PLoS ONE: elektroakupunktur på ST36 mildner mavesækkens tømning og redninger Netværk af interstitielle celler af Cajal i maven af ​​diabetiske rotter

Abstrakt

Udtømning af interstitielle celler af Cajal (ICC) er certificeret i maven af ​​diabetespatienter. Selvom elektroakupunktur (EA) ved ST36 er en effektiv terapi til at regulere gastrisk motilitet, mekanismerne i EA på ST36 på gastrisk tømning og netværk af ICC mangler at blive belyst. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge virkningerne af EA på gastrisk tømning og på ændringer af ICC-netværk. Rotter blev randomiseret i kontrolgruppen, diabetiske rotter (DM), diabetiske rotter med sham EA (DM + SEA), diabetiske rotter med lav frekvens EA (DM + LEA) og diabetiske rotter med højfrekvente EA grupper (DM + HEA). Ekspressionen af ​​c-kit i hvert lag af mavevæggen blev vurderet ved Western blotting. Spredningen af ​​ICC blev identificeret ved immunolabeling af c-kit og Ki67 som apoptose af ICC blev undersøgt ved TUNEL-farvning. Resultaterne var som følger: (1) Ventrikeltømning blev alvorligt forsinket i DM-gruppen, men accelererede i LEA og HEA gruppe, især i LEA gruppen. (2) Ekspressionen af ​​c-kit i hvert lag blev reduceret tilsyneladende i DM-gruppen, men også opreguleret i LEA og HEA gruppe. (3) Rigelige prolifererede ICC (c-kit + /Ki67 +) dannelse busket netværk med c-kit + celler blev observeret i LEA og HEA gruppe, medens de apoptotiske celler (c-kit + /TUNEL +) blev næppe fanget i LEA og HEA gruppe . Kollektivt, lav og høj frekvens EA på ST36 redde beskadigede netværk af ICC ved at hæmme apoptose og øge udbredelsen i maven af ​​diabetiske rotter, hvilket resulterer i en forbedret ventrikeltømning

Henvisning:. Chen Y, Xu JJ Liu S, Hou XH (2013) elektroakupunktur på ST36 mildner mavesækkens tømning og redninger Networks af interstitielle celler af Cajal i maven på diabetiske rotter. PLoS ONE 8 (12): e83904. doi: 10,1371 /journal.pone.0083904

Redaktør: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, USA

Modtaget: August 9, 2013; Accepteret: November 8, 2013; Udgivet: December 31, 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev delvist støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 30.670.775, No. 81.270.458). Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Typer af gastrointestinal motilitet lidelser lige fra funktionel dyspepsi til gastroparese alvorligt påvirke livskvaliteten for patienter med årtiers diabetes mellitus [1]. Gastroparese, karakteriseret ved forsinket gastrisk tømning, sker op til 30% af personer med type 1 diabetes [2]. Selvom forskellige terapeutiske indgreb, herunder medicinsk behandling og nogle ikke-medicinsk behandling har været forsøgt, de helbredende virkninger for gastroparese fortsat utilfredsstillende.

Akupunktur er blevet empirisk anvendt til behandling af gastrointestinale lidelser i orientalske lande i tusinder af år. Elektroakupunktur (EA), som er en modifikation af traditionel akupunktur, er mere egnet til kliniske og grundlæggende indstillinger forskning for dens reproducerbarhed. Zusanli
(ST36) er en fælles acupoint ofte anvendes til behandling af gastrointestinale sygdomme. I de senere år er virkningen af ​​EA på ST36 på gastrisk motilitet blevet evalueret i adskillige undersøgelser. For dyr, EA ved ST36 signifikant øget gastrisk motilitet i rotter ved bevidsthed og forbedret forsinket gastrisk tømning i STZ-inducerede diabetiske rotter [3], [4]. Desuden i mennesker, EA på ST36 accelereret gastrisk tømning og lettet dyspeptiske symptomer i funktionel dyspepsi patienter og diabetespatienter personer med gastroparese [5], [6]. Selv i disse undersøgelser kun lavfrekvente EA blev vedtaget, var høj frekvens EA også rapporteret at fremme esophageal og distal colon motilitet i dyr [7], [8]. Således virkningerne af forskellig frekvens EA på gastrisk motilitet og de underliggende mekanismer henlede folks opmærksomhed.

