at karakterisere gastrisk karcinom (GC) -relateret methylering af miR
CpG øer og dets forhold til miRNA udtryk.
Metoder
Methylering status 9 repræsentant miR
CpG øer i et panel af cellelinjer og humane gastriske prøver (herunder 13 normale biopsier, 38 gastritis biopsier, 112 par GC'ers og deres kirurgiske margin prøver) blev analyseret ved bisulfit-DHPLC og sekventering. Modne miRNA niveauer blev bestemt med kvantitativ RT-PCR. Forholdet mellem miR
methylering, transskription, GC udvikling og klinisk-patologiske karakteristika blev statistisk analyseret.
Resultater
Methylering frekvens på 5 miR
CpG øer (miR-9-1
, miR-9 -3
, miR-137
, miR-34b
, og miR-210
) gradvist steget, mens andelen af ​​methylerede miR-200b gradvist
faldt i gastrisk carcinogenese (Ps
< 0,01). Mere miR-9-1
methylering blev påvist i 62% -64% af GC prøver og 4% af de normale eller gastritis prøver (18/28 versus 2/48; Odds ratio, 41,4; P
<0,01). miR-210
methylering viste høj korrelation med H. pylori
infektion. miR-375
, miR-203
, og miR-193b
methylering kan være vært tilpasning til udviklingen af ​​GC'ers. Methylering af disse MIR
CpG øer konsekvent vist signifikant reducere de tilsvarende miRNA niveauer præsenteret i humane cellelinjer. Det omvendte forhold blev også observeret for miR-9-1
, miR-9-3
, miR-137
, og miR-200b
i gastriske prøver. Blandt 112 GC patienter, miR-9-1
methylering var en uafhængig gunstig indikator for den samlede overlevelse GC patienter i både univariate og multivariate analyse (P
< 0,02).
Konklusioner
Afslutningsvis , ændring af methylering status på 6 af 9 testede miR
CpG øer blev kendetegnet ved gastrisk carcinogenese. MIR-210
methylering korreleret med H. pylori
infektion. miR-9-1
methylering kan være et GC-specifik begivenhed. Methylering af miR
CpG øer kan markant nedregulere deres transskription regelmæssigt.
Baggrund
miRNA er en rigelig klasse af små ikke-kodende RNA, der primært regulerer genekspression på post-transkriptionel niveau. De spiller kritiske roller i fornyelse og differentiering af stamceller og medvirke til at fastholde cellelinier. Tidligere forskning har vist, at i kræft flere af miR
gener såsom miR-200b /200a /429
, MIR-21
, miR-30b
, miR-30d
, mir -31
, og miR-423
opreguleres, mens andre MIR
gener såsom miR-143
og miR-145
er nedreguleres [1-3]. Meget tyder på, at ændringer i miRNA udtryk forekommer hyppigt i mange kræftformer og disse variationer enten bidrager til carcinogenese eller afspejle den udvikling og progression af kræft.
Der er en række af veje, der kan påvirke modne miRNA niveauer i celler og væv, såsom genamplifikation eller sletning, transkriptionel opregulering eller nedregulering, post-transkriptionel behandling, og miRNA nedbrydning [4-7]. Det er velkendt, at nogle intrageniske miR
gener, såsom miR-218-2
, er koordineret transskriberet med deres vært gener gennem fælles regulering [8]. Men mange MIR
gener er extragenic og en vis andel af intragenisk miR
gener, såsom MIR-9-1
transkriberes i en vært gen-uafhængig mønster [9]. Fordi den nøjagtige promotor-regionen i de fleste MIR
gener ikke er karakteriseret, især med hensyn til de extragenic MIR
gener, de nøjagtige reguleringsmekanismer af miR
transskription er langt fra klar.
