PLoS ONE: IGFBP3, ein Transkriptions-Ziel von Homeobox D10, korreliert mit der Prognose von Magenkrebs

Abstrakt

Homeobox D10 (HoxD10) spielt eine wichtige Rolle bei der Differenzierung von embryonalen Zellen und das Fortschreiten von Brustkrebs. Unsere früheren Bericht ergab, dass die Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-Bindungsprotein-3 (IGFBP3) durch HoxD10 in Magenkrebszellen reguliert wurde; jedoch bleiben die funktionalen Rollen und die zugrunde liegenden Mechanismen der IGFBP3 bei Magenkrebs unklar. Hier fanden wir, dass die Expression von IGFBP3 nach ektopische Expression von HoxD10 upregulated wurden in Magenkrebszellen. Chromatinimmunpräzipitation Test zeigte, dass HoxD10 zu drei potentielle Regionen IGFBP3 Promotor gebunden. Exogene HoxD10 verbessert signifikant die Aktivität der Luciferase-Reporter diese Bindungsregionen in Magenkrebszellen enthalten. Weitere Daten zeigten, dass alle diese Bindungsstellen hatte Hox Bindungselement "TTAT". Immunhistochemische Färbung Ergebnisse zeigten, dass IGFBP3 Expression signifikant in 86 Magenadenokarzinomen Gewebe relativ zu ihren benachbarten, nicht-Krebsgewebe (p < 0,001) nach unten reguliert wurde. Darüber hinaus war IGFBP3 Expression signifikant niedriger als bei Magentumor mit Lymphknotenmetastasen im Vergleich zu dem ohne Lymphknotenmetastasen (p = 0,045). Patienten mit hohem Expressionsniveau von IGFBP3 zeigte eine günstige 5 Jahre Gesamtüberleben (p = 0,011). Preissturz von IGFBP3 beschleunigten Magenkrebs Zellmigration und Invasion und induziert die Expression von invasiven Faktoren, einschließlich MMP14, uPA und uPAR. So sind unsere Daten deuten darauf hin, dass HoxD10-Zielgen IGFBP3 Invasion Magenkrebszellen unterdrücken kann und begünstigt das Überleben von Patienten mit Magenkrebs

Citation:. Xue M, Fang Y, Sun G, Zhuo W, Zhong J, Qian C, et al. (2013) IGFBP3, ein Transkriptions-Ziel von Homeobox D10 ist mit der Prognose von Magenkrebs korreliert. PLoS ONE 8 (12): e81423. doi: 10.1371 /journal.pone.0081423

Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Received: 21. Juni 2013 beginnen; Akzeptiert: 13. Oktober 2013 beginnen; Veröffentlicht: 27. Dezember 2013

Copyright: © 2013 Xue et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit von der National Natural Science Foundation of China unterstützt wurde (81302070, 81272678, 81071961) (http://www.nsfc.gov.cn), nationale Grundlagenforschung Programm von China (973 Program) (2012CB945004) (www.973.gov .cn) und Forschungsfonds für das Doktoratsstudium der Higher Education of China (20100101110126) (www.cutech.edu.cn/cn/kyjj). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist die vierthäufigste Krebserkrankung und zur Zeit ist die zweithäufigste Ursache von Krebs-Todesfälle weltweit [1]. Fast die Hälfte der Magen Caner Patienten wurden bereits in die späten Stadium mit lymphatischer oder Fernmetastasen zum Zeitpunkt der Diagnose fortgeschritten und die Möglichkeit für die Chirurgie verlieren [2]. Diese Patienten haben eine schlechte Prognose und die Fünf-Jahres-Überlebensrate für Patienten mit Fernmetastasen ist weniger als 5% [3]. Das Fortschreiten von Magenkrebs wird als ein mehrstufiges Verfahren zu sein, die die Aktivierung von Onkogenen und Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen beinhaltet. Wir haben früher vorgestellt, dass homeobox D10 (HoxD10) als Tumorsuppressor diente durch das Tumorwachstum unterdrücken und Invasivität, die epigenetisch bei Magenkrebs zum Schweigen gebracht wurde [4].