interstitielle celler af Cajal (ICC), veletablerede som pacemakere genererer og udbreder langsomme bølger, har fået betydning i regulering af gastrointestinal motilitet i flere årtier [9]. Tre undertyper af ICC, herunder intramuskulær ICC (ICC-IM), myenteriske ICC (ICC-MY) og submukøs ICC (ICC-SM) formen intakt netværk i mavens væg [10]. Netværk af ICC er ikke statiske, selv i fysiologiske forhold; apoptose og transdifferentiering fører til ICC tab, mens ICC også kan genoprettes ved proliferation, opfyldning fra stamceller og stigende overlevelse [11], [12]. Omfattende undersøgelser har dokumenteret, at tab og skader af ICC forårsagede uorganiseret gastrointestinal motilitet i dyremodeller og patienter med diabetes [13] - [15]. For nylig rapporterede yderligere undersøgelser, at EA lettet stigningen i colon ICC i langsomme transit forstoppelse rotter og rotter efter enteroenterostomy [16], [17]. Vores seneste undersøgelse viste også, at EA på ST36 kunne genoprette forringet ICC i tyktarmen af ​​diabetiske rotter [18]. I mellemtiden er det bekymret for, at EA forfremmet spredning og hæmmede apoptose af hjernecellerne i hippocampus [19], [20]. Men der er en tom om virkningerne af EA på ST36 på ICC i diabetisk gastroparese og mekanismen, om spredning og apoptose af ICC er involveret

Derfor målene med denne undersøgelse var at:. 1) evaluere virkningerne af forskellig frekvens EA på ventrikeltømning; 2) undersøge virkningerne af EA på ST36 på ICC netværk i diabetiske rotter; 3) attestere, om den apoptose og spredning af ICC var involveret.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Rotterne fik menneskelig omsorg og denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health, med alle der er godkendt af de etiske retningslinjer fra Animal Care og brug Udvalg Tongji Medical College, Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi.

Dyr

Male Sprague-Dawley rotter vejede 250-300 g blev udvalgt i den foreliggende undersøgelse. Rotter blev opnået fra Experiment Animal Center of Tongji Medical College (Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi, Wuhan, Kina) og holdt under normale laboratorieforhold (22 ° C, 12/12 timers lys-mørke cyklus) med fri adgang til mad og sterilt vand. Efter en uge af adaptiv fodring blev dyrene officielt vedtaget i vores eksperimenter.

Diabetisk model

Efter faste natten over, men fri adgang til vand, blev modellerne etableret med en enkelt intraperitoneal injektion af streptozotocin i rotter (STZ, 60 mg /kg, dvs. 1 ml /100 g kropsvægt, Alexis Biochemicals, San Diego, Californien, USA), frisk opløst i 20 mM citratbufferopløsning (pH 4,5; Sigma, St. Louis, MO, USA) . Kontrolgruppen blev injiceret med et tilsvarende volumen af ​​citratbuffer. Alle rotter blev opstaldet i samme stand, med vand afsavn i 4 timer, men ad libitum
fodring. En uge efter injektionen blev diabetes bekræftet i forskellige tidsrum ved at måle glukose i en dråbe fuldblod opnået ved at punktere halespidsen fartøj. Et blodsukker niveau på ≥16.7 mmol /l blev taget som en standard for vellykket model. Blood glucose blev screenet punktligt før injektionen og 1., 4. og 8. uge efter injektionen. Desuden vægttab, polydipsi og polyuri var yderligere indikatorer til beviser vellykket tilskyndelse af diabetisk rotte.

Eksperimentelle protokoller

Rotter blev randomiseret i fem grupper (10 rotter hver gruppe), herunder kontrol , diabetisk gruppe (DM), diabetiske rotter med sham AE-gruppen (SEA, kun akupunktur uden elektrisk strøm, 30 min /d), diabetiske rotter med lavfrekvent EA gruppe (LEA, 10 Hz, 1-3 mA, 30 min /d ) og diabetiske rotter med høj frekvens AE-gruppen (HEA, 100 Hz, 1-3 mA, 30 min /d). EA blev gennemført på acupoint ST36 med en elektrisk stimulator (G6805-2A; Shanghai Huayi Medical Instrument Factory, Shanghai, Kina) hverdagen for 8 uger. Den elektriske strøm blev etableret efter lidt skælvende af de nedre lemmer. For at opnå det formål at eliminere indflydelsen af ​​stress, blev dyrene lov til at bevæge sig frit i deres eget kabinet under EA procedure.

