PLoS ONE: IL-26 fördert die Proliferation und das Überleben der menschlichen Magenkrebszellen durch das Gleichgewicht von STAT1 und STAT3 Aktivierung Regulierung

Abstrakt

Interleukin-26 (IL-26) ist eine der von Th17-Zellen Zytokine, deren Rolle in der menschlichen Tumoren bleibt unbekannt. Hier untersuchten wir die Expression und mögliche Rolle von IL-26 in humanen Magenkrebs (GC). Die Expression von IL-26 und verwandte Moleküle wie IL-20R1, STAT1 und STAT3 wurde durch Echtzeit-PCR und immunohistochemisty sucht. Die Wirkungen von IL-26 auf die Zellproliferation und Cisplatin-induzierte Apoptose wurde durch BrdU Zusammenarbeit Assay und PI-Annexin V co-Anfärbung bzw. analysiert. Lentivirale vermittelte siRNA wurde verwendet, dessen Wirkmechanismus zu erforschen und IL-26 zugehörige Signalisierung wurde durch Western-Blot analysiert. Menschliche GC Gewebe zeigten Konzentrationen von IL-26 erhöht und die damit verbundenen Moleküle und Aktivierung von STAT3-Signalisierung, während STAT1 Aktivierung nicht signifikant zwischen GC und normalen Magengewebe unterschieden. Außerdem IL-26 wurde in erster Linie durch Th17 und NK-Zellen hergestellt. IL-26 gefördert, die Proliferation und das Überleben von MKN45 und SGC-7901 Magenkrebszellen in einer dosisabhängigen Weise. Weiterhin IL-20R2 und IL-10R1, die zwei wesentliche Rezeptoren für IL-26-Signalisierung, wurden in beiden Zelllinien exprimiert. IL-26 aktiviert STAT1 und STAT3 Signalgebung; jedoch der Aufregulation der Expression von Bcl-2, Bcl-XL und c-myc zeigten, dass die Wirkung von IL-26 durch STAT3-Aktivierung vermittelt wird. Knockdown von STAT1 und STAT3-Expression vorgeschlagen, dass die proliferative und anti-apoptotischen Wirkung von IL-26 durch die Modulation von STAT1 /STAT3-Aktivierung vermittelt werden. Zusammengefasst fördern erhöhte Konzentrationen von IL-26 in der menschlichen GC Proliferation und das Überleben durch Modulation STAT1 /STAT3 Signal

Citation:. Sie W, Tang Q, Zhang C, Wu J, Gu C, Wu Z, et al. (2013) IL-26 fördert die Proliferation und das Überleben der menschlichen Magenkrebszellen durch das Gleichgewicht von STAT1 und STAT3-Aktivierung zu regulieren. PLoS ONE 8 (5): e63588. doi: 10.1371 /journal.pone.0063588

Editor: Salvatore V. Pizzo, der Duke University Medical Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 11. Oktober 2012; Akzeptiert: 2. April 2013; Veröffentlicht: 21. Mai 2013

Copyright: © 2013 You et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation (81170415 für XC) und der Provinz Jiangsu Key Provincial Talents Program (RC2011079 für QT und RC2007056 für XC) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in der Welt. GC ist schwierig, auch in den westlichen Ländern zu heilen, weil es oft erst im fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung nachgewiesen [1]. Obwohl eine Anzahl von Faktoren, die mit der Entwicklung und dem Fortschreiten von GC, eine Verbindung zwischen chronischen Magenentzündung wie atrophische Gastritis, induziert durch Helicobacter pylori und das Risiko von GC zugeordnet sind in den letzten Jahren deutlich werden [2]. Chronische Entzündung GC führt, ist ein langer und komplizierter Prozess, der über viele Jahre hinweg auftritt und durch entzündliche Schädigung der Magenschleimhaut, Zytokin-induzierte DNA-Synthese und Zellproliferation, Hyperplasie und Carcinogenese gekennzeichnet [3].