HoxD10 Gen gehört zur homeobox -Superfamilie, die kodieren Transkriptionsfaktoren und Funktionen ausüben, vor allem durch die Aktivierung oder Unterdrückung von Zielgenen [5]. Amino-terminalen Arm des Hox Homeodomänen hat mehrere Kern Konsensus-Bindungselemente, einschließlich TTAT, TAAT und TTAC [6,7]. Zum Beispiel bindet HoxC8 auf diese Elemente in Promotorregionen und moduliert die Transkriptionsaktivitäten von PEDF, NCAM, Zac1 OPN und Cdh11, bestimmt durch Hoch gesamten Chromatinimmunpräzipitation Assays und globale HoxC8 DNA-Bindungsstelle Analyse [7]. Studien haben gezeigt, dass HoxD10 die Angiogenese und Zellbeweglichkeit in Endometriumkarzinom (EG) hemmt [8] und beeinträchtigt die Zelle Invasivität von Magenkrebs und Brustkrebs [4,9]. Es ist jedoch wenig über die Mechanismen der bekannt, wie HoxD10 seine Funktionen in der Karzinogenese und Tumorprogression ausübt. Wir haben systematisch die potentielle Ziele von HoxD10 durch cDNA Mikroarray gescreent und mehrere Gene identifiziert, einschließlich Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-Bindungsprotein-3 (IGFBP3), die für das Tumor unterdrückende Wirkung von HoxD10 in Magenkrebs verantwortlich sein könnten [4].

IGFBP3 ist ein wichtiger IGFBP Arten im Umlauf, die Bindung über 75% Insulin-Wachstumsfaktor-I von zirkulierenden (IGF-I) [10]. Es könnte die Zellproliferation hemmen und die Zellapoptose von mehreren Arten von Krebs, einschließlich Prostata- und Magenkarzinome [11,12] zu induzieren. Mehrere Studien haben bestätigt, dass IGFBP3 die Invasivität von Endometriumkarzinom (EG-Zellen) [13], Metastasen bei Prostatakrebs [14], und die Angiogenese in Kopf und Hals Plattenepithelkarzinom (HNSCC) [15] unterdrückt. Es wurde allgemein angenommen, daß IGFBP3 die Bindungsregion von IGF-I auf seinen Rezeptor IGF-IR blockieren könnte, wodurch die Wirkung von IGF /IGF-IR-Achse aufzuheben. Neben der Abhängigkeit der IGF /IGF-IR-Achse gibt es alternative IGF /IGF-IR unabhängig und nukleäre Translokation Wege [10]. Viele Faktoren wurden verdeutlicht die Expression von IGFBP3, einschließlich Retinsäure, Tumor-Nekrose-Faktor-α, Trichostatin A, caudal Typ homeobox 2 (CDX2) und der Methylierungsstatus von selbst [10,16] zu regulieren. Unsere bisherigen Untersuchungen zeigten, dass IGFBP3 in AGS und MKN28 Zellen nach oben reguliert wurde überexprimierenden HoxD10 [4]. Promotorregion von IGFBP3 Berücksichtigung mehrere potenzielle Bindestellen für HoxD10 hat, durch PROMO vorhergesagt wird, ein Programm für die Vorhersage von Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen [17] könnte HoxD10 direkt Spiel mit IGFBP3 in der Regulierung der Magenkrebs-Zellinvasion. Die Aufklärung dieses Netzes würde weitere Einblicke in die Rolle von IGFBP3 bei Magenkrebs.

In der vorliegenden Studie haben wir festgestellt, dass HoxD10 direkt die Promotorregionen von IGFBP3 potentiell über das TTAT Element binden konnte, reguliert somit transkriptionell seine Expression in Magenkrebs. Darüber hinaus wird das Expressionsniveau von IGFBP3 häufig bei Magenkrebs Gewebe nach unten reguliert und auf die Gesamtüberlebenszeit im Zusammenhang, was darauf hindeutet, dass IGFBP3 eine wichtige Rolle bei Magenkrebs Progression spielt. Funktionell IGFBP3 konnte die Migration und Invasion von Magenkrebszellen zu unterdrücken, zumindest teilweise durch die Regulierung dieser invasive Faktoren, einschließlich Metalloproteinase-14 (MMP14) und Urokinase-Plasminogen-Aktivator (uPA).