Efter successiv intervention for 8 uger blev rotterne i hver gruppe testet for ventrikeltømning. Derefter blev de ofrede, og prøver af antrum blev omhyggeligt opnået. Hver prøve blev delt i flere stykker, blev en relativt lille én opbevaret ved -80 ° C i western blotting-analyse efter lag frisk fritliggende og et stykke blev anbragt i 2,5% glutaraldehyd til elektronmikroskopi, og resten blev fikseret i Zamboni fiksativ (2 % paraformaldehyd og 1,5% mættet picrinsyre opløsning i 0,1 M phosphatpufferopløsning (PBS, pH 7,4) i immunfluorescensfarvning.

Måling af gastrisk tømning

gastrisk tømning blev udført ved en modifikation som beskrevet tidligere [21]. testen måltid indeholdende phenolrødt (0,5 mg /ml) som indikator og carboxymethylcellulose (15 mg /ml) var konstant omrørt og derefter holdt ved 37 ° C. Efter fødevarer-berøvet natten over blev modtaget rotter 2 ml phenol rød måltid administreres via en sonde nål. Tredive minutter senere blev dyrene hurtigt aflivet ved cervikal dislokation. hele mave blev fjernet omhyggeligt efter ligering ved Cardia og pylorus, og derefter maven var åben og dens indhold blev hældt i et reagensglas, og vasket med 40 ml destilleret vand. Ved afslutningen af ​​eksperimentet blev NaOH-opløsning (20 ml, 1 M) blev tilsat til hvert rør for at udvikle den maksimale intensitet af farve. Absorbansen af ​​prøven aflæst ved 560 nm med et spektrofotometer (Hitachi, U-2900) var at afspejle mængden af ​​phenolrødt tilbage i maven. Hastigheden for mavetømning blev beregnet ifølge følgende formel: mavetømning (%) = 100 × (1 - X /Y), X repræsenterer absorbansen af ​​phenolrødt indsamlet fra maven af ​​dyrene aflivet 30 min efter testen måltid. Y repræsenterer absorbansen af ​​phenolrødt genvundet fra maven af ​​kontrol dyr dræbt umiddelbart efter administration af testen måltid.

Western Blotting

Friske prøver af gastrisk antrum blev fastgjort til en Sylgard fad, og hver lag blev løsrevet omhyggeligt ved skarp dissektion efter fjernelse af slimhinden. Med hjælp af fine-spidse pincet og mikrokirurgiske sakse under et dissektionsmikroskop blev opnået lag af ICC-SM, ICC-IM og ICC-MY. Alle manipulationer blev udført på is for at undgå proteintab. Og derefter prøver af ICC-SM, ICC-IM og ICC-MY blev opbevaret ved -80 ° C.

Fresh-frosne prøver blev knust til cellesuspensionen og homogeniseres i RIPA buffer (Upstate, Temecula, CA , USA) med proteasehæmmer (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Blandingen blev centrifugeret ved 12000 g i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanterne blev opsamlet som det totale protein. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved Bradford-metoden. Efterfølgende ækvivalenter af 50 mg af ekstraherede proteiner blev gradvist separeret ved 10% natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til PVDF-membran (Millipore, Bedford, MA, USA). Efterfulgt blokering specifik binding pletter med 5% fedtfri tørmælk i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,1% Tween 20 (TBST) ved stuetemperatur i 1 time, blev disse membraner inkuberet med primært antistof til anti-c-kit (1:200, Santa Cruz Biotechnology, Inc) natten over ved 4 ° C sammen med kanin-anti-muse Actin (1:400, Santa Cruz Biotechnology, Inc) tjente som intern kontrol. Efter tre vaske med TBST, membranerne inkuberet med HRP-bundet sekundært antistof (HRP-bundet kanin anti-ged og HRP-koblet gede-anti-muse, 1:5000) i 1 time ved stuetemperatur. Efterfulgt med tre vaske med TBST blev visualiseret ved kemisk reaktion med forøget kemiluminescens middel (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) og blottet blev underkastet autoradiografi. Densitometri analyse blev udført ved Mængde One-software (Bio-Rad Teknisk serviceafdeling, Version 4.6.2).