Zusammenhang zwischen chronischer Entzündung und das Immunsystem gut untersucht worden, und Lymphozyten sind die wichtigsten Vermittler von entzündungs ​​gefördert Karzinogenese [4]. Th17 Zellen sind eine neue Art von T-Lymphozyten, die RORγT und sezernieren verschiedene Cytokine einschließlich IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22 und IL-26 exprimieren. Die Differenzierung von Th17 Zellen wird durch verschiedene Zytokine reguliert einschließlich IL-1β, IL-6, IL-23, Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) und transformierenden Wachstumsfaktor beta (TGF-β) [5], [6] . Neuere klinische Studien zeigten, dass Th17 Zellen eng mit H. pylori assoziierten Pathologie und Karzinogenese von GC bezogen werden [7], [8], [9], [10]. Obwohl mehrere Th17 verwandten Cytokinen untersucht wurden, ist nur wenig über Interleukin-26 bekannt (IL-26) in Bezug auf Magentumoren.

IL-26 ein sekretiertes Protein ist, die Funktionen entweder als Monomer oder Homodimer. Es wurde ursprünglich von Knappe et al. [11] unter dem Namen AK155. IL-26 hat schwache, aber signifikante Sequenzhomologie zu IL-10 und sein codiertes Protein ist somit ein Mitglied der IL-10-Familie von Cytokinen, die hauptsächlich auf die Klasse-2-Cytokin-Familie gehören. IL-26 kann durch primäre T-Zellen, NK-Zellen und T-Zell-Klonen und ist in der Regel coexprimiert mit anderen wichtigen IL-10-verwandte Zytokine, wie IL-22 [12], [13] sezerniert werden. IL-26 bindet an eine unterschiedliche Rezeptorkomplex Zelloberfläche der Ketten IL-20R1 und IL-10R2 bestehend, und ihre funktionellen Aktivitäten unterscheiden sich von denen, vermittelt durch IL-10. IL-20R1 Funktionen als spezifische Liganden-Bindungskette für IL-26 und IL-10R2 ist ein wesentlicher zweite Kettenanordnung des aktiven Rezeptor-Komplexes zu vervollständigen. Antikörper gegen entweder die IL-20R1 oder IL-10R2 Ketten können neutralisierende blockieren Induktion von IL-26-Signalisierung [12]. Einmal vollständig zusammengebaut erfährt der Rezeptor-Komplex eine Konformationsänderung (n), die Aktivierung der rezeptorassoziierten Janus-Tyrosin-Kinasen, Jak1 und Tyk2 und nachfolgende transiente Docking- und Phosphorylierung der STAT-Proteine, STAT1 und STAT3 induziert [14], [15 ].

Als Zytokin Th17 Zusammenhang hat sich die Rolle von IL-26 in Tumoren untersucht worden. Hier untersuchten wir die mögliche Beteiligung von IL-26 in der menschlichen GC zum ersten Mal und erforschte seine pro-Überleben und proliferative Effekte In-vitro-
.

Materialien und Methoden

Patienten

die vorliegende Studie umfasste 60 Patienten mit GC, die auf dem ersten Affiliated Hospital der Nanjing Medical University, Nanjing, Provinz Jiangsu (Tabelle 1) Chirurgie 2006-2009 unterzog. Alle Experimente wurden gemäß den in der Deklaration von Helsinki Ausdruck gebrachten Grundsätze durchgeführt. Eine schriftliche Zustimmungen für Genexpressionsanalysen in Geweben von allen Patienten vor der Operation oder endoskopische Untersuchung erhalten wurden. Das Studienprotokoll und Genehmigungsverfahren wurden von der Ethikkommission des Ersten Affiliated Hospital der Nanjing Medical University genehmigt. Die Diagnose und Staging von Magenkrebs wurde nach der AJCC (TNM) Staging System durchgeführt.