Methylering eller hypermethylering af CpG øer i regionen af ​​transskription starter sites (TSS) er almindeligt anerkendt at undertrykke gentranskription epigenetisk. I modsætning til protein-kodende gener, der kan strækker sig over flere CpG øer, den miR
gener kan være kortere end en CpG ø, og i nogle tilfælde, flere miR
gener (dvs. en miR
genklynge) kan være beliggende inden for eller flankerer et enkelt CpG ø (Yderligere fil 1: tabel S1). Afvigende methylering af CpG-øer forbundet med miR
gener, såsom lad-7a-3
og MIR-34a
, observeres hyppigt i mange cancere [10, 11]. Det er blevet foreslået, at methylering af CpG-øer, der er forbundet med MIR
gener (dvs. MIR-203
, MIR-152
, MIR-124-1
, MIR-34b /c
, miR-129-2
, miR-9-1
, miR-130 B
, miR-124-2
, og miR-181c
) måske omvendt korrelere med deres ekspressionsniveauer [12-17]. Dog er hvorvidt transskription af MIR
gener jævnligt ramt af status methylering af miR
CpG øer er ikke blevet systematisk undersøgt.
Det er velkendt, at unormal methylering eller demethylering af CpG øer i en lille andel (< 1%) af cellepopulationen kan nænsomt detekteres i cellulære heterozygotiske vævsprøver. Dette demonstrerer fordelen ved methyleringsanalyse løbet ændringer af genekspression på RNA og protein niveauer, der kun kan detekteres, når en sådan ændring er til stede i en stor andel af en cellepopulation i en prøve [18]. Vores bioinformatisk analyse viser 50, 9, og 70 ud af 721 humane MIR
gener i miRBase (Slip 14,0) er placeret under henholdsvis, flankerende, og i nærheden af ​​CpG øer (samlet vil vi henvise til disse som miR
CpG øer, Ekstra fil 1: tabel S1). Vi hypotesen, at afvigende methylering af MIR
CpG øer kan forekomme under udvikling og progression af kræft. Derfor kunne de bruges som kandidatgener ikke kun for forudsigelse af kræft prognose, men også til undersøgelse af methylering-udtryk forening in vivo
. Således CpG øer af 9 sygdomsrelaterede MIR
gener, herunder 5 extragenic mir
gener eller gen-klynger (miR-9-3
, miR-137
, miR-200b /200a /429
, miR-203
, og miR-375
) og 4 intrageniske gener eller gen-klynger (miR-9-1
, miR-34b /c
, miR-193b /365 -1
, og miR-210
), blev valgt som repræsentative gener i den foreliggende undersøgelse (Yderligere fil 1: tabel S1). Den methylering-udtryk forening for 3 af disse MIR
gener er ikke tidligere blevet etableret (Yderligere fil 1: Tabel S2) [12, 14, 19-27]. Vi oprindeligt screenet for gastrisk karcinom (GC) - eller host-relaterede afvigende miR
methylering og derefter undersøgt methylering-udtryk forening in vitro
og in vivo
. Associationer mellem klinisk-patologiske træk ved GC patienter og methylering af disse miR
CpG-øer blev også analyseret Salg Metoder
cellelinie kilder og cellekultur
Kilde information af brugte cellelinier anvendt i denne undersøgelse:. RKO celle line, leveret af Dr. Guoren Deng ved University of California San Francisco; SW480 og HCT116 blev leveret af Dr. Yuanjia Chen på Peking Union Medical College Hospital; MKN74 og 293 T fra Tokyo Medical og Dental University; PC-3 blev købt fra cellelinien Bank på det kinesiske Academy of Medical Science; HL60 og KG1a blev opnået fra Hematology Department of Peking University First Hospital; DU145 blev opnået fra Hanmi Apotek Company; Siha blev leveret af Peking University Folkets Hospital. HepG2 blev leveret af Dr. Qingyun Zhang, Calu3 og A549 af Dr. Zhiqian Zhang, H1299 og AGS af Dr. Chengchao Shou, MKN45 af Dr. Youyong Lv, og andre cellelinjer (SGC7901, BGC823, MGC803, HeLa og GES-1) af Dr. Yang Ke, alle på Peking University Cancer Hospital /Institut. Disse cellelinier blev dyrket ved 37 ° C i 5% CO 2 ved hjælp af forskellige kulturmedier. MKN45, MKN74, SGC7901, BGC823, MGC803, HL60, KG 1 a, A549, H1299, GES-1, HepG2, 293 T, DU145, og RKO blev dyrket i 90% RPMI-1640 og 10% FBS. PC-3 og AGS blev dyrket i 90% F-12 og 10% FBS. Calu3, HeLa og Siha blev dyrket i 90% DMEM og 10% FBS. SW480 og HCT116 blev dyrket i 90% DMEM: RPMI-1640 (1: 1). Og 10% FBS