Immunofluorescens undersøgelser

For hele-mount farvning præparater, maven blev åbnet og skylles flere gange med PBS. Gastrisk antrum blev fastgjort til en Sylgard parabol og strakt til 150% af deres oprindelige størrelse, og derefter fikseret med Zamboni fiksativ i 24 timer ved stuetemperatur. De fikserede væv blev vasket med PBS og derefter slimhinden blev fjernet ved skarp dissektion. ICC-SM lokalisering ved submukøse overflade af det cirkulære muskellag, ICC-IM sammenblandingen blandt glatte muskelceller og ICC-MY sammen med myenterisk nerve plexus blev omhyggeligt fremstillet under anvendelse fin-spidse pincet og mikrokirurgiske sakse under et dissektionsmikroskop.

Immunofarvningen procedurer til påvisning ICC net og proliferation er tidligere blevet beskrevet [22]. Ki67, en nuklear protein udtrykt under alle aktive faser af celle og forsvandt i hvilende celle, er blevet anvendt til at detektere den proliferative ICC [23]. Efter vask seks gange med PBS i 1 time, blev vævene inkuberet med 5% normalt bovint serum i PBS indeholdende 0,3% Triton X-100 (PBST) i 1 time ved stuetemperatur og derefter inkuberet med primært antistof c-kit (1:100 , Santa Cruz, Californien, USA) og Ki67 (1:100, Abcam, Cambridge, UK) natten over ved 4 ° C. Efter skylning i PBST i 30 minutter, blev immunoreaktiviteten detekteret ved anvendelse Alexa Fluor 594-konjugeret sekundært antistof (æsel-anti-gede-IgG, 1:100) og Alexa Fluor 488-konjugeret sekundært antistof (æsel-anti-rabit IgG, 1:100) ved 37 ° C i 1 time, efterfulgt af skylning i PBS tre gange i 30 min, og inkuberet med DAPI (0,1 mg /ml; Sigma, St. Louis, MO, USA) i 30 min som en nuklear counter plet. Skyllet i PBS to gange, væv var udfoldet på et dias. En konfokal laser scanning mikroskop (Nikon, Japan) blev anvendt til at undersøge de immunmærket væv. For at omfatte alle de niveauer af positivt farvede celler og processer, blev den optimale Z stabling af konfokale billeder sat til 5 um intervaller.

Apoptose af ICC blev påvist med TUNEL mærkning, en apoptose afsløring Kit (Roche, Tyskland). Whole-mount præparater blev inkuberet med primært antistof c-kit (1:100, Santa Cruz, CA, USA) natten over ved 4 ° C og sekundært antistof (Alexa Fluor 594 æsel-anti-gede-IgG, 1:100) ved 37 ° C i 30 min. Under en befugtet og mørk omstændighed blev vævene inkuberet med TUNEL reaktionspuffer (mærkningsløsning: enzymopløsning = 09:01) ved 37 ° C i 1 time. Efter vasket tre gange i 30 minutter til fjernelse af uvedkommende fluorescein-dUTP og inkuberet med DAPI som en nuklear tæller plet blev prøverne observeret under et konfokalt laserscanningsmikroskop.

Elektronmikroskopi

Efter mucosa fjernet, blev enheder af antrum nedsænket i en fiksativ opløsning af 2,5% glutaraldehyd ved 4 ° C i 2 timer. Derefter blev de skyllet med 0,1 M PBS to gange i 20 minutter, post-fikseret i 1% OSO _{4 (pH 7,4) i 1 time, dehydreret med gradueret alkohol, klaret i propylenoxid og indlejret i Epon hjælp flade forme. Ultratynde snit blev opnået med en ultramikrotom (Leica ULTRACUTU, Tyskland), og farvet med blycitrat i 10 minutter før visning med et transmissionselektronmikroskop (Tecnai G ^{212, FEI, Holland).}}