Materialien und Methoden

Zellkultur

Acht Magenkrebs-Zelllinien (AGS, MKN28, MKN45, NCI-N87, BGC823, HGC27, MGC803 und SGC7901) wurden von Riken Gene Bank (Tsukuba erhalten, Japan) und American Type Culture Collection (Manassas, USA). Eine nicht-malignen Magenzelllinie (GES-1) wurde von Peking Institut für Krebsforschung (Beijing, China) erhalten. Zellen wurden in RPMI 1640-Medium (Invitrogen, Carlsbad, USA) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS, Sijiqing, Huzhou, China) und bei 5% CO inkubiert _{2, 37 ° C und 95% Luftfeuchtigkeit.}

Bau von IGFBP3 Luciferase-Reporter-Plasmide

Drei verschiedene Fragmente in der Promotorregion von IGFBP3, einschließlich -2.282-56 bp (2,3 kb, pIGFBP3), -2251 ~ -2073 bp (HoxD10 Bindungsstelle I, HBSI) und -1727 ~ -943 bp (HBSII), mittels PCR wurden aus HEK-293T-Zellen Wild als Vorlage extrahierten genomischen DNA verwendet wird. HBSI umfasst HBS1 und 2 HBSII enthält von HBS3, 4 und 5, in denen HBS1-5 durch PROMO vorhergesagt werden (http://alggen.lsi.upc.es/) [17]. HBS Primersequenzen waren wie folgt: pIGFBP3, 5'-GGGGTACCCTGGACGCCTGGAGCTTT-3 'und 5'-GAAGATCTAGCAGCACCAGCAGAGTC-3'; HBSI, 5'-GGGGTACCCATTCGGCACTGAACAAG-3 'und 5'-GAAGATCTAGCCTGGACTGACCACTG-3'; HBSII, 5'-GGGGTACCGGCACTCCATTGTTCTT-3 'und 5'-GAAGATCTGAATAATAAAGACAATAAACTGG-3'. Die PCR-Fragmente wurden ligiert, in pgm-T-Vektor (Tiangen, Beijing, China), verdaut mit KpnI /BglII (Promega, Madison, USA) und dann subkloniert in die KpnI /BglII-Stellen in dem pGL3-Basic-Vektor (Promeg) zu erzeugen, pGL3-pIGFBP3-Basis-Luciferase-Reporter-Plasmide und der pGL3-Promotor-Vektor (Promega) pGL3-HBSI (II) -Promotor Luciferase-Reporter-Plasmide zu erzeugen. Alle Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

Bau von Luciferase-Reporter-Plasmide HBSS

Wir synthetisierten Oligonukleotide mit den vorhergesagten Hox-Bindungsstellen (HBSS) in den Promotorregionen von IGFBP3. HBS3 (-1700 ~ -1691bp), HBS4 (-1418 ~ -1409bp), HBS5 (-953bp ~ -944bp) und jeweils mit Single-Point-Mutante Ort (A → C), Oligonukleotide wurden wie folgt:

HBS3, 5'-CTCTTTTTATTA-3 'und 5'-CATGGAGAAAAATAATCTAG-3';

Mutant HBS3, 5'-CTCTTTTTCTTA-3 'und 5'-CATGGAGAAAAAGAATCTAG-3';

HBS4, 5'-CATTTGCTATTA-3 'und 5'-CATGGTAAACGATAATCTAG-3';

Mutant HBS4, 5'-CCTTTGCTCTTA-3 'und 5'-CATGGGAAACGAGAATCTAG-3';

HBS5, 5'-CCTTTATTATTA-3 'und 5'-CATGGGAAATAATAATCTAG-3';

Mutant HBS5, 5'-CCTTTCTTCTTA-3 'und 5'-CATGGGAAAGAAGAATCTAG-3'.

