PLoS ONE: Co-Lieferung von Doxorubicin und SATB1 shRNA durch Wärmeempfindliche Magnetic kationische Liposomen für Magenkrebs Therapy

Abstrakte

In früheren Studie hatten wir einen neuartigen thermo magnetischen Abgabesystem auf Basis von Liposomen entwickelt. Ziel dieser Studie war, die Effizienz dieses Systems für die Co-Abgabe beider Medikamente und Gene zu der gleichen Zelle und ihre Anti-Tumor-Wirkungen auf die Magenkrebs zu bewerten. Doxorubicin (DOX) und SATB1 shRNA Vektor wurden in die Co-Zuführsystem geladen und in vitro DOX wärmeempfindliche Freisetzungsaktivität, Zielgen Effizienz Silencing, gezielte zelluläre Aufnahme, in vitro Zytotoxizität sowie in vivo Antitumor-Aktivität wurden bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Co-Delivery-System wünschenswert gezielte Abgabe Wirksamkeit, DOX thermo Freisetzung und SATB1 gene silencing hatte. Darüber hinaus zeigten die co-Lieferung von DOX und SATB1 shRNA verbesserte Aktivität Magenkrebszellwachstum in vitro zu inhibieren und in vivo, im Vergleich zu einzelnen Lieferung. Abschließend wird das neue thermisch empfindlichen magnetischen drug und Gen co-Delivery-System viel versprechende Anwendung hat in kombinierter Chemotherapie und Gentherapie für Magenkrebs

Citation:. Peng Z, Wang C, Fang E, Lu X, Wang G, Tong Q (2014) Co-Lieferung von Doxorubicin und SATB1 shRNA durch Wärmeempfindliche Magnetic kationische Liposomen für Magenkrebstherapie. PLoS ONE 9 (3): e92924. doi: 10.1371 /journal.pone.0092924

Editor: Elena A. Rozhkova, Argonne National Laboratory, Vereinigte Staaten von Amerika

Received: 4. Dezember 2013 beginnen; Akzeptiert: 26. Februar 2014; Veröffentlicht: 27. März 2014

Copyright: © 2014 Peng et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr 81172186) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist die vierte häufigsten auftretende Krebsart und die zweithäufigste Ursache für Krebstod weltweit [1]. Im Jahr 2008 gab es rund 989.000 neue Fälle von Magenkrebs und 738.000 Todesfälle in der Welt, die vor allem im Osten, Süden aufgetreten, und in Zentralasien; Mittel- und Osteuropa; und Südamerika [2], [3]. In China ist Magenkrebs die dritte gemeinsame Krebs mit geschätzten 380.000 neue Fälle und eine höchste Sterblichkeit etwa 26,3 pro 100.000 Einwohner pro Jahr [4], [5]. Die chirurgische Resektion ist die gemeinsame kurative Option, aber es ist nicht geeignet für die meisten Patienten, die am späten Stadium von Magenkrebs sind. Andere Therapien wie Strahlentherapie und Chemotherapie zeigen eine gewisse Wirksamkeit, aber sie sind oft unbefriedigend [4], [6]. Darüber hinaus auch systemische Verabreichung von Chemotherapie verursacht schädliche Wirkungen [7], [8].

Durch die Entwicklung von Resistenzen gegenüber Chemotherapie, traditionelle Chemotherapie zeigte begrenzte anti-Tumorwirksamkeit [9]. Daher hat Multiagenten Co-Verabreichungssystem mehr Aufmerksamkeit kürzlich erlangt, da es verschiedene Arten von Agenzien auf die gleichen Tumorzellen liefern könnte, die dann synergistische Antitumorwirkungen zeigen. Zum Beispiel können zwei verschiedene chemische Mittel können kombiniert werden, oder ein chemisches Mittel mit small interfering RNA (siRNA) gegen ein Onkogen kombiniert werden. Darüber hinaus kann die gezielte Abgabe und kontrollierte Arzneimittelfreisetzung weiter anti-Tumor-Wirkung verbessern und Nebenwirkungen zu reduzieren.

Spezielle AT-reiche Bindungsprotein (SATB1) ist ein weltweit Chromatin Veranstalter, die Genexpression reguliert und wird in den beteiligten Modulation von malignem biologische Verhalten von Krebs [10]. [13] - aberrante Expression von SATB1 wurde gefördert Brustkrebs, Lungenkrebs und Lymphom [11] gezeigt. Unsere bisherigen Studien haben gezeigt, dass SATB1 eine wichtige Rolle bei Magenkrebs spielt, und kann eine unabhängige Prognosemarker für Magenkrebs [14], [15] sein. Die Unterdrückung der Expression von SATB1 durch siRNA oder Plasmid-Codierung bestimmte störende kurze harpin RNA (shRNA) gegen SATB1 liefern könnte die Proliferation und Invasion hemmen und die Apoptose von Tumorzellen [16], [17] zu fördern. Diese Ergebnisse legen nahe, dass SATB1 ein potentielles therapeutisches Ziel für Magenkrebs ist.

