PLoS ONE: Hochregulation von Autophagie-verwandtes Gen-5 (ATG-5) mit Chemoresistenz in menschlichen Magenkrebs assoziiert

Abstrakt

Autophagie-verwandtes Gen-5 (ATG-5) ist einer der wichtigsten Regulatoren der autophagischen Zelltod. Es hat sich als Schutz molekularen Mechanismus für die Tumorzellen im Verlauf der Chemotherapie weit betrachtet. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Expressionsmuster von ATG-5 und multidrug resistance-associated protein-1 (MRP-1) in 135 Magenkarzinome (GC) Patienten, die mit Epirubicin, Cisplatin und 5-FU adjuvante Chemotherapie (ECF behandelt wurden ) nach der chirurgischen Resektion und erforscht ihre mögliche klinische Bedeutung. Wir fanden heraus, dass sowohl ATG-5 (77,78%) und MRP-1 (79,26%) wurden in GC Patienten stark exprimiert. ATG-5-Expression signifikant mit der Tiefe der Wand invasion, TNM Phasen und entfernte Metastase von GC (P < 0,05) verbunden ist, während MRP-1-Expression signifikant mit der Tumorgröße verbunden war, die Tiefe der Wand invasion, Lymphknotenmetastasen, TNM Stufen und Differenzierungsstatus (P < 0,05). ATG-5-Expression wurde positiv mit MRP-1 (rp = 0,616, P < 0,01) korreliert. Eine erhöhte Expression von ATG-5 und MPR-1 war signifikant mit schlechten Gesamtüberlebenszeit korreliert (OS; P < 0,01) und krankheitsfreie Überleben (DFS; P < 0,01) unserer GC-Kohorte. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass ATG-5 in der Arzneimittel Zellen resistent von GC beteiligt war, die vor allem durch Autophagie regulieren war. Unsere Daten deuten darauf hin, dass hochregulierten Expression von ATG-5, einem wichtigen molekularen Funktion von Schutz Autophagie, mit Chemoresistenz in GC verbunden ist. Die Expression von ATG-5 und MRP-1 unabhängiger prognostischer Marker für die GC-Behandlung sein kann

Citation:. Ge J, Chen Z, Huang J, Chen J, Yuan W, Deng Z, et al. (2014) Hochregulation von Autophagie-verwandtes Gen-5 (ATG-5) mit Chemoresistenz in menschlichen Magenkrebs assoziiert. PLoS ONE 9 (10): e110293. doi: 10.1371 /journal.pone.0110293

Editor: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 5. August 2014; Akzeptiert: 18. September 2014; Veröffentlicht: 17. Oktober 2014

Copyright: © 2014 Ge et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Datenverfügbarkeit. Die Autoren bestätigen, dass alle Daten, die Ergebnisse sind in vollem Umfang zur Verfügung, ohne Einschränkung zu Grunde liegen. Alle relevanten Daten sind in der Papier

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von National Natural Science Foundation der Provinz Hunan, China (Nr 2012FJ6088) unterstützt wurde. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Trotz eines beträchtlichen Rückgang seiner Inzidenzrate in vielen entwickelten Ländern, Magenkrebs (GC) bleibt die am vierthäufigsten diagnostizierte Krebserkrankung und die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle weltweit [1]. In den vergangenen Jahrzehnten Standard multimodalen Behandlungsstrategien zusammen mit anderen empfohlenen Optionen (zB D2 Dissektion und adjuvante Chemotherapie) haben es versäumt, einen großen Anteil der Patienten mit GC betroffen zu heilen, vor allem für diejenigen mit fortgeschrittenen und metastasierten Erkrankungen, mit schlechteren Überlebensraten gesehen zu werden wahrscheinlich aufgrund des Vorhandenseins von Chemoresistenz während der Behandlung [2]. Daher Identifizierung neuer molekularer Ereignisse die Entwicklung dieser Bösartigkeit und seine schlechte Prognose sowie das Verständnis der Mechanismen der GC Chemoresistenz dringend für eine effektivere klinische Intervention und bessere Behandlung von Patienten erforderlich sind, zugrunde liegen.