Statistisk analyse

for immunfluorescensfarvning analyse, gastrisk antrum fra hvert forsøgsdyr blev udtaget på samme sted i maven. ICC blev genkendt af c-kit immunoreaktivitet og tilstedeværelsen af ​​rigelige cellulære processer. Prolifererende og apoptotisk ICC blev identificeret ved c-kit immunoreaktivitet og Ki67 /TUNEL farvet kerne omslutter med c-kit positive membranstrukturer. Ti tilfældige felter (× 200 forstørrelse, 0,2607 mm ^{2) pr hel-mount præparat blev taget til fotografier af c-kit-positive celler, c-kit + /Ki67 + og c-kit + /TUNEL + mærkede celler. Disse fotos blev også anvendt til at vurdere tykkelsen af ​​lagene i hver stabel ved hjælp af DAPI mærkede kerner som markør af de øvre og nedre grænser af lagene. Antallet af c-kit-positive celler, blev c-kit /Ki67 og c-kit /TUNEL dobbelt mærkede celler tælles med Image-ProPlus 5,0 (Media Cybernetics). Alle data blev udtrykt som gennemsnit ± SEM. Mindst ti visioner blev taget i hvert dyr. Variansanalyse (ANOVA) og t-test blev anvendt til at sammenligne forskellene mellem forskellige grupper. P-værdi mindre end 0,05 blev taget som statistisk signifikant forskel.}

Resultater

vægt Krop og blodsukkerniveauet

Efter 8 uger, hændelig død indtraf i DM-gruppen (to rotter) og i havet gruppen (én rotte). Rotterne blev screenet for samme baseline kropsvægt mellem grupperne (tabel 1). Ved udgangen af ​​1, 4 og 8 uger, blev legemsvægt DM-gruppen faldt betydeligt sammenlignet med kontrolgruppen ( P
= 0,009, 0,000 og 0,000). Der var ingen signifikant forskel mellem SMV og DM-gruppe ( P
> 0,05). Men i modsætning til DM-gruppen, blev kropsvægten forhøjet i LEA gruppen på 8 uger ( P
< 0,001) og HEA gruppe på 4 og 8 uger ( P
= 0,003, P
. < 0,001 separat)

Som vist i tabel 2, blev ingen forskelle i baseline blodsukkerniveau blandt grupperne. De diabetiske modeller blev etableret med succes med højt blodsukker niveau i DM-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen ved udgangen af ​​1, 4 og 8 uger (alle P
< 0,001). I mellemtiden, blodsukkerniveauet i havet, LEA og HEA grupper blev ikke ændret sig væsentligt i forhold til DM-gruppen (alle P
> 0,05).

Effekter af EA på gastrisk tømning

Fig.1 viste virkningerne af EA på ST36 på ventrikeltømning i forskellige grupper. Den gastriske tømning af DM-gruppen blev dramatisk forsinket i modsætning til kontrollen ( P
= 0,012). I forhold til DM-gruppen, SEA havde ingen signifikant effekt på den gastriske tømning ( P
= 0,338), men LEA og HEA markant accelereret den forsinkede gastrisk tømning fra 43,96 ± 5,02% til 69,72 ± 3,02% og til 59.06 ± 3,70% ( P
< 0,001 og P
= 0,013, henholdsvis). Sammenligning mellem LEA og HEA gruppe blev statistisk signifikans opnået ( P
= 0,04), som repræsenterer, at effekten af ​​LEA åbenbart oversteg HEA.

Effekter af EA på ekspression af c -kit

fra Fig.2, ekspressionen af ​​c-kit i hvert lag af mavevæggen blev vurderet. I ICC-IM, c-kit i DM-gruppen naturligvis var faldet sammenlignet med kontrolgruppen (0,47 ± 0,04 vs 0,69 ± 0,05, P
= 0,001). Omvendt LEA og HEA dramatisk forøget ekspression af c-kit i forhold til DM-gruppen (0,65 ± 0,04 vs 0,47 ± 0,04, P
= 0,004; 0,66 ± 0,03 vs 0,47 ± 0,04, P
= 0,002, henholdsvis). I ICC-MY, blev ekspressionen af ​​c-kit betydeligt reduceret i DM-gruppen i modsætning til kontrolgruppen (0,57 ± 0,04 vs 0,83 ± 0,05, P
< 0,001). Men signifikant forskel blev begge opnået i LEA og HEA gruppen sammenlignet med DM-gruppen (0,78 ± 0,05 vs 0,57 ± 0,04, P
= 0,002; 0,76 ± 0,04 & 0,57 ± 0,04, P
= 0,004, henholdsvis). I ICC-SM, blev c-kit af DM gruppen åbenbart mindsket på grundlag af normale niveau (0,56 ± 0,03 vs 0,77 ± 0,04, P
= 0,001). Konsekvent, LEA og HEA naturligvis forøget ekspression af c-kit i forhold til DM-gruppen ( P
= 0,003 og P
= 0,007). Imidlertid blev ingen signifikant forskel mellem SMV og DM-gruppe i ICC-IM, ICC-MY og ICC-SM ( P
= 0,597, P
= 0,853 og P
= 0,172).