Wir vermuten, dass die Kombination der Gentherapie und Chemotherapie deutlich die therapeutische Wirksamkeit gegen Magenkrebs verbessern könnte. In unserer früheren Studie haben wir eine gezielte Wärmeempfindliches co-Abgabesystem auf Basis von thermomagnetischen kationischen Liposomen (TSMCL). Durch Calceinfreisetzung Test hatten wir die thermo liposomale Formulierung, optimiert und gemessen dann die magnetischen Eigenschaften und Genübertragung Effizienz von TSMCL. In dieser Studie geladen wir Doxorubicin und SATB1-shRNA Vektor in diesem System für die Kombination der Gentherapie und Chemotherapie und ausgewertet, um ihre synergistische Wirkung anti-Tumor gegen Magenkrebs in vitro und in vivo.

Materialien und Methoden

Materialien

Cholesterin, 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC) und 3β- [N- (N ', N'-Dimethylaminoethan) carbamoyl] Cholesterol (DC-Chol) wurden von Avanti Polar Lipids (USA) erworben. Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DOAB) wurden von Sigma-Aldrich (USA) erhalten. Magnetic Fluid-Fe _{3O 4 wurde von Galaxy Nanotech (China) synthetisiert. FAM markierte siRNA und Plasmid pGFP-SATB1 shRNA wurden von Genepharma (Shanghai, China) zur Verfügung gestellt. Doxorubicin wurde von Hisun Pharmaceutical (Zhejiang China) erworben. Fötales Rinderserum (FBS), Kulturmedien, Penicillin /Streptomycin (PEST) und Trypsin wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) geliefert. SATB1 Kaninchen monoklonale Antikörper wurde von Epitomics (Abcam, UK). Alle anderen Chemikalien waren von kommerziellen Analysequalität und ohne weitere Reinigung verwendet.}

Herstellung von Co-Delivery-System

Diese Co-Delivery-System auf thermo kationische Liposomen wurde auf Basis, die mit einem thermo hergestellt kationischen Formulierung von DPPC, DC-Cholesterin, DOAB und Cholesterin in einem Molverhältnis von 80:5:5:10 in unseren Vorversuchen optimiert. Liposome (TSCL) wurden durch das Dünnfilm Hydratisierung Verfahren hergestellt, gefolgt durch Extrusion [18]. Das Ammoniumsulfat-Gradienten-Methode wurde verwendet, DOX in TSCL (TSCL-DOX) zu laden. Zur Herstellung von magnetischen Liposomen (TSMCL), magnetische Fluid Fe _{3 O 4 wurde als Kern und co-eingekapselt mit Ammoniumsulfat-Puffer in die Liposomen verwendet. Nach der Bildung des Dünnfilms in den Rundkolben wurde ein Milliliter Suspension von Eisen und Ammoniumsulfat zugegeben, um den Film zu hydratisieren, und dann durch die Polycarbonat-Filter extrudiert und mit DOX (TSMCL-DOX) durch die Ammoniumsulfat-Gradienten-Methode geladen . Schließlich wurden die Produkte aus der Gelfiltration bei 1000 g für 15 min zentrifugiert, um nicht eingekapselte Fe 3O entfernen 4.}

pGFP-SATB1-shRNA (shSATB1) Vektor wurde mit verschiedenen Liposomen inkubiert in Serum freie Medien bei Raumtemperatur für 30 min, TSCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1, TSMCL-shSATB1 und TSMCL-DOX-shSATB1 bzw. vorzubereiten.

Bestimmung des Zetapotentials, Partikelgröße, und die Polydispersität

die mittlere Teilchengröße und die Uneinheitlichkeit der Partikelgrößenverteilung der Liposomen wurden bei 25 ° C durch dynamische Lichtstreuung unter Verwendung eines ZetaPALS Partikelmessung Instrument (Brookhaven Instruments Corporation, USA) bestimmt. Das Zeta-Potential der liposomalen Dispersionen wurde durch die elektrophoretische Mobilität bei 25 ° C mit dem gleichen Gerät gemessen.

Bestimmung der Doxorubicin beladen Effizienz

DOX-Konzentration in den Liposomen durch ein Fluorimeter gemessen ( Perkin Elmer, USA) mit 485 nm Anregungs- und 590 nm Emissionsfilter mit einer Verdünnungsreihe von freien DOX als Standard bestimmt. DOX geladen Effizienz wurde berechnet basierend auf DOX-Konzentration.

Differential Scanning Calorimetry (DSC)

DSC wurde durchgeführt, um die Wärmeempfindlichkeit von Liposomen zu bewerten, indem die Phasenübergangstemperatur (Tm) zu bestimmen. Tm wurde mit 20 mg /ml Phospholipid mit einer nano DSC (TA Instruments, USA) bei einer Heizrate von 20 ° C /h bewertet.