Quantitative Real-time PCR

Die reverse Transkription Reaktionen wurden der Exponent Erststrangsynthese-System unter Verwendung von ( Invitrogen, CA) nach der Behandlung von RNA-Matrizen mit DNase I genomischen DNA-Kontamination zu vermeiden. Um die relative Höhe der cDNA in den revers transkribiert Proben, real-time PCR wurde durchgeführt, mit dem Roche LightCycler480 (Roche Diagnostics, USA) unter Verwendung von Primern für IL-26 wie folgt ermitteln: vorwärts, AAGCAACGATTCCAGAAGACC und umgekehrt, AAGTCCTCCACAAAGCGTATTTT, mit einem verstärkten Länge von 175 bp. GAPDH wurde als Kontrolle mit den folgenden Primer verwendet: vorwärts, AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC; umkehren, GGGGTCATTGATGGCAACAATA; verstärkte Länge, 102 bp. Die Echtzeit-PCR-Reaktion wurde nach den in der SYBR® Premix Ex Taq ™ Kit (Takara, Japan) enthalten Anweisungen ausgeführt. Die Daten wurden in den Proben auf die GAPDH Spiegel wieder normalisiert.

ELISA

IL-26-Konzentration im Serum von GC-Patienten und gesunden Kontrollen wurde unter Verwendung eines handelsüblichen Sandwich-ELISA-Kits (Biotang Inc., MA).

Western-Blot-Analyse

Proteine ​​aus MKN45 extrahiert wurden, SGC7901 und ihre STAT1 und STAT3 siRNA modifizierte Zelllinien und quantifiziert ein Protein-Assay (Bio-Rad Laboratories, CA) verwendet wird. Proteinproben (30 ug) wurden durch SDS-PAGE fraktioniert und auf eine Nitrocellulosemembran überführt. Immunoblotting wurde durchgeführt, Antikörper gegen IL-26, IL-20R1, IL-10R2, p-STAT3 (S727), STAT3, p-STAT1 (Y701), STAT1, Bcl-2, Bcl-xl, c-Myc und α- Verwendung Tubulin (alle aus Abcam, MN erhältlich). Die Ergebnisse wurden mit einem chemolumineszierende Erfassungssystem (Pierce ECL Substrat Western-Blot-Detektionssystem, Thermo Scientific, IL) und der Exposition der Autoradiographie-Film (Kodak XAR-Film) visualisiert.

Immunhistochemie (IHC)

Die Gewebe wurden über Nacht bei 4 ° C, verarbeitet und in 5 &mgr; m dicke Schnitte geschnitten in 4% Paraformaldehyd gesammelt und fixiert. Immunhistochemische Färbung von Schnitten mit Antikörpern gegen IL-26, IL-20R1, p-STAT3 (S727) und p-STAT1 (Y701) wurde durchgeführt unter Verwendung von Techniken zuvor beschrieben [16].

BrdU Cell Proliferation Assay

Kultivierte Zellen wurden in einer Dichte von 1 × 10 ^{4 Zellen /Well in 96-Well-Platten. Die Zellproliferation bei 0, 12, 24, 48, 60 und 72 h wurde unter Verwendung des BrdU-Zell-Proliferation-Testkit bestimmt. BrdU-Lösung (Cell Signaling Technology, MA) wurde in jede Vertiefung gegeben gemäß den Anweisungen des Herstellers für 12 h. Die Zellproliferationsrate wurde durch Messen der Extinktion bei 450 nm unter Verwendung eines computergesteuerten Mikrotiterplatten-Lesegerät bestimmt.}

Isolation und Kultur der Menschen GC infiltrierten Leukocyten

Frische Tumorgewebe wurden zweimal in RPMI 1640 gewaschen entfernt. Fatty wurde Binde- und nekrotischen Gewebes. Die Gewebe wurden in RPMI 1640, überführt in 1-2 mm große Stücke gehackt in 15 oder 50 ml konischen Röhrchen und inkubiert mit triple Enzymdigestionsmedium, enthaltend DNase (30 U /ml), Hyaluronidase (0,1 mg /ml) und Kollagenase (1 mg /ml) für 2 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Gewebe wurden in 10 ml RPMI 1640 und filtrierte durch einen 70 um-Zellsieb (BD Pharmigen) resuspendiert. enthaltend 1 ml T-Zell-Wachstumsmedium in einer 24-Well-Platte-Zellen durch das Sieb gefangen wurden in einzelne Vertiefungen gegeben zur weiteren Detektion mittels Durchflußzytometrie.