effekter af EA på ICC netværk

Vekslen af ​​ICC-netværk, især ICC morfologi og densitet blev vist i Fig.3. Der var ingen signifikant forskel i lag tykkelse mellem grupperne. Forbundet med glatte muskelceller, c-kit immunoreaktivitet for ICC-IM blev observeret i musklen lag, der viser, at ICC-IM havde to polære processer danner et cellulært net i kontrolgruppen. I DM-gruppen, blev de lange processer ICC-IM svækket tilsyneladende og tætheden af ​​c-kit positive celle blev reduceret til omkring 50% af normal kontrol ( P
< 0,001). I forhold til DM-gruppen, blev ingen signifikant ændring noteret i SEA-gruppen. Dog blev en næsten intakt mobilnetværk visualiseret i LEA og HEA gruppe og tætheden af ​​c-kit positive ICC-IM næsten genoprettet til det normale niveau (begge P
< 0,001 sammenlignet med DM-gruppen ).

ICC-MY vikling omkring myentericus plexus var placeret mellem langsgående og cirkulære glatte muskulatur lag. Multipolær ICC-MY med mange grene danner en intakt mobilnetværk var klart viste i kontrolgruppen. I DM-gruppen, c-kit + celler optrådte med slanke celle organer og brækkede processer, og tætheden af ​​ICC-MY var tydeligvis faldt ( P
< 0,001). I SEA gruppen, tætheden af ​​ICC-MY blev ikke ændret signifikant i forhold til DM-gruppen ( P
= 0,762). Men der forelå et næsten intakt mobilnetværk omkring plexus myentericus og ICC-MY tæthed delvist genvundet i LEA og HEA gruppe (begge P
< 0,001 sammenlignet med DM gruppe)
<. h3> Virkninger af EA på apoptose af ICC

apoptose af ICC blev opdaget af TUNEL mærkning for at afgøre, om apoptose var involveret i mangel på ICC i diabetes (fig.4). Fra hele-mount præparater af kontrollen, blev nogle kerner af ICC farvet af TUNEL metoden i muskel lag, myenteriske lag og submucosa lag. Masser af c-kit + /TUNEL + ICC-IM, ICC-MY og ICC-SM blev observeret i DM-gruppen (18,48 ± 1,88 mm ^{-2, 26.51 ± 1.87 mm -2 og 12.03 ± 1,27 mm -2 henholdsvis). C-kit + mobilnetværk var ufuldstændige og apoptotiske ICC præsenteret som forkortede processer med færre filialer. Store antal c-kit + /TUNEL + celler blev også oversvømme i alle lag af SEA gruppen. Under gennemførelsen af ​​LEA og HEA blev apoptotiske kit + celler næppe findes i ICC-IM (1,79 ± 0,33 mm -2 og 2,05 ± 0,30 mm -2), ICC-MY (2,24 ± 0,40 mm -2 og 2,48 ± 0,40 mm -2) og ICC-SM (1,09 ± 0,25 mm -2 og 1,39 ± 0,20 mm -2). Mobilnetværk afsløret af c-kit immunfarvning viste høj tæthed og tykkelse af cellulære processer i LEA og HEA gruppe.}