In vitro Wärmeempfindliches DOX Freisetzungsassay

20 ul DOX beladenen Liposomen wurden in 1 ml PBS und PBS mit 50% fötalem Rinderserum (FBS) inkubiert, die die in vivo-Umgebung separat in Eppendorfröhrchen nachahmt. Die Proben wurden in einem Wasserbad bei 37 ° C und 42 ° C für 1 h erhitzt, respectively. Dann wird die Fluoreszenzintensität von DOX wurde in einem Fluorimeter (Perkin Elmer, USA) unter Verwendung von 485 nm Anregungs- und 590 nm Emissionsfilter gemessen. Für 100% ige Freisetzung wurden die Proben für 1 min in 1 ml PBS mit 1% Triton X-100 inkubiert. Die DOX Release Prozentsätze wurden wie folgt berechnet: wobei F _{s die Fluoreszenz der Proben wurde nach dem Erhitzen, F 0 wurde die anfängliche Fluoreszenz von Proben vor dem Erhitzen und F 100 wurde die Fluoreszenz von Proben behandelt mit Triton X-100.}

Zellkultur

Human Adenokarzinom des Magens MKN-28-Zelllinie wurde von kEYGEN Biotech (Nanjing, China) erworben und kultiviert in hohem Glucose DMEM, das mit 10% FBS, 100 U /ml Penicillin und 100 ug /ml Streptomycin in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO _{2 bei 37 ° C.}

in vitro-Zelltransfektion

MKN-28-Zellen wurden ausgesät in 12-Well-Platten in einer Dichte von 4 × 10 ^{5 Zellen /Vertiefung, und über Nacht auf etwa 80% Konfluenz gezüchtet. Am nächsten Tag wurden die Zellen zweimal mit vorgewärmtem PBS gewaschen, dann TSCL-shSATB1 und TSMCL-shSATB1 wurden in jede Vertiefung gegeben und für 6 h inkubiert. Zellen, inkubiert mit TSMCL-shSATB1 wurden auf 12-Well-Magnetplatte während der ersten 30 min angeordnet, um ein Magnetfeld zu bieten. Als nächstes wurde das Inkubationsmedium mit DMEM mit 10% FBS und die Zellen für 24 h inkubiert wurden ergänzt ersetzt. GFP-Expression wurde unter dem Fluoreszenzmikroskop (Nikon 80i) ausgewertet und Durchflusszytometer (BD FACS Canto II).}

quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)

Die Gesamt-RNA extrahiert wurde TRIzol Regent (Invitrogen, Carlsbad, CA) nach Herstelleranweisung von MKN-28 Zellen, und cDNA wurde unter Verwendung von synthetisierten PrimeScript RT Master Mix (Takara, Dalian). PCR wurde unter Verwendung von SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Dalian) auf einem StepOne Plus-Real-Time-PCR-System (Applied Biosystems, USA) durchgeführt. Die Sequenzen der Primer waren wie folgt: SATB1 Sinn 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 'und Antisense 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3' GADPH Sinn 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 'und Antisense 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3'. SATB1 mRNA-Ebene wurde normalisiert, die der GAPDH.

Western-Blot-Analyse

MKN-28-Zellen wurden in RIPA-Puffer geerntet und lysiert. Die Überstände wurden nach Zentrifugation bei 10.000 g für 10 min gesammelt. Die Proteinkonzentration des Überstands wurde unter Verwendung eines BCA Protein Assay Kit bestimmt. Dann wurden 40 &mgr; g-Proben wurden auf einem 15% SDS-PAGE laufen gelassen und die Proteine ​​wurden auf PVDF-Membranen überführt. Die Membranen wurden 1 Stunde in 5% fettfreier Milch inkubiert unspezifische Bindung zu blockieren und dann über Nacht bei 4 ° C mit SATB1 oder β-Actin-Antikörper (1:500 Verdünnung) inkubiert nächstes. Die Membranen wurden anschließend mit HRP-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-Sekundärantikörper für 30 min untersucht. Schließlich wurden die Membranen mit einem verstärkten Chemilumineszenz-System sichtbar gemacht (ECL, Pierce) und einem Röntgenfilm ausgesetzt.

In-vitro-Bewertung der zellulären Aufnahme

Um die intrazelluläre Lokalisation von gelieferten DOX bewerten und pGFP-SATB1 shRNA und die verstärkte Penetration von Liposomen in die Magenkrebszellen durch magnetische gezielte, ein FAM markierte siRNA (grüne Fluoreszenz) verwendet pGFP-SATB1 shRNA und DOX selbst besitzt einen Instinkt rote Fluoreszenz zu überwachen zelluläre Aufnahme zu imitieren . MKN-28-Zellen wurden in 12-Well-Platte ausgesät bei 4 × 10 ^{5 Zellen /Vertiefung und über Nacht gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen mit freiem siRNA inkubiert, TSCL-siRNA, TSMCL-siRNA, TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-DOX-siRNA oder TSMCL-DOX-siRNA für 6 h. Für magnetische Liposomen wurden die Platten auf einer 12-Well-Magnetplatte während der ersten Stunde der Inkubation positioniert. Die Zellen wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht, die Fluoreszenzmarkierungen von DOX und siRNA zu lokalisieren. Die Kerne wurden mit DAPI (blaue Fluoreszenz) gefärbt.}