Patienter og vævsprøver
Kirurgiske primære GC prøver og deres parrede ikke-kræft kirurgisk margin (SM) prøver var indsamlet fra 112 indlagte (gennemsnitsalder 59,2 år [interval, 32-79] 80 mænd og 32 kvinder, 78 ikke-hjerte-GCS og 34 cardiac GCS, 40 GCS på pTNM fase i ~ II og 59 i den fase III ~ IV) ved Peking University Cancer Hospital. Opfølgende data for alle patienter blev opsamlet i mindst fem år. Alle kliniske prøver, samt histopatologisk og opfølgning oplysninger for hvert enkelt tilfælde blev opnået i henhold til godkendte institutionelle retningslinier. Gastric biopsier fra 13 raske forsøgspersoner og 38 gastritis ambulante patienter indsamlet fra samme hospital blev brugt som ikke-kræftpatienter kontroller. Før bisulfit modifikation hver patients gastrisk genomisk DNA-prøve blev analyseret for tilstedeværelsen af ​​H. pylori
-specifik 23 S rDNA
ved en PCR-assay som tidligere [28] beskrevne. De Institutional Review Boards af Peking University Cancer Hospital og Institute godkendt undersøgelsen (É1041207), og alle patienter gav skriftligt informeret samtykke.
DNA-ekstraktion og bisulfit modifikation
Kræft cellelinje og vævsprøve genomisk DNA (1,8 ug) blev isoleret under anvendelse phenol /chloroformekstraktion [29]. De methyleret cytosin rester i DNA-prøver blev omdannet til uracilrester (bliver thymidinrester i PCR-produkter) ved tilsætning af 5 M natriumbisulfit [30]. Den Wizard® DNA Clean-Up System (Promega) blev anvendt til at oprense det bisulfit-behandlede DNA før PCR-amplifikation.
PCR-amplifikation og kvantificering af miR
CpG ø metylering af DHPLC
CpG-fri universal primer sæt blev anvendt til at forstærke miR
CpG øer ved hot-start-PCR-polymerase (Yderligere fil 1: Figur S1 og yderligere fil 1: tabel S3). Sekvenser af CpG-øer indlejrede eller flankeret disse relaterede MIR
gener blev anvendt til at designe primerne. PCR-produkterne blev derefter analyseret kvantitativt ved DHPLC på WAVE® DNA-fragmentet Analysis System [31]. Elueringsprofiler af miR-9-3
, miR-200b
, og miR-203
methylering blev analyseret med en ultraviolet detektor; andre miR
gen methylering blev påvist med posten kolonne HSX-3500 tilbehør (Transgenomic, Inc., Omaha, USA) og en høj følsomhed fluorescens (FL) detektor (excitation ved 450 nm, emission ved 520 nm) [32 ]. Methyleret og umethyleret MIR
gen PCR-produkter blev separeret ved en DNASep® analytisk søjle (Transgenomic) ved den tilsvarende delvis denatureringstemperatur (Yderligere fil 1: Tabel S3 og fig S2-10). Toparealerne svarende til de methylerede og ikke-methylerede PCR-produkter blev anvendt til at beregne andelen af ​​methylerede miR
CpG island [andelen af ​​methylerede kopier = methylering-topareal /totalt topareal] som tidligere beskrevet [33]. M.SssI-
methyleret genomisk DNA fra blodprøver blev anvendt som en positiv kontrol. Figur 1 DHPLC kromatogrammer og bisulfit sekventering af 7 miR CpG-øer i repræsentative cellelinier og gastriske vævsprøver. Både humant blod DNA perifere (blod) og dens M.Sss
I-methylerede produkter (M.BLOOD) blev anvendt som kontroller. Alle CpG steder i amplikon af hver miR
CpG ø er også opført over resultaterne af bisulfit sekventering. Hver række repræsenterer en klon; hver lyserød søjle repræsenterer en methyleret CpG site. Den tilsvarende chromatogram af hver sekventeret prøve (højre kolonne) er vist (venstre kolonne).
