PLoS ONE: MicroRNA Let-7f Hemmt Tumorinvasion und Metastasierung von MYH9 Targeting in menschlichen Magen Cancer

Abstrakt

Hintergrund

MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige Regulatoren, die eine Schlüsselrolle bei der Tumorentstehung spielen und Tumorprogression. Ein früherer Bericht, dass die Familien let-7 gezeigt Mitglieder als Tumorsuppressoren in vielen Krebsarten wirken kann. Durch miRNA array, fanden wir, dass let-7f wurde in den stark metastatischen Potential Magenkrebszelllinien GC9811-P und SGC7901-M nach unten reguliert, wenn sie mit ihren parentalen Zelllinien verglichen, GC9811 und SGC7901-NM; jedoch war der Mechanismus nicht klar. In dieser Studie untersuchen wir, ob let-7f wirkt als Tumorsuppressor-Invasion und Metastasierung bei Magenkrebs zu verhindern.

Methodik /Haupt

Real-time PCR zeigte verringerte Niveaus von let-7f Expression bei metastasierendem Magenkrebs Geweben und Zelllinien, die potenziell hochmetastatisch sind. Zellinvasion und Migration wurden in GC9811-P und SGC7901-M-Zelllinien nach der Transfektion mit let-7f-Mimetika erheblich beeinträchtigt. Nacktmäuse mit Xenotransplantatmodellen von Magenkrebs bestätigt, dass let-7f Magenkrebs Metastasen in vivo nach der Transfektion durch die Lentiviren pGCsil-GFP- let-7f hemmen könnte. Luciferase-Reporter-Assays zeigten, dass let-7f bindet direkt an die 3'-UTR von MYH9, welche für Myosin IIA, und Echtzeit-PCR und Western-Blotting weiter angedeutet, dass let-7f, die Expression von Myosin IIA an der mRNA und Protein-Ebene herunterreguliert Invasion und Migration von Magenkrebszellen durch direkt gezielt die Tumormetastasierung-assoziierten Gens MYH9 hemmen könnte.

Schlussfolgerungen /Bedeutung

Unsere Studie hat gezeigt, dass die Überexpression von Magenkrebs let-7f. Diese Daten legen nahe, dass let-7f eine neuartige therapeutische Kandidat für Magenkrebs sein kann, aufgrund seiner Fähigkeit, die Zellinvasion und Metastasierung zu reduzieren

Citation:. Liang S, He L, Zhao X, Miao Y, Gu Y, Guo C, et al. (2011) MicroRNA Let-7f Hemmt Tumorinvasion und Metastasierung von MYH9 Targeting in der menschlichen Magenkrebs. PLoS ONE 6 (4): e18409. doi: 10.1371 /journal.pone.0018409

Editor: Donald Gullberg, Universität Bergen, Norwegen

Empfangen: 27. September 2010; Akzeptiert: 7. März 2011; Veröffentlicht: 18. April 2011

© 2011 Liang et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr 30801330, Nr 30871143, Nr 81030044)) und dem nationalen Grundlagenforschung Programm von China (Nr 2010CB529300, Nr 2010CB529306) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist die häufigste Magen-Darm-Malignität in Ostasien, Osteuropa und Teilen Mittel- und Südamerika und ist die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle [1]. Die weit verbreitete Metastasierung ist ein Hauptgrund für die düstere Ergebnis der GC Patienten gewesen. Metastasierung ist ein komplexes, mehrstufiges Verfahren, bei dem Krebszellen aus dem primären Neoplasmas an einen entfernten Ort wandern [2]. Der Prozess beginnt, wenn primäre Tumorzellen benachbarte Gewebe eindringen, gefolgt von Zellen in den Blutstrom (intravasation) eintritt, durch die Vaskulatur Translokation Austritt aus Blutgefäßen (Extravasation) in das umgebende Gewebe Parenchyms micrometastases initiieren und schließlich makroskopische Sekundär proliferierenden zu bilden Tumoren [3]. Einer der kritischen Regulierungsbehörden, dass in diesem Prozess beteiligt ist ein microRNA (miRNA) [4].

MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse von endogenen und kleine nicht-kodierende regulatorische RNAs, welche Gene bei der Post-Regulierung Transkriptionsebene [5]. Mature miRNAs kann durch RNA-Polymerase II transkribiert werden und werden von der sequentiellen Verarbeitung von primären miRNA-Transkripte durch Drosha und Dicer erzeugt; sie dienen dann als posttranskritionelle Regulatoren der Genexpression durch komplementäre Basenpaarung an Boten-RNAs [6]. Viele Berichte zeigen, dass miRNAs Schlüsselrollen in verschiedenen biologischen Prozessen, einschließlich der Zelldifferenzierung, Proliferation, Apoptose, Stressresistenz, Fettstoffwechsel, Tumorentstehung und Tumormetastasierung [7], [8], [9].

Die let-7-Familie ist eine konservierte Familie von miRNAs. Let-7 wurde ursprünglich in den Nematoden Caenorhabditis elegans beobachtet [10], und vierzehn Mitglieder haben bis heute gefunden worden [11]. Kürzlich wurden die Expressionsniveaus von vielen let-7-Familienmitgliedern gefunden in einer Vielzahl von Krebsarten reduziert werden. Zum Beispiel, let-7 wird bei Lungenkrebs downregulated, Melanom, und Kopf-Hals-Plattenepithel-Karzinom, während die Überexpression von let-7 kann das Krebszellwachstum [12], [13], [14], [15], [16 hemmen ], [17], [18]. Mehrere Onkogenen, wie RAS, MYC, und HMGA2, sind direkte Ziele von let-7 [19], [20], [21]. Let-7f ein Mitglied der let-7-Familie. Frühere Studien haben gezeigt, dass let-7f gezeigt ist hochreguliert in primärem Brustkrebs und fördert Angiogenese [22]; Herabregulation in PAH [23] wurde von chronischer Hypoxie oder Monocrotalin bei Ratten verursacht wird, und die Höhe wurde in Plasmablasen von NSCLC-Patienten [24] verringert. Darüber hinaus können let-7f Zellproliferation beeinflussen durch Kallikrein-verwandten Peptidasen (KLKs), eine Familie von Serin-Proteasen-Targeting, die, einschließlich Ovarialkarzinom in mehreren malignen Erkrankungen werden dysreguliert gezeigt wurde, [25].

Unsere Labor zuvor eine Gruppe von unterschiedlich exprimiert miRNAs zwischen GC9811 und GC9811-P-Zellen durch High-Profile-microRNA-Chip-Analysen identifiziert, die enthalten let-7f [26]. Bei der weiteren Charakterisierung der let-7f in verschiedenen Krebszelllinien, fanden wir, dass let-7f wirkt als Metastase-Suppressor. Die verstärkte Expression von let-7f kann GC Zellinvasion und Migration in vitro zu unterdrücken und in vivo. Durch Bioinformatik-Analyse identifizierten wir, dass MYH9, die eine Myosin IIA schwere Kette in der Förderung der Krebszellmigration oder Invasion als putative let-7f Ziel beteiligt kodiert. Nachfolgende Experimente bestätigt, dass let-7f können, indem sie auf die 3'UTR von MYH9 Myosin IIA Ausdruck downregulate, die ein mögliches Ziel für die GC-Behandlung bietet.

Materialien und Methoden

Gewebesammlung

Primärmagentumorgewebe, neben nicht-Tumor-Magengewebe und Fernmetastasen Magengewebe wurden von Patienten erhalten, die eine Operation am Xijing Hospital of Digestive Diseases in Xi'an, China unterzog. Alle Proben wurden klinisch und pathologisch gezeigt korrekt gekennzeichnet werden. Die Patienten-Proben für die Studie bietet unterzeichnet Einverständniserklärungen.