MTT-Test

MKN-28 Zellen mit einer Dichte von 2 × 10 ausgesät ^{4 Zellen /Well in 96-Well-Platten und über Nacht gezüchtet. Die Zellen wurden dann mit verschiedenen Liposomen bei 37 ° C für 2 h in CO _{2 -Inkubator inkubiert. Für magnetische Liposomen wurden die Platten unter einem 96-Well-Magnetplatte während der ersten 1 h Inkubation gegeben. Als nächstes wurden die Zellen für 46 h in frischen Medien zweimal mit PBS und inkubiert, gewaschen. Anschließend wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch einen MTT-Assay gemessen. Das Medium in jeder Vertiefung 20 &mgr; l MTT-Lösung (Sigma-Aldrich, USA) und inkubiert für 4 h bei 37 ° C ersetzt wurde, dann wurden die Überstände verworfen und die Formazan-Kristalle wurden mit 200 &mgr; l DMSO gelöst. Die Platten wurden bei 490 nm in einem Mikroplattenleser gemessen und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde nach der folgenden Formel berechnet:}}

Durchflusszytometrie

Apoptosis wurde mit einem Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit nachgewiesen (eBioscience, USA). MKN-28-Zellen wurden in 12-well Platten ausgesät und wie oben beschrieben behandelt. Nach 24 h wurden die Zellen gesammelt, zweimal mit PBS gewaschen und in 500 &mgr; l Bindungspuffer suspendiert. Als nächstes wurden die Zellen doppelt mit Annexin V-FITC und Propidiumiodid (PI) gefärbt. Die Zellen in einem frühen Stadium der Apoptose mit Annexin V-FITC gefärbt, aber nicht mit PI gefärbt durch Fluss cytometery quantifiziert wurden.

Xenograft Mausmodell

Fünf bis sechs Wochen alten männlichen Balb /c Nacktmäuse waren durch das Zentrum für Tierversuche der Tongji Medical College zur Verfügung gestellt. Jede Maus wurde subkutan in die rechte Flanke mit 5 x 10 ^{6 MKN-28-Zellen beimpft. Mehrere Wochen nach Tumor-Inokulation wurden 36 tumortragenden Mäuse willkürlich in sechs Gruppen aufgeteilt (n = 6). Die Mäuse wurden über die Schwanzvene mit kostenlosen DOX, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1, TSMCL-DOX-shSATB1 oder normaler Kochsalzlösung als Kontrolle injiziert. Die Dosis von DOX betrug 2,5 mg /kg und die von pGFP-SATB1 shRNA betrug 10 &mgr; g pro Maus. Die Behandlung wurde einmal gegeben alle 3 Tage und die Tumorgröße wurde über eine calipering gemessen und dann konnte das Tumorvolumen nach der folgenden Formel berechnet: Volumen = (D _{Min) 2 × D Max /2, wobei D Max die längste Tumordurchmesser und D war Min war das kürzeste. Für TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 und TSMCL-DOX-shSATB1 wurde die magnetische Ausrichtung für 30 Minuten auf den Tumor nach der Arzneimittelverabreichung konzentriert unter Verwendung eines fortgesetzten äußeren Magnetfeld von 5000 Gauss erreicht. Alle Experimente wurden durch Ethikkommission der Tongji Medical College genehmigt und wurden alle Tiere auf humane Weise nach Institutional Animal Care und Use Committee-Richtlinien.}}

Statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt behandelt (SD). Die statistische Signifikanz zwischen den verschiedenen Gruppen wurde mit dem Student-t-Test und Ein-Faktor-Varianzanalyse (ANOVA) Test bewertet. Für die Überlebenszeit der Tiere wurden die Kaplan-Meier-Kurven jeder Gruppe etabliert und Rank-Test wurde durchgeführt, log Überlebensrate zu vergleichen. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen

Ergebnisse |

Charakterisierung von Liposomen

Wie in Tabelle 1 gezeigt, war der Durchmesser von TSCL 83,6 ± 5,7 nm, während die von TSCL. -DOX wurde auf 118,5 ± 7,9 nm erhöht aufgrund der Verkapselung von DOX. Inzwischen wurden die Durchmesser von TSCL-shSATB1 und TSCL-DOX-shSATB1 stieg deutlich auf 161,1 ± 11,8 nm und 238,1 ± 20,6 nm bzw. aufgrund der Adhäsion und Fusion von Plasmid DNA an Liposomen. Für magnetische Liposomen waren die Teilchengrößen TSMCL, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 und TSMCL-DOX-shSATB1 135,0 ± 11,6 nm, 157,2 ± 14,3 nm, 221,3 ± 15,7 nm und 319,4 ± 20,1 nm bzw. wesentlich größer ist als derjenige von TSCL, TSCL-DOX, TSCL-shSATB1 und TSCL-DOX-shSATB1 aufgrund des Einschlusses der magnetischen Nanopartikel. Darüber hinaus war die Größe TSMCL-shSATB1 und TSMCL-DOX-shSATB1 deutlich größer, dass der TSMCL und TSMCL-DOX, bzw. (p < 0,05). Alle Liposomen hatten engen Größenverteilung, weil ihre Polydispersitäten keine waren mehr als 0,3.