Bisulfit klon-sekventering
Fresh PCR-produkter af miR
CpG-øer amplificeret med CpG-free universelle primersæt blev klonet med pGEM-T Easy (Promega, Madison, USA) og sekventeret med et Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer på SinoGeneMox Company (Beijing, Kina).
Ekstraktion af RNA og detektion af modne miRNA niveau med kvantitative RT-PCR-assays
i alt 50 ng RNA blev ekstraheret fra friske vævsprøver eller cellelinjer under anvendelse af TRIzol-reagens (Life Technologies, Carlsbad, USA) ifølge fabrikantens protokol. Tilsvarende cDNA-prøver blev syntetiseret under anvendelse af TaqMan ° MicroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies) med miR
-specifik hårnåle-invers transkription (RT) -primere (specifikt for MIR-375
# RT000564, MIR-34b
# RT000427, miR-137
# RT000593, og miR-9
# RT000583). RT anvendte betingelser var 16 ° C i 30 minutter ➔ 42 ° C i 30 minutter ➔ 85 ° C i 5 min. MiRNA niveauer blev derefter analyseret under anvendelse af et TaqMan Gene Expression Master Mix kit (Life Technologies) med den tilsvarende probe og primerne (Life Technologies, MIR-375
# TM000564, MIR-34b
# TM000427, MIR-137
# TM000593, og miR-9
# TM000583). U6
(Life Technologies, # RT001093 og # TM001093) blev anvendt som den interne reference. PCR cyklusbetingelser var 95 ° C i 10 min ➔ efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 20 sek ➔ 60 ° C i 1 min. Ekspressionsniveauer af MIR-200b
MIR-210
blev bestemt ved anvendelse af en standard polyA RT-PCR-assay. Sekvenser af RT adapter primer, den universelle inverse primer og U6
primer i den regulære polyA RT-PCR assay er vist i supplerende fil 1: Tabel S5. RT-betingelserne var 55 ° C i 5 min ➔ efterfulgt af 25 ° C i 10 minutter ➔ 42 ° C i 1 time ➔ og 70 ° C i 5 minutter. PCR cyklusbetingelser var 95 ° C for10min ➔ efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 20 sekunder ➔ og 61 ° C i 1 min.
Statistisk analyse
SPSS 16.0 Trend
-test og Pearsons chi- square test blev anvendt til at analysere miR
methylering frekvensforskellen mellem normale biopsier, gastritis læsioner, GC og SM prøver. Kruskal-Wallis H
-test og One-Way ANOVA blev anvendt til at analysere MIR
methylering andel forskelle mellem normale biopsier, gastritis læsioner, GC og SM prøver. Fishers eksakte test, Pearsons Chi-square test, og Trend
-test blev anvendt til at analysere associationen mellem miR
methylering positive satser og de klinisk-patologiske træk. Mann-Whitney U
-test og Students t-test
blev anvendt til at analysere sammenhængen mellem andelen af ​​methylerede MIR
alleler og de klinisk-patologiske træk. Kaplan-Meier og Cox-proportionel risiko metoder blev anvendt til univariate og multivariate analyse til at sammenligne den samlede overlevelse af GC patienter med forskelle i methylering status miR
CpG øer. Alle statistiske tests var to-sidet, og P
< 0.05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Resultater
Karakterisering af methylering eller demethylering af 6 miR
CpG øer i forbindelse med udviklingen af ​​GCS
Vi forstærket bisulfit-behandlede skabeloner af 9 repræsentative miR
CpG øer med CpG-fri primere og udviklede 9 DHPLC assays til at analysere status methylering af CpG øer i PCR-produkter fra 4 intrageniske MIR
gener (miR-9-1
, miR-34b
, miR-193b
, miR-210
) og 5 extragenic MIR
gener (miR-9-3
, miR-137
, miR-200b
, miR-203
miR-375
), (figur 1, Yderligere fil 1: tabel S3, og Ekstra fil 1: Figur S1-S10). Disse DHPLC analyser afslørede, at methylering positive sats på 5 miR