Die doppelsträngige HBSS wurden geglüht und in das stromaufwärts von pGL3-Promotorvektor Luciferase-Reporter-Plasmiden [18] zu erzeugen. Alle Konstrukte durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

Zelltransfektion

Magen cacner Zellen (BGC823 und SGC7901) wurden mit pcDNA3.1-HoxD10 oder pcDNA3.1 leeren Vektor mit Fugene HD (Promega) transfiziert . Zur Erzeugung stabiler HoxD10 Überexpression Zelllinien, über transfizierten Zellen von 400 ug /ml G418 (Merck, Darmstadt, Deutschland) für weitere 14 Tage ausgewählt wurden. Für siRNA-vermittelten Knock-Down, BGC823 und SGC7901 Zellen wurden mit negativen Kontroll-siRNA oder IGFBP3 gezielte siRNA (Qiagen, Hilden, Deutschland) transfiziert wurden HGC27 Zellen, die mit negativen Kontroll-siRNA oder HoxD10 gezielte siRNA (Genepharma, Shanghai, China) unter Verwendung von Lipofectamine RNAiMAX Reagent (Invitrogen).

Luziferase-Aktivitätstest

1,0 x 10 ^{5 BGC823 und SGC7901 Zellen wurden in 24-Well-Platten für 24 Stunden ausgesät, dann mit 0,4 ug pcDNA3.1 leeren Vektor oder pcDNA3.1 transfiziert -HoxD10, 0.04μg pGL3-basic (Promotor) leeren Vektor oder pGL3-pIGFBP3 (HBS) -grund (Promotor) und 0.004μg pRL-TK-Vektor (Promega), die Referenzkontrolle Renilla mit Fugene HD [18]. Luciferaseaktivität durch den Dual-Luciferase-Reporter-Assay-System nach 48h nach Protokollen des Herstellers (Promega) analysiert.}

Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)

In stabilen HoxD10 überexprimiert BGC823 und SGC7901 Zelllinien, das Chromatin wurde mit HoxD10 monoklonaler Antikörper (Kaninchen, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, USA) [19] oder normalem Kaninchen-IgG (negative Kontrolle) nach der einfachen ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit (Cell Signaling Technology Inc., Danvers immunpräzipitiert , USA). Gefällte DNAs oder 2% Eingangs Proben mit genomischer DNA aus HEK-293T Wild Zellen wurden mit Taq-DNA-Polymerase (Takara, Otsu, Japan) verstärkt [20,21]. Vier Primer HBSS in den verschiedenen Stellen von IGFBP3 Promotor umfassenden wurden wie folgt aufgebaut: A1 (-2251 ~ -2073 bp, für HBS1 und 2), 5'-CATTCGGCACTGAACAAG-3 'und 5'-AGCCTGGACTGACCACT-3'; A2 (-1765 ~ -1633 bp, für HBS3,), 5'-CATAAGAAAATGACGGTGCT-3 'und 5'-TGGAAAGATCAATTTCGTTCC-3'; A3 (-1470 ~ -1364bp für HBS4,), 5'-AAGATTAACTTCACCCAAGGC-3 'und 5'-AGGTGGATAGGTGACTTG-3'; A4 (-1153 ~ -877bp, für HBS5,), 5'-GCCGACAGGAGTTACAG-3 'und 5'-TGTTCTTCTTGTCTTGGGTA-3'.

Reverse Transkription-PCR

Die Gesamt-RNA isoliert wurde mit Trizolreagenz (Cwbiotech, Beijing, China). Die reverse Transkription (RT) -PCR wurden mit M-MLV-Reverse-Transkriptase (Takara) und Taq DNA Polymerase bestimmt. Die folgenden Primer wurden für die Amplifikation verwendet:

GAPDH, 5 'GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3' und 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3 '; HOXD10, 5'-AAAGTCTCCCAGGTGGAGAG-3 'und 5'-TGCTGGTTGGTGTATCAGAC-3'; IGFBP3, 5'-CCAAGCGGGAGACAGAAT-3 'und 5'-CTTTGGAAGGGCGACACT-3';