Th17 und NK-Zell-Isolation, Stimulation und Analyse über Durchflusszytometrie

Th17 Zellen wurden durch erhaltenen in vitro
Stimulation von CD4 positive peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), die mittels Durchflusszytometrie isoliert wurden unter den Bedingungen (20 ng /ml IL-1β, 20 ng /ml IL-6, 20 ng /ml IL-23, 5 ng /ml TGF-β, 5 ug /ml Anti-IL-12 und 5 ug /ml Anti-IL-4), die zuvor beschrieben [17]. NK-Zellen wurden unter Verwendung eines NK-Zell-Extraktions-Kit von Miltenyi Biotec gekauft erhalten (Kat. 130-092-657). Th17 und NK-Zellen wurden beibehalten In-vitro-
und stimuliert durch 100 ng /ml LPS und H. pylori
Lysate sind, und durch intrazelluläre Cytokin-Färbung analysiert.

Für die intrazelluläre Cytokin-Färbung wurden die Zellen für 5 h mit einer Leukozytenaktivierung Cocktail (BD Pharmingen) bei 37 ° C stimuliert. Zellen wurden dann mit Oberflächenmarkern, fixiert und permeabilisiert mit IntraPre Reagent (Beckman Coulter) und schließlich gefärbt mit intrazellulären Markern gefärbt. Daten wurden auf einem FACSVantage SE erworben und mit Cellquest-Software analysiert. Fluorochromkonjugierten monoklonaler Antikörper gegen IL-26, CD3, CD4, CD8, CD16, CD56 und RORγT von BD Pharmingen gekauft wurden.

Cisplatin-induzierter Apoptose und Analyse über Durchflusszytometrie

Die Zellen analysiert wurden kultiviert in vollständigem Medium mit 1 ug /mL Cisplatin 24 Stunden. Die Zellen wurden weiter mittels Durchflusszytometrie (FACSCalibur ™; BD Biosciences, NJ) analysiert. Mit einem PI /Annexin Färbekit (BD Biosciences)

siRNA Design-und Lentiviren Produktion und Transduction

Die siRNAs Targeting STAT1 und STAT3 wurden entwickelt und synthetisiert durch Genscript Co. (Nanjing, China) wie folgt: siRNA Targeting STAT1, GGACAAGGTTATGTGTATA; und siRNA Targeting STAT3, GGACATCAGCGGTAAGACC. Die synthetisierten siRNAs wurden in den lentiviralen Vektor pLL3.7 subkloniert von Hapi
und XhoI
(New England Biolab, Vereinigtes Königreich) zusammen mit Kontroll-siRNA und dem Namen pLL3.7-cs, PLL3. 7-STAT1-SiRNA und pLL3.7-STAT3-SiRNA. Rekombinantes Lentivirus wurde aus 293T-Zellen erzeugt [16]. Die menschlichen GC Zellinien MKN45 und SGC7901 wurden aus Kaiji Biotech Co (Nanjing, China) erworben und in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, 100 U /ml Penicillin und 100 U /ml Streptomycin (Gibco gezüchtet , CA), und transduziert mit Lentiviren Polybren (8 ug /ml verwendet wird).

Statistische Analyse

Die Ergebnisse als Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten bei exprimiert werden. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mit dem Mann-Whitney U-Test durchgeführt. Die Korrelation von IL-26-Expression und verschiedenen klinischen Eigenschaften wurde mit der Chi-Quadrat-Test analysiert. P-Werte < 0,05 als statistisch signifikant betrachtet wurden

Ergebnisse

• PLoS ONE: Kurzfristige klinische Implikationen der Accessory linken Leberarterie bei Patienten Radical Gastrektomie für Magen Cancer
• PLoS ONE: Enterococcus faecalis Infektion verursacht eine Entzündung, intrazellulärer OXPHOS Unabhängige ROS-Produktion, und DNA-Schäden in menschlichen Magenkrebszellen