Effekter af EA om spredning af ICC

I betragtning af det øgede antal ICC i LEA og HEA gruppe, Ki67-positive ICC blev fundet til at afsløre spredning af ICC i de tre lag (fig.5). I kontrolgruppen, en række af c-kit /sås Ki67 dobbelt mærkede celler i ICC-IM (8,82 ± 1,02 mm ^{-2), ICC-MY (10.64 ± 0,92 mm -2) og ICC SM (4,67 ± 0,96 mm -2). Antallet af ICC med brudte grene var bemærkelsesværdigt reduceret og de netværk var meget sparsomme med få prolifererende celler i både DM og SEA gruppen. i LEA og HEA gruppe, c-kit /Ki67 dobbelt mærkede celler i ICC-IM blev dog præget af tætliggende celle organer og relativt bipolære processer og den gennemsnitlige tæthed nåede til 18,37 ± 1,60 mm -2 og 15,27 ± 1.81 mm -2 (begge P
< 0,001). Ligeledes rigelige c-kit + /Ki67 + ICC-MY i LEA og HEA gruppe (begge P
< 0,001) danner intakte netværk med c-kit + celler udført en rund celle krop og lange slanke processer. I ICC-SM, ledsaget af en intakt netværk af ICC, tætheden af ​​prolifererende celler i LEA og HEA gruppen var relativt højere i modsætning til DM-gruppen ( P
= 0,016 og P
= 0,003).}

effekter af EA på ultrastrukturelle ændringer af ICC

Typiske ultrastrukturelle karakteristika ICC blev afsløret ved transmission elektronmikroskopi (fig.6). I kontrolgruppen, ICC-IM og ICC-Min rige af veludviklede celle organeller udvidet lange processer indeholdende mitokondrier og ru og glat endoplasmatisk reticulum. Polymorf ICC-SM placeret på det submukøse overflade af cirkulære muskellag udviste højere elektron-tætte cytoplasma, talrige mitokondrier og endoplasmatisk reticulum. I DM-gruppen blev en dramatisk fald i antallet af ICC med beskadigede ultrastrukturelle træk undersøgt ved elektronmikroskopi. Disse celler med hævede mitokondrier, forstyrret cristaed og kondenseret kromatin viste ufuldstændig membran og forkorte processer. Disse ændringer blev også set i SEA-gruppen. I LEA og HEA gruppe, antallet af ICC var signifikant øget, og de er forbundet tæt med nervefibre og glatte muskelceller, der danner synaptiske struktur og gap junctions. Klar mitokondrier våbenskjold, velordnet fordelt ru endoplasmatiske reticulum og ribosomale partikler blev anset for at være klassiske funktioner i ICC-IM, IM-MY og ICC-SM.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, vi fandt, at både lav og høj frekvens EA på ST36 undertrykte apoptose af ICC og aktiveret spredning af ICC i maven af ​​STZ-induceret diabetiske rotter. Som et resultat blev redning af ICC netværk forbundet med en forebyggelse virkning på forsinket gastrisk tømning.

Som en effektiv procedure med færre bivirkninger, EA kombineret med akupunktur og elektrisk strøm stimulering i stedet for manuelle manipulationer gradvist accepteret af vestlige lande. ST36 er en af ​​de hyppigst anvendte punkter til behandling af gastrointestinale lidelser, med indikationer, herunder: epigastriske smerter, kvalme, opkastning, dårlig appetit og abdominal udspilning. Samtidig har vores tidligere undersøgelse viste EA på ST36 kunne øge colon fremaddrivende bevægelse, men ikke observeret i gruppe med EA på ikke-akupunkter. Forsinket ventrikeltømning er en fælles karakter af diabetespatienter med gastroparese og også en af ​​de store faktorer, der bidrager til symptomerne på gastroparese. I løbet af de seneste årtier, eksperimenter i vågne rotter viste, at lavfrekvent EA (10 Hz) betydeligt hurtigere gastrisk tømning [3], [24], [25]. Derudover 100 Hz EA var effektiv til at forårsage frigivelse af dinorphin og serotonin til at inducere analgesi [26]. Selvom højfrekvent EA (100 Hz) også blev rapporteret at fremme esophageal og distal colon motilitet i dyr [7], [8], virkningerne af 100 Hz EA på gastrisk motilitet har næppe undersøgt. Således parametre (10 og 100 Hz) af EA blev udvalgt efter indledende forsøg, der er angivet stimulerende virkning af gastrointestinal motilitet. Vores resultater viste, at både lavfrekvente EA (10 Hz) og høj frekvens EA (100 Hz) ved ST36 væsentligt forbedret forsinket gastrisk tømning hos diabetiske rotter, og resultatet viste også, at virkningen af ​​lavfrekvente EA var mere dramatisk end for høj frekvens EA.