Die Zeta-Potentiale von TSCL, TSCL-DOX, TSCL-shSATB1 und TSCL-DOX-shSATB1 waren 52,0 ± 7,3 mV, 50,1 ± 7,7 mV, 31,3 ± 5,2 und 26,7 mV ± 4,5 mV, respectively. Nach Inkubation mit pGFP-SATB1- shRNA, verringert die Oberflächenladungen signifikant (p < 0,05), um die elektrostatische Wechselwirkung zwischen den kationischen Lipiden und Plasmid-DNA zurückzuführen ist. Jedoch Einfangen von magnetischen Nanopartikeln nicht in magnetischen Liposomen in einer signifikanten Abnahme des Zeta-Potentials führen.

Für DOX geladen Effizienz, die DOX Einkapselung betrug 89 ± 3% und 78 ± 8% (n = 3) für TSCL-DOX und TSMCL-DOX bzw. und 85 betrug ± 7% und 73 ± 9% (n = 3) für TSCL-DOX-shSATB1 und TSMCL-DOX-shSATB1, respectively. Diese Daten zeigen, dass die Wechselwirkung zwischen Liposomen und das Plasmid nicht in DOX Leckage führte.

Die Wärmeempfindlichkeit der Liposomen

Differential Scanning Calorimetry wurde durchgeführt um die Phasenübergangstemperatur von TSCL zu bestimmen. Wie in gezeigt. 1, TSCL bestehend aus DPPC, DC-Cholesterin, DOAB und Cholesterin in einem Molverhältnis von 80:5:5:10 hatte eine Tm von 40,8 ° C mit einer relativ breiteren Übergangsspitze, die das Fusionsübergangsspitzenwert von DPPC sein können und DOAB .

in-vitro-thermo DOX-Freisetzung aus den Liposomen

Wie es in Fig. 2, DOX Freisetzungsrate von TSCL-DOX und TSMCL-DOX war nur 12% und 16% nach der Inkubation mit PBS bei 37 ° C und erhöhte sich auf 20% und 19% nach Inkubation mit 50% FBS, respectively. Für TSCL-DOX-shSATB1 und TSMCL-DOX-shSATB1, DOX Freisetzungsrate betrug 12% und 15% nach der Inkubation mit PBS bei 37 ° C und war sowohl 16% nach Inkubation mit 50% FBS anzeigt, dass der Einbau von Plasmid hatte keine signifikante Wirkung auf die Stabilität von Liposomen (p > 0,05).

DOX Freisetzungsrate von TSCL-DOX und TSMCL-DOX wurde bei 42 ° C mit PBS auf 37% nach der Inkubation erhöht und erhöhte sich auf 45% und 49% nach Inkubation mit 50% FBS, respectively. Für TSCL-DOX-shSATB1 und TSMCL-DOX-shSATB1, DOX Freisetzungsrate betrug 35% und 43% nach der Inkubation mit PBS und FBS bei 42 ° C jeweils sowohl signifikant höher als bei 37 ° C (p < 0,05). Diese Ergebnisse zeigen, dass TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-DOX-shSATB1 und TSMCL-DOX-shSATB1 wünschenswerte Wärmeempfindlichkeit und könnte für Hyperthermie verwendet werden ausgelöst Steuer Freisetzung von DOX.

Silencing von SATB1 Ausdruck in MKN-28-Zellen mit Liposomen
transfiziert

Als nächstes untersuchten wir die Wirksamkeit der Liposomen shSATB1 Vektors in MNK-28-Zellen zu liefern. Typische Fluoreszenzaufnahmen von Zellen, transfiziert mit TSCL-shSATB1 und TSMCL-shSATB1 wurden in Fig. 3A. Durchflusscytometrie-Analyse zeigte, dass die Transfektionseffizienz von TSCL-shSATB1 nur 15,4 ± 0,15% betrug. Doch nach der Anwendung von magnetischen Feldführung war die Transfektionseffizienz von TSMCL-shSATB1 34,3 ± 0,93% und damit deutlich höher als die von TSCL-shSATB1 (Abb. 3B).

Um zu bestimmen, ob die gelieferte shSATB1 Vektor Silencing SATB1 Expression in MKN-28-Zellen vermitteln konnte, führten wir quantitative PCR und Western-Blot-Analyse in Echtzeit. Die Ergebnisse zeigten, dass beide SATB1 mRNA und Proteinmengen in Zellen verringert, transfiziert mit TSCL-shSATB1 und TSMCL-shSATB1, im Vergleich zu Kontrollzellen. Darüber hinaus war TSMCL-shSATB1 mit Hilfe des Magnetfeldes stärker als TSCL-shSATB1 zu SATB1 Ausdruck in MKN-28-Zellen (Fig. 3C, D).