CpG øer (miR-9-1
, miR-9-3
, miR-34b
, miR-137
, og mIR-210
) var signifikant forøget i takt med sværhedsgraden af ​​patologiske forandringer i maven. Disse resultater tyder på, at methylering af disse miR
CpG øer er relateret til udviklingen af ​​GCS (trend
-test, miR-9-1
, P <
0,001; miR-9- 3
, P <
0,001; miR-34b
, P =
0,008; miR-137
, P <
0,001; miR-210
, P
= 0,001; tabel 1). miR-9-1
methylering blev påvist i 18 af 28 GCS (følsomhed, 64%), men kun i 2 af 48 normale eller gastritis biopsier viste methylering (specificitet, 96%). Selv blev opdaget methylering af miR-200b
i næsten alle gastrisk væv prøver, at andelen af ​​methylerede miR-200b
i normale eller gastritis væv (46% ~ 100%) var signifikant højere end i både SM og GC prøver (41% ~ 47%) (Mann-Whitney U-
test, gastritis biopsier versus SMS, P =
0,001; tabel 1). Dette antyder, at miR-200b
demethylering var en GC, patient-specifikke begivenhed. Hydrogensulfit sekventering af disse miR
CpG øer bekræftede data fra DHPLC analyse (figur 1) .table 1 Methylering status miR CpG øer i maveslimhinden prøver med forskellige patologiske ændringer i GC og kontrolpatienter ikke-kræft
miR
CpG øer
Gruppe af gastriske prøver
miR
methylering
Positiv sats
Andel (%) af methyleret miR
i MIR
methylering-positive prøver
positiv sats (%)
χ
2
-værdi
Trend
-test (P
-værdi)
Median
[25% ~ 75%]
Mean
± SD
t /F /χ
2
-værdi
P
-værdi
miR-9-1
Normal
1/13 (7,7)
27,598
< 0,001 en
NA-hoteller, NA
Gastritis
1/35 (2,9)-hoteller, NA
SM
9/28 (32,1)
17 [13-30]
20 ± 4
t
= -3,039
0,005 g
GC
18/28 (64,3)
29 [19-40]
32 ± 4
miR-9-3
Normal
6/13 (46,2)
23,389
< 0,001 en
38 [31-59]
43 ± 6
F
= 1,639
0,189 h
Gastritis
15/37 (40,5)
43 [36-48]
42 ± 2
SM
26/28 (92,9)
38 [26-44]
36 ± 2
GC
26/28 (92,9)
37 [26-43]
36 ± 2
MIR-137
Normal
5/13 (38,5)
18,626
< 0,001 en
10 [4-41]
χ
2
= 8,065
0,045 d
Gastritis
24/38 (63,2)
19 [7-36]
SM
25/26 (96,4)
15 [7-40]
21 ± 3g
GC
24/26 (92,3)
36 [20-51]
37 ± 4
miR-34b

Normal
6/13 (46,2)
6,947
0,008 en
13 [7-19]
χ
2
= 0,658
0,883 d
Gastritis
13/36 (36,1)
11 [3-20]
SM
22/28 (78,6)
11 [4-18]
GC
19/28 (67,9)
10 [5-32]
miR-200b
Normal
13/13 (100)
0,486
0,922 f
54 [52-83]
χ
2
= 17,883
< 0,001 d
Gastritis
35/36 (97,2)
52 [46-100] e
SM
27/28 (96,4)
44 [40-47]
GC
27/28 (96,4)
48 [40-53]
miR-210

Normal
2/13 (15,4)
11,908
0,001 en
NA-hoteller, NA
Gastritis
13/38 (34,2)
7 [ ,,,0],5-10]
SM
22/27 (81,5)
11 [5-22]
GC
16/27 (59,3)
9 [4-16]
miR-193b
Normal
0/13
7,045
0,008 b
NA-hoteller, NA
Gastritis
2/37 (5,4)
NA
SM
7/28 (25,0)
5 [4-14]
GC
4/28 (14,3)
5 [2-12]
miR- 203
Normal
5/13 (38,5)
5,617
0,018 b
32 [29-75]
χ
2
= 2,957
0,398 d
Gastritis
20/38 (52,6)
31 [26-36]
SM
21/28 (75,0)
34 [30-36]
GC
11/28 (39,3) c
32 [29-35]
miR-375
Normal
0/13
12,266
< 0,001 b
NA
NA
Gastritis
13/38 (34,2)
3 [3-4] e
SM
16/28 (57,1)
7 [4 -14]
GC
8/28 (28,6) c
17 [8-21]
en, Trend
test, blandt Normal, Gastritis, SM og GC prøver; b, Trend
-test, blandt Normal, Gastritis, og SM prøver; c, Pearsons Chi-square test, GC versus SM: miR-203
, χ
2
= 7,292, P =
0,007; miR-375
, χ
2
= 4,667, P =
0,031; d, Kruskal-Wallis H
-test; e, Mann-Whitney U
-test: Gastritis versus SM, miR-200b
, U
= 230.000, P =
0,001; Gastritis versus GC, miR-375
, U
= 46,000, P =
0,011; SM versus GC, miR-137
, U
= 170.000, P
= 0,009; f, Pearsons Chi-square test, blandt Normal, gastritis, SM og GC prøver; g. Parret t
-test: SM versus GC, miR-137
, t
= -2,652, P =
0,014; h. En-vejs ANOVA; NA, ikke tilgængelig.