Zellkultur

Die menschlichen Magenkrebszelllinien GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, SGC7901-M in unserem eigenen Labor konserviert waren und wurden in RPMI1640 (HyClone), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum. (FBS; GIBCO), 100 Einheiten /ml Penicillin und 0,1 mg /ml Streptomycin bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% Kohlendioxid-Inkubator

RNA Extraktion und Echtzeit-PCR

qRT-PCR wurde durchgeführt, um die Expressionsniveaus von potentiellen let-7f Zielgene zu bestimmen. Gesamt-RNA wurde aus Geweben oder kultivierten Zellen unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Invitrogen Life Technologies) extrahiert. Komplementäre DNA (cDNA) wurde unter Verwendung einer TaqMan Reverse-Transcription Kit (Applied Biosystems) erzeugt. Echtzeit-PCR-Analysen wurden mit einer TaqMan Micro-RNA-Assay-Kit (Applied Biosystems) durchgeführt. Primer von let-7f wurde von Ambion (MI0000437) erworben. Primer von MYH9 Sequenz wurde mit Primer Express Software (Version 1.5) entwickelt. Der Primer-MYH9 Sequenz: (Forward) 5'AGAGCTCACGTGCCTCAACG3 '(Rückwärts) 5'TGACCACACAGAACAGGCCTG3'.All Protokolle wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Expression von let-7f wurde normalisiert auf 5S (Forward: 5'GATTGAATCGAGCACCAGTTAC3 ';

Reverse: 5'GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC3'). Das Expressionsniveau von MYH9 war normalisierte to18S (Forward: 5'CGGCTACCACATCCAAGGAA3 ';

Reverse: 5'GCTGGAATATCCGCGGCT3') PCR und Datenerhebung wurden auf einem iCycler (Bio-Rad) durchgeführt.. Jede Probe wurde dreifach durchgeführt

Vektor-Konstrukte und Lentiviren Produktion

Die pri-let-7f Sequenz wurde wie folgt aufgebaut:. (Forward) hsa-let-7f-1-Xho IF GGGCCCGCTCTAGACTCGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG (Rückwärts) hsa-let-7f-1- BamH IR CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTCGAGGCTGATC. Die Sequenz wurde amplifiziert und kloniert in die pGCsil-GFP-Vektor (GENECHEM) pGCsil-GFP- let-7f zu erzeugen. Negative Kontrolle war pGC FU-RNAi-NC-LV. Virus Verpackung wurde in HEK 293T-Zellen nach der Ko-Transfektion von 20 ug pGCsil-GFP-let-7f Vektor mit 15 ug des Verpackungs Plasmid pHelper 1,0 Vektor und 10 ug des Umschlags Plasmid pHelper 2.0 Vektor unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen) durchgeführt. Die Viren wurden 48 h nach der Transfektion geerntet und virale Titer bestimmt.

Oligonukleotids Bau

let-7f imitiert, let-7f Inhibitor und negativen Kontroll-siRNA-Oligonukleotide wurden chemosynthesized (Shanghai GenePhama Co., Ltd). Die Oligonukleotide in diesen Studien verwendet wurden, hat-let-7f ahmt: 5'UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU3'and 5'CUAUACAAUCUACCUCAUU3 ';

Mimics negative Kontrolle: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUT3'and5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3', hat-let-7f Inhibitor: 5'AACUAUACAAUCUACUACCUCA3 '. MircoRNA Inhibitor negative Kontrolle: 5'CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3 '