Magnetic gezielte in vitro zelluläre Aufnahme
hemmen

die Durchdringungen in die Zellen zwischen nichtmagnetischen und magnetischen Liposomen mit der Anwendung von magnetischen gezielte Führung sowie die intrazelluläre Lage gelieferter DOX und shSATB1 vergleichen, ein FAM-markierte siRNA als Indikator verwendet wurde. Das Fehlen der grünen Fluoreszenz in mit freiem siRNA-behandelten Zellen zeigte an, dass es nicht in die Zellen eindringen konnte (Daten nicht gezeigt). Wir beobachteten, dass mit TSMCL-siRNA behandelten Zellen mehr grüne Fluoreszenz als Zellen, behandelt mit TSCL-siRNA (Abb. 4A) ausgestellt. Außerdem mit TSMCL-DOX behandelt mehr Zellen zeigten rote Fluoreszenz als bei TSCL-DOX-behandelten Zellen (Fig. 4B). In Zellen mit TSMCL-DOX-siRNA behandelt wurde hohe Fluoreszenzintensität beobachtet und die Zellen erschienen rosa durch die Verschmelzung von blauen, roten und grünen Farbe (Abb. 4C). Diese Beobachtungen legen nahe, dass TSMCL potenter ist bei der Bereitstellung von siRNA und DOX in die Zellen als TSCL, nach der Anwendung des magnetischen Feldes.

Außerdem untersuchten wir die intrazelluläre Lokalisation von gelieferten DOX und siRNA. Rote Fluoreszenz wurde sowohl in den Nuclei und Cytoplasma beobachtet, was anzeigt, dass geliefert DOX angeordnet war sowohl in den Nuclei und Cytoplasma. Im Gegensatz dazu erschien eine grüne Fluoreszenz in erster Linie im Zytoplasma was darauf hindeutet, dass die siRNAs in das Zytoplasma geliefert wurden (Abb. 4D). Die Verschmelzung von rot und grün erschien im Zytoplasma gelb, und die Verschmelzung von Blau und Rot erschien Lavendel in den Kernen. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass sowohl TSCL und TSMCL in Magenkrebszellen eindringen und liefern ihre Inhalte in das Cytoplasma (DOX und siRNA) und die Kerne (DOX).

In vitro Antitumor-Wirkungen der
Liposomen

Wir untersuchten die in-vitro-Anti-Tumor-Wirkung dieser Co-Delivery-System von Zytotoxizität und Apoptose-Induktion Aktivität. Die Zytotoxizität der Liposomen wurde durch MTT-Assay bestimmt. Um die Auswirkungen von DOX und Plasmid-Konzentrationen auf die Cytotoxizität von Liposomen zu bestimmen, untersuchten wir Liposomen beladen mit verschiedenen Konzentrationen von DOX und unterschiedliche Mengen an SATB1 shRNA. Mit der Zunahme der DOX-Konzentration, die Zytotoxizität der Liposomen erhöht wurde (Fig. 5A). Allerdings hat die Zugabe von SATB1 shRNA Konzentration nicht zu einer erhöhten Zytotoxizität führen, und es wurden nur leicht erhöhen der Zytotoxizität bei SATB1 shRNA-Konzentration etwa 4 ug war (Abb. 5B). So haben wir 25 uM DOX und 4 ug SATB1 shRNA die Zytotoxizität unter Freie DOX, freies shRNA, TSCL, TSMCL, TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1 und TSMCL- zu vergleichen DOX-shSATB1.

Wie es in Fig. 5C, frei shRNA, TSCL und TSMCL hatte wenig Zytotoxizität. Die Lebensfähigkeit der Zellen betrug 40,3 ± 3,4%, 73,6 ± 3,5% und 51,3 ± 4,5% kostenlos DOX, TSCL-DOX und TSMCL-DOX, beziehungsweise, was darauf hindeutet, dass die Zytotoxizität von TSMCL-DOX war höher als TSCL-DOX, aber niedriger als frei DOX . Die Lebensfähigkeit der Zellen betrug 79,2 ± 6,9% und 71,6 ± 4,7% für TSCL-shSATB1 und TSMCL-shSATB1 bzw. zeigt keine statistische Signifikanz (p > 0,05). Für Arzneimittel und Gen co-Lieferung, war die Lebensfähigkeit der Zellen nur 35,0 ± 3,2% und 22,3 ± 3,4% für die TSCL-DOX-shRNA und TSMCL-DOX-shRNA jeweils deutlich niedriger als die der freien DOX, TSCL-DOX, TSMCL- DOX und SATB1shRNA beladenen Liposomen (p < 0,05). Zusätzlich Lebensfähigkeit der Zellen von TSMCL-DOX-shRNA war signifikant niedriger als die von TSCL-DOX-shRNA (p < 0,05). Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine synergistische Wirkung Zytotoxizität durch Co-Abgabe DOX und SATB1 shRNA erreicht wird. Darüber hinaus werden mit der Anwendung von magnetischen gezielt eine weitere verbesserte Zytotoxizität erhalten werden kann.