Unter physiologischen Bedingungen Autophagie ist ein Lysosom-abhängige Selbstverdauungssystem in erster Linie verantwortlich für die Beseitigung und Verwertung von langlebigen Proteinen und beschädigt /obsolet intracellularorganelles um Zellhomöostase zu halten [3]. Die Proteine ​​und Organellen für die Vernichtung bestimmt sind, im Rahmen von "Doppelmembran" Vakuolen (Autophagosomen), gefolgt von Fusion mit Lysosomen sequestered Komplexe zu bauen, wie Autophagosomen bekannt, wo der Inhalt von lysosomalen Hydrolasen abgebaut werden [4]. Es wurde dokumentiert, dass autophagy in Reaktion auf vielen ungünstigen Bedingungen, einschließlich Nährstoffentzug, oxidativen Stress oder DNA-Schäden und dient als adaptive Zelle Mechanismus induziert werden, was schließlich Zellen ermöglicht, zu überleben und sich vermehren, während extensive oder persistent autophagy Zelltod führt [ ,,,0],5]. Beeinträchtigungen in physiologische Aktivierung, Montage und Funktion des autophagic Stoffwechselweg wurden zunehmend in einer Vielzahl von menschlichen Krebsarten beobachtet, obwohl die genaue Rolle von autophagy in Krebsentstehung und Progression gespielt noch unter Kontroverse ist. Einige Daten favorisieren die Idee, dass die Autophagie tumorigenesis unterdrückt, während andere Beweise legen nahe, dass die Autophagie der Lage ist, Tumor Initiierung auslösen und schützt Tumorzellen vor Apoptose unterziehen [6]. Interessanterweise war die Hemmung der autophagy kürzlich die Antitumoraktivität von mehreren zytotoxischen Mitteln zu verbessern gefunden. Li und Kollegen berichtet, dass autophagy als Schutzmechanismus gegen die zellulären Wirkungen von 5-FU-Behandlung und Hemmung von autophagy durch 3-Methyladenin aktiviert wurde Augmented 5-FU-induzierte Apoptose in Dickdarmkrebszellen [7], [8]. Auf der anderen Seite, einige Krebsmedikamente (zum Beispiel Cetuximab und Dasatinib) wurden nachgewiesen autophagischen Zelltod durch verschiedene Mechanismen in einigen Krebszellen [9] induzieren - [13]. Die molekulare Maschinerie, durch die Autophagie Überleben oder Tod von Tumorzellen reguliert bleibt weitgehend unklar bisher. Der autophagy Stoffwechselweg ist ein hochmodulierten dynamischen Prozess überwiegend durch die autophagy bezogenen (ATG) Familie von Genen durchgeführt, die von mehreren Schlüssel Kinasen einschließlich mTOR, PI3K /Akt, AMPK und MAPK [14], [15] bestimmt wird. ATG-5 ist ein zentraler Regulator notwendig für die Autophagie in Bezug auf seine Beteiligung an Autophagosom Dehnung [16]. Erzwungene Expression von ATG-5 sensibilisiert Tumorzellen gegen Krebs medikamentöse Behandlung sowohl In-vitro-
und in vivo
; Im Gegensatz siRNA-vermittelte Hemmung der ATG-5 teilweise Resistenz gegenüber Chemotherapie führte [17]