Zelltransfektion

Die Zellen auf 80% bis 90% Zusammenfluß kultiviert wurden, nachdem sie in 6-Well-Platten ausgesät werden und wurden mit Lipofectamin 2000 (Invitrogen transfiziert. , Carlsbad, CA) nach den Anweisungen des Herstellers. Für transiente Transfektion Zellen in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte wurden mit 12,5 ul miRNA-Inhibitor oder 7,5 ul miRNA mimischen Oligonukleotiden transfiziert. Nach 48 h der Transfektion wurden die Zellen für weitere Experimente geerntet. Zur stabil transfizierten Zellen wurden die Zellen mit Lentivirus bei 30% -50% Konfluenz transfiziert. Zielzellen (1 × 10 ^{4), einschließlich GC 9811-P und SGC7901-M-Zellen wurden infiziert mit 1 × 10 6 rekombinante Lentivirus-transduzierenden Einheiten in Gegenwart von 6 &mgr; g /ml Polybren (GENECHEM) .}

Invasion Assay

Die invasive Fähigkeit der Zellen, Transwells getestet wurde mit (8-um, Corning Costar Corp Porengröße). Die Transwells wurden in den Platten mit 24 Vertiefungen setzen. Zuerst wurden 0,1 ml Matrigel (50 ug /ml, BD Biosciences) wurde auf die Plattenoberfläche gegeben und 2 h inkubiert, und dann wurde der Überstand entfernt. Frisch trypsinisiert und gewaschenen Zellen (GC9811, GC9811-p, SGC7901-NM, SGC7901-M) wurden in RPMI1640, enthaltend 1% fötales Rinderserum suspendiert. Dann wurden 100 &mgr; l der Zellsuspension (1 × 10 ^{5 Zellen) wurden in die obere Kammer jedes Einsatzes hinzugefügt, die mit Matrigel beschichtet. Als nächstes wurde in das untere Kompartiment zugegeben 450 ul RPMI1640 10% fötalem Rinderserum, und die Zellen wurden für 24 h-48 h bei 37 ° C in einer 5% CO _{2 befeuchteten Inkubator eindringen gelassen. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit 95% absoluten Alkohol und mit Kristallviolett gefärbt fixiert. Zellen auf der oberen Oberfläche des Filters wurden mit dem Baumwolltupfer entfernt und die Zellen, die in der unteren Oberfläche des Filters wurden gezählt und abgebildet unter einem umgekehrten Mikroskop (Olympus Corp. Tokyo, Japan) bei 200 × Vergrßerung mehr als zehn eingedrungenen Zufalls Felder in jedem gut. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt.}}

Die Zellmigration

Die Fähigkeit von GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM und SGC7901-M-Zellen zu migrieren wurde unter Verwendung von Transwells nachgewiesen [8-um Poren Größe, Corning Costar Corp]. Die Transwells wurden in den Platten mit 24 Vertiefungen setzen. Frisch trypsinisiert und gewaschenen Zellen wurden in RPMI1640, enthaltend 1% fötales Rinderserum suspendiert. 5 x 10 ^{4 Zellen /Vertiefung in der oberen Kammer jedes Einsatzes (BD Biosciences, NJ), mit der nicht-beschichteten Membran platziert. 450 &mgr; l RPMI1640 10% fötales Rinderserum enthielt, wurde in die untere Kammer gegeben. Nach Inkubation für 24 h-48 h bei 37 ° C in einer 5% CO _{2 befeuchteten Inkubator wurden die Zellen mit 95% absoluten Alkohol fixiert und mit Kristallviolett gefärbt. Die Zellen in der inneren Kammer wurden mit einem Baumwolltupfer entfernt und die an der Unterseite der Membran haftenden Zellen wurden bei 200 × Vergrßerung mehr als zehn zufälligen Feldern in jeder Vertiefung unter einem umgekehrten Mikroskop (Olympus Corp. Tokyo, Japan) gezählt und abzubildenden . Jedes Experiment in dreifacher Ausführung durchgeführt wurde.}}