Um die zusätzlichen Antitumormechanismus neben der Zytotoxizität des Co-Verabreichungssystem zu bestimmen, untersuchten wir die Apoptoserate von MKN-28 Zellen behandelt mit kostenlosen DOX, TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1 und TSMCL-DOX-shSATB1 mittels Durchflusszytometrie. Wie in Fig zeigte. 5D, war Apoptoserate von 22,3% in Zellen mit freiem DOX behandelt, 8,9% in Zellen mit TSCL-DOX behandelt wurde, aber mit TSMCL-DOX und Magnetfeld behandelt in Zellen auf 13,4% erhöht. In ähnlicher Weise war Apoptoserate von 9,4% in Zellen mit TSCL-shSATB1 behandelt, aber erhöhte sich auf 17,4% in Zellen mit TSMCL-shSATB1 und Magnetfeld behandelt. Im Gegensatz dazu war Apoptoserate von 27,7% in Zellen mit TSCL-DOX-shSATB1 behandelt, höher ist als die in mit TSCL behandelten Zellen mit DOX oder shSATB1 allein geladen. Die Apoptoserate betrug 32,4% in den Zellen behandelt mit TSMCL-DOX-shSATB1, die höchste unter allen Gruppen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die gleichzeitige Bereitstellung von DOX und SATB1 shRNA führt zu einer kombinierten Effekte der Apoptoseinduktion. Mit einem Wort, das Co-Delivery-System zeigt eine starke Anti-Tumor-Wirkung in vitro.

In-vivo-Antitumor-Aktivität der Liposomen

Um die in vivo Anti-Tumor-Aktivität zu bestimmen des Co-Delivery-System, haben wir MKN-28 Maus-Xenograft-Modellen und injiziert freies DOX, TSMCL-DOX, TSCML-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1 oder TSMCL-DOX-shSATB1 in die Mäuse durch Schwanzvenen. Die Behandlung wurde einmal alle 3 Tage gegeben, und die Tumoren wurden seziert (Fig. 6A). Am 15. Tag war das Tumorvolumen 0,44 ± 0,05 cm ^{3 bei Mäusen mit TSMCL-DOX-shSATB1 behandelt, deutlich niedriger als die in Salz Gruppe (2,14 ± 0,23 cm 3), freies DOX Gruppe (1,08 ± 0,13 cm 3), TSCML-shSATB1 Gruppe (1,43 ± 0,21 cm 3) und TSCL-DOX-shSATB1 Gruppe (0,77 ± 0,12 cm TSMCL-DOX-Gruppe (0,68 ± 0,10 cm 3), 3) (Fig. 6B).}

Außerdem ist, wie in Fig. 6 (C), die mediane Zeit für Tumorvolumen von 2 cm zu erreichen ^{3 30 Tage im TSMCL-DOX-shSATB1 Gruppe war, länger als die in Salz Gruppe, freies DOX Gruppe, TSMCL-DOX-Gruppe, TSCML-shSATB1 Gruppe und TSCL-DOX-shSATB1 Gruppe (Abb. 6C). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Co-Abgabe DOX und shSATB1 durch TSMCL synergistische Antitumorwirkung in vivo.}

Diskussion

Trotz der jüngsten Entwicklung in der Chirurgie, Strahlentherapie und Zieltherapie, Chemotherapie noch einer der wichtigsten Ansätze für Magenkrebs-Therapie. Allerdings therapeutische Wirkung von Chemotherapie sind oft unzufrieden und konnte nicht signifikant die Prognose von Krebspatienten [19] zu verbessern. Ein Hauptgrund ist die Tumorigenese und das Fortschreiten von Magenkrebs eine Vielzahl von verschiedenen Mechanismen beinhaltet; der einheitliche anti Tumormechanismus herkömmlicher Chemotherapie hat ihre therapeutische Wirkung beschränkt ist, wodurch die Kombination von Chemotherapie mit Gentherapie kann anti-Tumor-Wirkung zu verbessern. Ein weiteres Hindernis der Chemotherapie ist, dass die systemische Verabreichung des Arzneimittels führt zu begrenzten Arzneimittelkonzentration in Tumorstellen, während verursacht viele schädliche Wirkungen [8]. Der Schlüssel zur Lösung dieser Probleme beruht auf neue Art und Weise der Arzneistoffabgabe daher Multiagenten gezielte Entwicklungssystem zu liefern, das an die Tumorstelle mit kontrollierter Freisetzung direkt geführt werden kann, diese Probleme zu überwinden und zu verbessern therapeutischen Wirkungen [20] - [25] .

Unter den verschiedenen Systemen Drug-Delivery-Liposomen sind vielversprechendsten für eine gute biocompatibilities die wenig oder keine antigen, allergische und toxische Reaktionen hervorrufen, und unterliegen leicht biologischen Abbau. Als Arzneimittel- und Genträger, Liposome nicht nur den Wirt vor unerwünschten Wirkungen des eingekapselten Arzneimittels schützen, sondern auch die eingeschlossenen Inhalte gegen vorzeitige Inaktivierung durch den physiologischen Medium [26] zu verhindern. Außerdem ist Liposom ein potentiell gezielte Arzneimittelabgabesystem, sei es durch erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Wirkung (Passive gezielte) oder durch Magnetfeldführung und Immunverbindung (Active gezielte) [27] erreicht. Darüber hinaus besitzen einige Liposomen ausgelöst Wirkstofffreisetzungsmerkmale wie Thermoempfindlichkeit, pH-Empfindlichkeit und Mikrowellen Empfindlichkeit gesteuert.