Bortset miR-9-1
miR-137
, de methylering positive satser eller andele af methyleret miR-9-3
, miR-34b
, mIR-210
, og mIR-200b
i GC'er var de samme som i SMS (tabel 1). For at validere, om methylering af nogle af disse MIR
gener er en felt-effekt sker samtidigt i begge cancerøse og ikke-kræft væv i maven på grund af den samme udsættelse for miljøfaktorer, detekteres vi de methylering data i en anden delmængde af GC og SM prøver fra 84 patienter og fandt, at den positive kurs og andelen af ​​methyleret miR-9-1
i GC'ers var stadig betydeligt højere end i SMS (60,7% mod 32,1%, Pearsons Chi-square test, P =
0,001; Sign rank test, P
< 0,001; Yderligere fil 1: tabel S4, Subset-2). Den gennemsnitlige andel af methylerede miR-137
var også signifikant højere i GC'er end SMS (Mean
± SD
, 26 ± 2 versus 38 ± 2, parret t-
test, P <
0,001). Som forventet en betydelig forskel i den positive sats eller andelen af ​​methylerede miR-9-3, blev miR-34b
, miR-210
, og miR-200b
ikke observeret mellem GC og SM prøver. Disse resultater bekræftede, at miR-9-1
miR-137
methylering var en tumor-specifik begivenhed, og at miR-9-3
, miR-34b
, og miR-210
methylering, samt miR-200b
demethylering, var en felt-effekt, der fandt sted i løbet af gastrisk carcinogenese.
Desuden
den positive sats for methyleret miR-203
og miR-375 gradvist fra normal til gastritis til SM prøver, men faldt betydeligt i GC'er sammenlignet med SMS (Pearson Chi-square test, miR-203
, P =
0,007; miR-375
, P =
0,031 tabel 1). I undergruppen-2 prøver, vi analyserede også miR-375
methylering og fundet mere miR-375
methylering i SMS end i GC'ers igen (Pearson Chi-square test, P =
0,034; Ekstra fil 1 : tabel S4). Disse data indebærer, at miR-375 Hotel (og miR-203
) methylering ikke er GC-specifikke og kan være en slags vært tilpasning i de ikke-maligne væv for udviklingen af ​​GC'ers.
MiR
methylering og H. pylori
infektion
at afgøre, om H. pylori
infektion spiller en rolle i miR
methylering, vi kiggede for H. pylori
-specifik 23 S rDNA
i gastriske prøver af genomisk DNA ved PCR og fandt, at H. pylori
-positiv steg i takt med sværhedsgraden af ​​patologiske ændringer [15,4% (2 af 13) af normale gastriske biopsier, 52,6% (20 af 38) af gastritis læsioner, og 69,0% (29 af 42) SM biopsier; tendens
-test, P =
0,001], og faldt i GC prøver (18 af 42 = 42,9%; GC'er versus SMS, Pearson Chi-square test, P
= 0,016; Yderligere fil 1: Figur S11 ). H. pylori
-positive gastritis /normale og SM prøver viste signifikant højere methylering af miR-210
methylering end H. pylori
-negative prøver (P
= 0,036 og 0,022 henholdsvis; figur 2A og B). Figur 2 Sammenligning af miR methylering i forskellige ventrikelslimhinder prøver med og uden tilstedeværelsen af ​​H. pylori. (A) Normale eller gastritis biopsier fra kontrol- ambulante patienter uden malign sygdom; (B og C) Kirurgiske margin og tumorprøver fra patienter med gastrisk carcinom, henholdsvis; H. pylori-specifikke 23 S rDNA
blev påvist ved PCR.