MMP2, 5'-ACGACCGCGACAAGAAGTAT-3 'und 5'-ATTTGTTGCCCAGGAAAGTG-3';

MMP7, 5'-GGTATGGGACATTCCTCTGA-3 'und 5'-TGTTCTGCCTGAAGTTTCTATT-3';

MMP9, 5'-TCGAACTTTGACAGCGACAAG-3 'und 5'-GCACTGAGGAATGATCTAAGC-3';

MMP14, 5'-GGCGGGTGAGGAATAAC-3 'und 5'-AGCATCAATCTTGTCGGTAG-3';

Gewebeinhibitor von Metalloproteinase-1 (TIMP1), 5'-GCTTCTGGCATCCTGTTGTT-3 'und 5' -GGTATAAGGTGGTCTGGTTGACT-3 ';

TIMP2, 5'-AAGCGGTCAGTGAGAAGGAA-3 'und 5'-TCTCAGGCCCTTTGAACATC-3';

uPA, 5'-CTCATCCTACACAAGGACTAC-3 'und 5'-CAGGCAGATGGTCTGTATAGT-3'; uPAR, 5'-ATTCCCGAAGCCGTTAC-3 'und 5'-GTTGCATTTGGTGGTGTT-3'.

Western-Blot

Insgesamt Proteine ​​wurden unter Verwendung extrahiert RIPA Lysepuffer (Beyotime, Haimen, China). Triton X-100 Lysepuffer verwendet wurde löslichem E-Cadherin und ß-Catenin, SDS-Lyse-Puffer wurde zu extrahieren, um unlösliche E-cadherin /ß-Catenin-Komplex [22] extrahieren. Lysate wurden auf SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und auf PVDF-Membranen übertragen (Millipore, Bedford, USA). , IGFBP3 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology Inc.), E-Cadherin (1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.), ß-Catenin (: Die Blots wurden mit HoxD10 (1000, Santa Cruz Biotechnology Inc. 1) sondiert 1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.) oder GAPDH (1: 2500, Cwbiotech) Antikörper. Die Blots wurden unter Verwendung eines Chemilumineszenz mit Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Tokyo, Japan) sichtbar gemacht. Die relativen Dichten der Proteine ​​wurden mit Bild J. Software und normiert auf GAPDH [20] quantifiziert.

Wundheilungs Assay

BGC823 und SGC7901 Zellen wurden mit IGFBP3 siRNA oder zu steuern negativen siRNA in sechs-Well-Platten und dann mit einem p10-Pipettenspitze gekratzt eine Lücke zu schaffen. Die Vertiefungen wurden mit PBS gespült, um verdrängte Zellen und frisches Medium (1% FBS für BGC823 und Serum frei für SGC7901) entfernen, wurde hinzugefügt. Drei Bilder in zufälliger Reihenfolge der verkratzten Stellen aufgenommen wurden (× 40-fache Vergrößerung) über 0h, 12h und 24h [23].

Transwell Migration und Invasion Assays

Die Zellmigration und Invasion von modifizierten Boyden bewertet wurden Transwell Kammern (Corning Inc., Corning, USA), beschichtet mit (für die Invasion) oder ohne (für Migration) Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA). siRNA-Transfektion und Verhungern Zellen in die obere Kammer plattiert wurden in Kulturmedium, das 1% FBS (BGC823) oder ohne FBS (SGC7901) Medium, enthaltend 15% FBS in die untere Kammer gegeben wurden die Zellen in der oberen Kammer sorgfältig nach der Inkubation entfernt, 16 h (für Migration) oder 36h (für die Invasion). Gewanderten Zellen wurden gefärbt mit 0,5 ug /ml DAPI Färbelösung (Roche, Penzberg, Deutschland). Die Zellzahlen wurden zufällig in fünf Feldern gezählt (400 × Vergrößerung) [24]. Eindrangen Zellen wurden mit Zell Stain Solution (Millipore) inkubiert und photographiert (× 200). Die Farbstoffmischung wurde durch Extraktionspuffer gewaschen und für kolorimetrische Messung bei 560 nm in einem Mikroplattenleser (Thermo, Boston, USA) [25,26] auf eine 96-well übertragen.