postoperative adjuvante Chemotherapie ist derzeit eine große Behandlung für GC. bleibt jedoch die allgemeine Wirksamkeit der Chemotherapie schlecht möglicherweise als Folge des Vorhandenseins von Multiarzneimittelresistenz (MDR) Phänotyp. Im Gegensatz zu anderen Tumorentitäten, die Expression der klassischen MDR-vermittelnden Molekülen, wie Glutathion-S-transferase und multidrug resistance gene 1 ist nicht sehr weit verbreitet in GC Gewebe, was darauf hinweist, dass es einen komplizierten Mechanismus für die Entwicklung von MDR in dieser bösartigen Erkrankung existieren [ ,,,0],18]. Als eines der klassischen arzneimittelresistenten Mechanismen, multidrug resistance-associated protein 1 (MRP1 /ABCC1) gefunden wurde, stark in GC exprimiert werden und damit eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung von MDR in GC ausüben kann [19], [20]. Es bleibt jedoch unklar, ob MRP-1-Expression mit ATG-5-Expression assoziiert ist. Und auch, ob die Autophagie in Chemoresistenz in GC-Patienten beteiligt ist unklar.

In der vorliegenden Studie haben wir zunächst die Immunhistochemie eingesetzt, um das Expressionsprofil von ATG-5 und MRP1 in einer Summe von 135 GC-Patienten zu untersuchen, die ECF erhalten (Epirubicin, Cisplatin und 5-FU) adjuvante Chemotherapie nach chirurgischer Resektion. Die Korrelationen zwischen ATG-5 und MRP-1-Expression sowie deren Expression mit verschiedenen klinisch-pathologischen Eigenschaften von GC und die klinischen Ergebnisse wurden ebenfalls bewertet.

Materialien und Methoden

Patienten und Gewebeproben

insgesamt 135 GC-Patienten von 91 Männern und 44 Frauen aus, die in der Chirurgie an der Klinik für Viszeralchirurgie, Xiangya Hospital, Central South University (CSU), China, die zwischen dem 1. Januar 2007 und dem 31. Dezember 2008 unterzog sich eingeschrieben waren diese Studie. Das durchschnittliche Alter der Kohorte war 53,62 ± 9,73 Jahre, mit einem Bereich von 26 bis 72 die Primär GC Tumor tissuesand nicht kanzerösen abgestimmt (NC) Gewebe mindestens 5 cm vom Tumorkern entfernt wurden nach der chirurgischen Resektion erhalten und sofort verarbeitet und bis zur weiteren Verwendung gelagert. Keiner der rekrutierten Patienten hatten eine Chemotherapie oder Strahlentherapie vor der Operation. Die histopathologische Diagnose wurde präoperativ durchgeführt und durch eine Operation bestätigt. Alle Teilnehmer mit Stadium IB bis IV Tumoren erhielten ECF-Chemotherapie nach der Operation (Dosis: Epirubicin 50 mg /m ^{2 am Tag 1, Cisplatin 60 mg /m 2 am Tag 1 und kontinuierliche intravenöse Infusion von 5-FU 500 mg /m 2 /d für 4 Tage, wiederholt alle 3 Wochen bis zu 24 Wochen). Die klinischen Merkmale der Patienten in der Tabelle aufgeführt wurden 1.}

Alle Fälle in dieser Studie wurden überprüft und alle Proben wurden histologisch im Oktober erneut geprüft 2012. Die Tiefe der Wand Invasion, Knoten Metastasen regionalen Lymphknoten und histologischen Grad wurden von der gleichen Gruppe von zwei erfahrenen Senior Pathologen bestätigt. Die Patienten wurden auf der Grundlage der Differenzierungsstatus von Krebszellen in drei histologischen Typen eingeteilt: gut, mittel und schlecht. Basierend auf einer Kombination von lokoregionale Tumorbeteiligung und das Vorhandensein von Metastasen wurden alle Fälle nach dem TNM-Klassifikation maligner Tumoren (TNM) Stufe Gruppierung [21] in Szene gesetzt. Für die Analyse des Überlebens, wurde der Zeitpunkt der Operation verwendet, um den Startpunkt des Follow-up-Besuch zu vertreten. Patienten, die von anderen Krankheiten gestorben, anstatt GC oder andere unerwartete Ereignisse wurden aus der Fallsammlung ausgeschlossen. Die Todesursache in dieser Studie rekrutiert war Verschlimmerung der GC. Das Gesamtüberleben (OS) wurde als eine Periode berechnet ab dem Zeitpunkt der ersten Operation zu dem Zeitpunkt des Todes beginnt, oder dem Datum der letzten Follow-up als Endpunkt. Das krankheitsfreie Überleben (DFS) wurde als das Zeitintervall von der Operation bis zum Zeitpunkt der lokalen Rückfall oder erste entfernten Organ Metastasen definiert. Schriftliche Einwilligung nach Aufklärung wurde von jedem Patienten vor der Operation erhalten und diese Studie wurde von der Forschungsethikkommission der Central South University, China genehmigt. Alle Proben wurden behandelt und anonymisiert nach den ethischen und rechtlichen Richtlinien.