Vor kurzem hatten wir eine neuartige magnetische gezielte thermo Arzneimittel und Gen-Co-Verabreichungssystem (TSMCL) entwickelt. Basierend auf einer elektrothermo Formulierung (DPPC:Cholesterol = 80:20), hatten wir verschiedene kationische Komponenten und optimiert, um die Wärmeempfindlichkeit von Liposomen durch Calceinfreisetzung Assay zugegeben. Die Ergebnisse hatten gezeigt, dass wir eine wünschenswerte Wärmeempfindlichkeit durch Ersetzen 10 Mol-Teile Cholesterin von 5 mol Teile DC-Cholesterol und 5 Molteile DOAB (DPPC:DC-Cholesterol:DOAB:Cholesterol = 80:5:5:10) bekommen konnte, und Calcein-Freisetzung aus den Liposomen würde bei 37 ° C niedriger sein, aber signifikant höher bei 42 ° C in dieser Formulierung. Magnetisches Fluid Fe _{3 O 4 hatte als Kern verwendet wurde und fungierten als magnetischer Ausrichtung und Heizquelle von TSMCL nächstes. Schwingmagnetometer (VSM) Messung hatte darauf hingewiesen, dass magnetische Flüssigkeit Fe 3O 4 war super gewesen, so TSMCL hätte gute magnetische gezielte Effekte. Inzwischen hatte die zeitabhängige Heizkurve auch gezeigt, dass beide magnetische Fluid Fe 3 O 4 und TSMCL könnte von 25 ° C bis 42 ° C innerhalb von 20 min erwärmt werden. Mit Hilfe von Magnetflüssigkeit Fe 3O 4, sowohl magnetische Ausrichtung und Temperatur ausgelöst Wirkstofffreisetzung von TSMCL realisiert werden konnte. Schließlich beide TSCL und TSMCL hatte typische liposomalen Morphologien und gute Verteilungen unter TEM ausgestellt. Basierend auf den erfolgreichen Aufbau von TSMCL, die in dieser Studie luden wir DOX und SATB1 shRNA Vektor in TSMCL zu TSMCL-DOX-shSATB1 und bewertet die Anti-Tumor-Wirkung gegen Magenkrebszellen in vitro und in vivo zu machen.}

DOX ist eine häufig verwendete Arzneimittel in der Chemotherapie mit hoher Effizienz die Tumorzellproliferation zu hemmen, und die Tumorzellapoptose zu induzieren, aber die therapeutischen Effekte werden begrenzt durch schwere Kardiotoxizität und Myelosuppression, wenn sie systemisch verabreicht [28]. Obwohl DOX-Liposomen teilweise die Situation verbessert, limites das Fehlen gezielte Abgabe noch deren Verwendung [29]. SATB1 ist ein globales Chromatin Veranstalter, die die Expression von ERRB2, MMP2, ABL1 und E-Cadherin, um als Schlüsselregulator der Krebsentwicklung direkt reguliert [30]. [13] - Überexpression von SATB1 in verschiedenen Tumoren wurde mit malignen biologischen Verhaltensweisen wie Invasion, Proliferation und Metastasierung [10] in Verbindung gebracht worden. Silencing SATB1 Expression von small interfering RNA (siRNA) oder Plasmid kurze harpin RNA (shRNA) kodieren könnte hemmen, die Proliferation, Invasion und Metastasierung und Apoptose verschiedener Tumorzellen induzieren [16], [17]. Daher wird SATB1 ein potentielles Ziel für die Krebstherapie [30]. Allerdings sind entsprechende Liefer Vektoren für siRNA oder shRNA wichtig für SATB1 Krebs Gentherapie gezielt.

In dieser Studie mit TSMCL-DOX-shSATB1 System, sowohl DOX und SATB1 shRNA Vektor könnte auf Tumorstelle unter magnetischen geführt werden eingereicht Führung und DOX wurde in einer Hyperthermie ausgelöst freigesetzt. Hyperthermie ausgelöste Freisetzung hängt von wärmeempfindlichen Liposomen, die hauptsächlich aus Dipalmitoyphosphocholine zusammengesetzt sind (DPPC), das ein Gel zu flüssigkristallinen Phasenübergang (Tm) unterzogen wird, die auf kleine wasserlösliche Moleküle auf 41 ° C hoch leaky wird [31]. Liposome bestehen aus verschiedenen Lipiden DPPC und haben unterschiedliche Tm und Wärmeempfindlichkeit [32]. DSC-Analyse zeigte, dass die Tm der Verabreichungssystem war 40,8 ° C und DOX-Freisetzungs-Assay zeigte an, dass es bei 37 ° C stabil war, während DOX freigesetzt wurde, als die Temperatur auf 42 ° C erhöht.

• PLoS ONE: Expression des EGF-Familie in Magenkrebs: Das Herunterregulieren von HER4 und seine aktivierenden Liganden NRG4
• PLoS ONE: A Novel Functional TagSNP Rs7560488 im DNMT3A1 Promotor mit Empfänglichkeit für Magen-Krebs von Stetige Promotoraktivität