In-vivo-Metastase Assay

Für die in vivo Metastasierung Assays, die stabilen Zelllinien GC9811-P und SGC7901-M wurden aus Gewebekulturflaschen nach der Transfektion geerntet mit der lentivirus pGCsil-GFP- let-7f und pGCsil-GFP steuern unter Verwendung von Trypsin und dreimal mit PBS. Dann 2 × 10 ^{6 Zellen wurden in 0,2 ml serumfreiem RPMI1640 für jede Maus (sechs in jeder Gruppe, Fale BALB /c-nu /nu, 6-8 Wochen alt) suspendiert und die Zellen wurden in die injizierte Schwanzvene. Nach vier Wochen der Injektion wurden die Mäuse getötet. Lebergewebe wurde mit dem bloßen Auge beobachtet, und die Anzahl der sichtbaren Tumoren in der Leber Oberfläche gezählt. Die Lebergewebe wurden in serielle Abschnitte unterteilt, die mit phosphatgepufferter neutralem Formalin fixiert, gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin und histologisch untersucht. Nacktmäuse wurden manipuliert und gepflegt nach NIH Animal Care und Use Committee Richtlinien im Experiment Animal Center der Vierten Military Medical University (Xi'an, Provinz Shanxi, VR China).}

Luciferase Reporter Assay

Um zu untersuchen, ob MYH9 Ausdruck von let-7f, ein Dual-Luciferase-Reportertest durchgeführt wurde, geregelt wurde. Das 3 'UTR von MYH9 enthält let-7f Bindungsstelle wurde durch PCR amplifiziert. Amplifikation von MYH9 verwendet, um die folgenden Primer: (Forward) XhoIF: 5'CCGctcgagGCCTCTTCTCCTGCAGCCTG 3 '(Rückwärts) NotIR: 5'ATAAGAATgcggccgcTCGTAGCACATGGTTCTCTTTATTG 3'

Als negative Kontrolle, die mutierte Bindungsstelle des 3'-UTR-Sequenz (unter Verwendung der reversen Komplement der Bindungsstelle) wurde unter Verwendung der Primer amplifiziert: (Forward) mutlet7MYH9F: 5'TTGCAATCACACGTGGTGTGGAGTCACACCTCTGCCCCTTGG3 '(Rückwärts) mutlet7MYH9R: 5'CCAAGGGGCAGAGGTGTGACTCCACACCACGTGTGATTGCAA 3'. Produkte wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese wiedergewonnen und in den Luciferase-Reporter PsiCHECK Vektor kloniert (Promega, Madison, WI). Alle Konstrukte wurden durch Sequenzierung verifiziert. Log-Phase GC9811-P Zellen wurden in 24-Well-Platten und cotransfiziert mit Let-7f Inhibitoren oder Kontrolle, und die Luciferase-Reporter unter Verwendung von Lipofectamin ™ 2000 (Invitrogen) gemäß den Anweisungen. Nach 48 h Inkubation wurde Glühwürmchen und Renilla-Luciferase-Aktivität mit dem Dual-Luciferase-Reporter-Assay-System (Promega) gemessen.

Western Blot

Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und abgeschabt in RIPA-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM Leupeptin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4) mit frisch-Protease-Inhibitor-Cocktail zugesetzt (Roche) für 15 min auf Eis, dann zentrifugiert bei 13000 rpm für 10 min und die Überstände wurden gesammelt. Zehn Mikrogramm jeder Probe wurde unter Verwendung von 6% SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Hercules, CA). Die Banden wurden mit 10% fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung 0,1% Tween-20 inkubiert, um die unspezifischen Bindungsstellen und mit einem primären Antikörper inkubiert, zu blockieren: polyklonalen Kaninchen-anti-human-Myosin IIA (verdünnt 1:500; Cell Signaling Technology ) über Nacht bei 4 ° C. Nach dem Wiedererwärmen und Waschen dreimal wiederholt, 15 min für jeden einzelnen wurden die Membranen mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology), verdünnt für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert 1:2000. Die Banden wurden unter Verwendung eines verstärkten Chemilumineszenz (Amersham Biosciences) nachgewiesen.