Immunhistochemie

Die frischen Proben wurden in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert und anschließend mit Paraffin eingebettet. Die in Paraffin eingebetteten Gewebe wurden bei 4 &mgr; m geschnitten und dann mit Xylol und rehydriert für weitere H &deparaffinisiert; E oder Peroxidase Immunhistochemie-Färbung durch die DAKO Envision-System. gegen jeweilige Zielproteine ​​bei einer Verdünnung von 1:500 über Nacht bei (::;; ab32574 Abcam Inc., Cambridge, UK MRP1 ab54033 ATG5) kurz gesagt, folgende proteolytischen Verdau und die Blockierung mit endogener Peroxidase, wurden Gewebeschnitte mit den primären Antikörpern inkubiert 4 ° C. Nach Waschen mit PBS, Peroxidase markiertes Polymer und Substrat-Chromogen wurden dann eingesetzt, um die immnohistochemical Färbung sichtbar zu machen. Schließlich wurden counterstained Abschnitte mit Hämatoxylin, deckel schlüpfte mit Eindeckmedium und durch Lichtmikroskopie untersucht. Alle Verfahren wurden bei der Abteilung für Pathologie durchgeführt, Xiangya Hospital, C.S.U. Die Objektträger wurden unabhängig voneinander von zwei erfahrene Pathologen interpretiert, die auf Informationen der Patienten blind. Wir quantifiziert Färbeintensität und den Prozentsatz der gefärbten Zellen einen zuvor beschriebenen Ansatz [22], [23]: der Anteil der positiv gefärbten Zellen (0% -100%) von der dominanten Intensitätsmuster der Färbung multipliziert wurde, wenn man bedenkt 1 als negativ oder Spuren, 2 als schwach, 3 als moderat und 4 so stark. Daher wurden die Gesamtnote lag im Bereich von 0 bis 400 Patienten wurden anschließend in vier verschiedene Untergruppen eingeteilt: 0-99 punkten, punkten 100-199, 200-299 und 300-400 ein Tor erzielen

Western-Blot-Analyse <. br>

Ganzzellextrakte wurden unter Verwendung von 0,14 M NaCl, 0,2 M Triethanolamin, 0,2% Natriumdesoxycholat, 0,5% Nonidet P-40 und mit einem Proteaseinhibitor ergänzt (alle Produkte waren von Sigma, St. Louis, Missouri , USA). Dann Proteinprobe wurde auf eine Membran durch ein 12% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) -Gel und übertragen auszuführen. Die übertragenen Membranen wurden anschließend über Nacht bei 4 ° C mit einem primären Antikörper inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Membran mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) -verknüpften sekundären Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die primären Antikörper waren Anti-ATG-5 (Santa Cruz, CA, USA), Anti-LC3A /B (Abcam, Cambridge, UK) und Anti-β-Actin (Santa Cruz, CA, USA). Alle Ergebnisse berichteten die durchschnittlichen Verhältnisse von drei verschiedenen unabhängigen Experimenten sind.