Talrige undersøgelser har vist, at ICC spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​gastrisk peristaltik, en afgørende faktor for gastrisk tømning [27], [28]. Som ICC findes i forskellige lag af gastrisk antrum i form af netværk in vivo
, ændringer af ICC netværk er værdifuldt at blive betragtet. Reduktion i antal og morfologiske ændringer af ICC-MY og ICC-IM i maven af ​​diabetiske mus blev påvist i en tidligere undersøgelse [14]. Tilsvarende blev et markant tab af ICC-IM og ICC-SM i antrum af STZ-inducerede diabetiske rotter observeret, men ICC-MY blev ikke signifikant påvirket bortset fra et tab af forbindelser med nerve strukturer [15]. Disse forskelle i resultaterne i disse to undersøgelser var sandsynligvis forbundet med dyrearter. Fra en undersøgelse af 28 patienter med gastroparese, blev et reduceret antal ICC fundet i plexus myentericus af fuld tykkelse antrale biopsier [29]. Vores resultater viste, at ICC-IM, ICC-MY og ICC-SM i antrum af STZ-induceret diabetiske rotter dramatisk reduceret baseret på teknikken med Western blotting og immunofluorescens-farvning, og endvidere den beskadigede struktur af ICC var viste ved transmissionselektronmikroskopi . Heldigvis er det rapporteret, at lavfrekvente EA forbedrer ekspressionen af ​​ICC i colon af langsomme transit forstoppelse rotter [17]. Derudover har vores tidligere undersøgelse foreslået, at både lav og høj frekvens EA genskaber udtryk for ICC i tyktarmen af ​​diabetiske rotter [18]. Men i disse undersøgelser, de undersøger ændringen af ​​ICC som helhed og virkningerne af forskellig frekvens EA på ICC i maven er ikke blevet belyst. Således virkningerne af forskellig frekvens EA på tre undertyper af ICC i maven, herunder ICC-IM, ICC-MY og ICC-SM var i fokus i denne undersøgelse. Vores resultater viste, at ekspressionen af ​​ICC i de tre lag synligt blev reddet af lav- og højfrekvente EA, hvilket antyder, at lav- og højfrekvente EA renoveret netværk af ICC-IM, ICC-MY og ICC-SM og yderligere kan bidrage til en inddrevet gastrisk tømning.

det er bemærkelsesværdigt, at balancen i ICC net hovedsageligt bestemmes af apoptose og proliferation af ICC [11], [12]. Derfor blev den mulige mekanisme på gastrisk motilitet og virkningerne på ICC netværk af EA på ST36 udforsket gennem påvisning af ændringer i proliferation og apoptose af ICC. For nylig er apoptotisk celledød rapporteret at være en løbende proces med ICC netværk og niveauet af apoptose i sund kolon angiver, at disse celler skal løbende regenereres at opretholde intakte netværk [12]. Desuden, resultater fra voksne marsvin viste, at intestinal iskæmi og reperfusionsskade førte til reduktion i antallet af ICC via apoptose som kan bidrage til gastrointestinale motilitetslidelser [30]. Desuden viste en nylig rapport, at EA terapi reducerede apoptotiske procentdel af substantia nigra celler i Parkinson rotter [31]. Nærværende undersøgelse har klart formuleret, at apoptotisk ICC opdaget af TUNEL metoder var oversvømmelse i ICC netværk af diabetisk rotte mave og spekuleret på, at udtømning af ICC-netværk også kan føre til gastrisk motilitet lidelser. Men gennem intervention af lav og høj frekvens EA stimulation, TUNEL + kerne var næppe at finde, hvilket tyder på apoptose af ICC blev reduceret til et lavt niveau som normalt.

spredning er også en anden vigtigste regulator til at opretholde netværk af ICC. Tidligere resultater har vist, at spredningen var involveret i inddrivelsen af ​​ICC, når det gik tabt i voksne dyr [32], [33].

• PLoS ONE: selvrapporterede maveproblemer i Rejsende på Cruise-Based og landbaserede Pakke Holidays
• PLoS ONE: Nikotin Dæmper Aktivering af Tissue Resident makrofager i Mouse mave gennem β2 nikotinacetylcholinreceptoren