Patienten und Proben

86 Chirurgie-Patienten von einem Adenokarzinom des Magens wurden von Mai 2007 bis Februar 2008 eingeschrieben, nachdem die informierte Zustimmung zu unterzeichnen. Diese Studie wurde von Clinical Research Ethics Committee von Sir Run Run Shaw Krankenhaus der Zhejiang University genehmigt. Abgestimmte Tumorgewebe und angrenzenden tumorfreien Gewebe erhalten. Patienten klinisch-pathologischen Daten wie Geschlecht, Alter, TNM Stadien und pathologische Qualitäten wurden aus medizinischen Aufzeichnungen abgerufen. Follow-up in einem 1-Jahres-Intervall nach der Operation durchgeführt wurde, eine Krankengeschichte wurde aufgezeichnet, wenn der Patient für späteren Besuch kam. Das Follow-up war Grenzzeit August 2012 und die mittlere Nachbeobachtungszeit betrug 35 Monate (Bereich: 1-63 Monate).

Tissue Microarray und immunhistochemischen Färbung

Kerne Messung 1,5 mm in der größten Dimension wurden von nicht-nekrotischen Bereichen angepasst Tumorgewebe und angrenzenden tumorfreien Gewebe gestanzt. Tissue Microarray-Slides 4 um dicke Mikroarray-Abschnitte enthielten, wurden (mit Shanghai Superchip Company, Ltd., Shanghai, China in Zusammenarbeit) unter Verwendung von Standardtechniken konstruiert. über Nacht bei 4 ° C, und dann mit dem Envision-plus-Detektionssystem (EnVision ™ + /HRP /Rb, Dako, Kopenhagen, Dänemark) inkubiert: Objektträger wurden mit IGFBP3 Antikörper (100, Santa Cruz Biotechnology Inc. 1) inkubiert. Die Schnitte wurden in 3,3'-Diaminobenzidin-Lösung unter mikroskopischer Beobachtung und mit Hämatoxylin gegengefärbt [27] entwickelt. Gewebe von fortgeschrittenem Brustkrebs wurden als positive Kontrolle [28] gefärbt. Der Anteil der positiven Zellen in jeder Probe wurde unter dem Mikroskop quantifiziert und in vier Gruppen eingeteilt. 0: 0-5% positive Zellen; 1: 6% bis 50% positive Zellen; 2: 51% bis 75% positive Zellen und 3: 76-100% positive Zellen. Die Intensität der Färbung IGFBP3 benotet wurde wie folgt: keine Färbung = 0; schwache Färbung = 1; mäßige Anfärbung = 2; dichte Färbung = 3. Der Wert der Intensität und dem Anteil der positiven Färbung wurde als IGFBP3 Färbung Score definiert. Eine Punktzahl von 0-3 wurde als geringe Expression und 4-9 als hohe Expression betrachtet.

Die statistische Analyse

Die unterschiedliche Expression von IGFBP3 zwischen Tumorgewebe und nicht-Tumorgewebe wurde von Mann-Whitney-U-Test bestimmt. Chi-Quadrat-Test wurde verwendet, um die Beziehungen zwischen klinisch-pathologischen Eigenschaften und IGFBP3 Färbung Partituren zu analysieren. Die Wahrscheinlichkeit für das Gesamtüberleben wurde mit der Kaplan-Meier-Methode berechnet und die Differenz zwischen den Kurven wurde mit dem Log-Rank-Test ausgewertet. Ein Cutoff von p < 0,05 wurde als statistisch signifikant sein

Ergebnisse

• PLoS ONE: Cisplatin oder nicht in fortgeschrittenem Magenkarzinom: Eine systematische Übersicht und Meta-Analysis
• PLoS ONE: optimale Dauer der Fluorouracil-basierte adjuvante Chemotherapie bei Patienten mit resektablen Magen Cancer