Zellproliferationsassays

Die Zellen auf 96-Well-Platten ausgesät (10000 Zellen /Vertiefung) für 24 Stunden vor der Behandlung. MTT-Assays wurden verwendet, um die Zellproliferation zu unterschiedlichen Zeitpunkt nach der Behandlung zu beurteilen. Der MTT-Test wurde folgendermaßen durchgeführt: MTT wurde zu jeder Vertiefung gegeben und die Platten wurden für 4 h bei 37 ° C inkubiert. Das MTT Mittelgemisch wurde dann entfernt und 150 &mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Absorption wurde bei 570 nm unter Verwendung eines mehrwandigen Spektrophotometer gemessen

RNA-Interferenz

siRNA-Duplexe Targeting ATG-5 synthetisiert wurden, wie folgt: siRNA-ATG5-486. GACGUUG GUAACUGACAAATT; siRNA-ATG5-695: GUCCAUCUAAGGAUGCAAUTT und siRNA-ATG5-938: GACCUUUCAUUCAGAAGCUTT. UUCUCCGAACGUGUCACGUTT: siRNA-Duplexen, die nicht-spezifischen Sequenzen wurden als negative Kontrolle (NC) verwendet. Verschiedene siRNAs wurden getrennt in Zellen transfiziert, die Lipofectamin 2000-Reagens, und das Medium wurde 6 h nach der Transfektion ersetzt.

Real-time RT-PCR

Gesamt-RNA aus den Zelllinien und Geweben waren mit dem Trizolreagenz (Invitrogen, Carlsbad, USA) extrahiert, nach den Anweisungen des Herstellers. Die Konzentration der RNA wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen. Ein cDNA-Pool wurde mit 1 synthetisiert ug Gesamt-RNA und TaqMan Reverse-Transcription Reagents (Applied Biosystems, Foster City, USA) wie vom Hersteller beschrieben. Die Expression des Ziel-Gens wurde unter Verwendung einer relativen Quantifizierung Ansatz ausgewertet (2 ^{-ΔΔCt-Methode) mit β-Aktin als interne Referenz.}

Immunfluoreszenz Test

Die Zellen wurden permeabilisiert mit 0,3 % Triton X-100 für 10 min durch Fixierung mit 2-4% Methanal für 15 min folgte, und für 60 min mit 3% Schafserum bei Raumtemperatur blockiert. Dann wird mit primären Antikörpern anti-LC3B (Santa Cruz, CA, USA) über Nacht bei Raumtemperatur untersucht, und die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen. Gefärbt mit Alexa Fluor 488 konjugiert 488 Kaninchen-anti-Ziege-IgG für 1 h bei Raumtemperatur, und dann wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Die Kerne wurden durch Anfärben mit DAPI (Sigma, USA) für 2 min sichtbar gemacht. Die gefärbten Zellen wurden mit invertierten Fluoreszenzmikroskop beobachtet.

Die statistische Analyse

Alle statistischen Analysen mit der SPSS-Software-Paket ausgeführt wurden 15,0 für Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Quantitative Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Pearson χ ^{2-Test wurde verwendet, um den Unterschied zwischen Rang geordneten Daten zu vergleichen, während One-Way-ANOVA-Test den Unterschied zwischen quantitativen Daten zu vergleichen, wurde durchgeführt. Survival-Analysen wurden unter Verwendung der Kaplan-Meier-Methode und verglichen mit dem Log-Rank-Test durchgeführt. Die Cox-Regressionsmodell wurde durchgeführt, das unabhängige Risikoverhältnis der einzelnen Variablen in der multivariaten Analyse zu bewerten. Die Korrelation zwischen ATG5 und MRP1-Expression wurde unter Verwendung von Bivariate Korrelation (Pearson-Test) untersucht. Die Unterschiede wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn P
Werte waren weniger als 0,05.}

Ergebnisse

• PLoS ONE: Vergleich der operativen Ergebnisse und Kurven zwischen laparoskopischen und Robotic Gastrektomie für Magen Cancer
• PLoS ONE: Vorhersage von Magenkrebs Entwicklung von Serum Pepsinogen-Test und Helicobacter pylori Seropositivität in Ost-Asiaten: eine systematische Überprüfung und Meta-Analysis