Inversed forhold mellem miR
methylering af CpG øer og deres tilsvarende ekspressionsniveauerne
At undersøge forholdet mellem ovennævnte afvigende miR
methylering og transkription af det tilsvarende miR
gen, vi kvantificeret de modne miRNA niveauer af miR-9-1
, miR-9-3
, miR-34b
, miR-137
, mIR-210
, mIR-200b
, (og mIR-375
), hvis status for methylering er relateret til udviklingen af ​​GC (og GC host tilpasning) som beskrevet ovenfor, i et sæt af humane cellelinjer med forskellig methylering status miR
CpG øer. status methylering af hver miR
CpG ø i disse cellelinjer blev bestemt ved DHPLC som illustreret i supplerende fil 1: Figur S2-S10. Resultater af kvantitative RT-PCR-analyser viste, at i de testede cellelinier indeholdende methylerede miR
alleler de modne miRNA niveauer af alle 6 GC-relaterede MIR
gener og en vært tilpasning miR
gen var betydeligt lavere end de påvist i cellelinjer, der indeholder methyleret MIR
alleler (Figur 3A-G). Figur 3 Forholdet mellem ekspressionsniveauet og methylering status MIR gener i humane cellelinier og gastriske vævsprøver. (A-G) Den korrelationsanalyse mellem methylering andel af miRNA CpG øer og deres modne miRNA ekspressionsniveauer i målet CpG øen methylerede og umethylerede humane cellelinjer; (H-P) Angivelse af miRNA i 20 parrede, friske gastrisk karcinom prøver; (U) Target CpG ø umethylerede cellelinjer; (M) Target CpG island methyleret cellelinier; (U /M) Target CpG ø delvist denatureret cellelinjer.
Vi analyserede yderligere miRNA niveauer af 20 par friske GC og SM prøver og fandt en signifikant højere udtryk niveau af miRNA-200b,
miRNA-375, og miRNA-210 i sms end i GC'ers (parret t
-test: Ps
≤0.030; Yderligere fil 1: Figur S12). De miRNA-137 niveauer i sms var også højere end i GC'ers, men var ikke statistisk signifikant (P =
0,059). Ekspressionsniveauerne af miRNA-9 og miRNA-34b var ens mellem SMS og GCS. Vigtigst var et omvendt forhold mellem miR
methylering og den tilsvarende udtryk niveau observeret for miR-9-1
, miR-9-3
, miR-137
, og miR-200b
i disse gastrisk vævsprøver (Spearman rang korrelationsanalyse, miR-9-1
, r
s
= -0,533, P =
0,001; miR-9-3
, r
s
= -0,464, P =
0,004; miR-137
, r
s
= -0,378, P =
0,019; miR-200b
, r
s
= -0,409, P =
0,010; Figur 3H-K). En svag omvendt methylering-udtryk forholdet blev også fundet for miR-375
i disse vævsprøver (r
s
= 0,287, P =
0,085, figur 3O). Et sådant forhold ikke blev observeret for miR-34b
miR-210 Hotel (figur 3L, N).
MiR
methylering korreleret til klinisk-patologiske karakteristika GC patienter
at undersøge muligheden for hjælp miR
methylering som en prognose indikator for GC'er, vi bestemt forekomsten af ​​methylering af 7 MIR
gener og analyseret forholdet mellem de klinisk-patologiske træk af GC og de tilsvarende methylering niveauer af disse miR
CpG øer undersøgt features

miR-9-1
methylation

miR-9-3
methylation

miR-137
methylation

miR-34b
methylation

miR-200b
methylation

miR-375
methylation

miR-210
methylation

Positive pylori
infektion.

• Tilstedeværelse af S100A9-positive inflammatoriske celler i cancervæv korrelerer med en tidlig fase kræft og en bedre prognose hos patienter med gastrisk cancer
• Har transmission af Helicobacter pylori fra mennesker forårsager et sygdomsudbrud i en koloni af Stripe-faced Dunnarts (Sminthopsis macroura)?