Immunhistochemie

Zwei Gewebearrays wurden aus SHANXI Chaoying CO BIOTECHNOLOGY erworben., LTD. Einer war Magenkrebsgewebe und angepaßt angrenzenden normalen Magengewebe, das andere Magenkrebsgewebe und angepaßt Lymphknotenmetastase .Tissue Arrays wurden in 60 ° C entwachst für 2 h, Hochtemperatur-Antigenrückgewinnung für 10 Minuten, rehydriert, in 10% bebrütet normales Ziegenserum für 1 h, dann mit Kaninchen-polyklonalen Anti-Human-Myosin II A (verdünnt 1:100; Cell Signaling Technology) über Nacht bei 4 ° C. Die Objektträger wurden in PBS dreimal für jeweils 5 min gewaschen. Die Gewebe wurden in Ziegen-Anti-Kaninchen-Serum (DAKO) für 1 h, gespült mit PBS inkubiert. Die Schnitte wurden unter Verwendung von DAB und mit Hämatoxylin gegengefärbt detektiert. Die Färbungsintensität wurde eine vierstufigen Skala bewertet unter Verwendung von (0, 1+, 2+ oder 3+) und der Prozentsatz der positiven Zellen wurde durch drei verschiedene Pathologen (0 = keine geschätzt, 1 = < 1%, 2 = 1 -10%, 3 = 10-30%, 4 = 30-70%, 5 = > 70% der Tumorzellen). Gesamtdurchschnittswerte wurden dann in vier Kategorien unterteilt: negativ (keine nachweisbare Färbung im Vergleich zu nicht-spezifische Hintergrundfärbung ausgewertet, schwach (+), mittel (++) oder stark (+++) und verglichen mit Mann-Whitney-Test

Statistische Analyse

t-Test (two-tailed) Student, One-way ANOVA und Mann-Whitney-Test die in vitro und in-vivo-Daten unter Verwendung von SPSS 12.0 Software (Chicago, IL zu analysieren beschäftigt waren , USA) P-Wert. < 0,05 wurde als statistisch signifikant definiert * P
. < 0,05; ** P
. < 0,01

Ergebnisse |

Die Höhe der let-7f Ausdruck verringert wurde häufig in menschlichen GC metastatischen Zelllinien und Gewebe

Wir haben die mRNA Expression von in zwei Paaren von menschlichen Magenkrebszelllinien, GC9811, GC9811 let-7f untersucht haben -P und SGC7901-NM, SGC7901-M. Wie in 1A gezeigt ist, die Expression von let-7f war niedriger in den GC-Zellen, GC9811-P und SGC7901-M, mit hohem metastatischen Potential, während let-7f mehr wurde hochexprimierten in den GC-Zellen, GC9811 und SGC7901-NM mit niedrigem metastatischen Potential. Um die Rolle zu validieren von let-7f bei der Metastasierung Magenkrebszellen, verglichen wir die Expression von let-7f in frischen menschlichen Magenkrebs Gewebeproben mit Metastasen von acht Personen (Tabelle S1), in den normalen Magengewebe (NG), primäre Magenkrebsgewebe (GC) und Fernmetastasen Magenkrebsgewebe (MC), die jeweils von real-time PCR. Erstaunlicherweise gab es bemerkenswerte Herabregulation von let-7f in MC und GC, im Vergleich zu let-7f Ausdruck in NG (1B). Wir beobachteten, dass entweder den Verlust oder verminderte Expression von let-7f in Tumoren und ihre metastasierte Gewebe zu einer verstärkten Metastasierung bei Magenkrebs Gewebe. Die Ergebnisse legten nahe, alle, dass die Expression von let-7f negativ sehr eng mit einer verringerten GC Metastasen korreliert und könnte eine wichtige Rolle bei pathologischen Prozessen spielen. Wir haben somit klinische und zelluläre konzeptuelle Beweis für einen metastatischen Schalter in der Entwicklung von Krebs vorgesehen, die für die Expression von let-7f in der Entwicklung von Krebs eine wichtige Rolle schlägt.

Let-7f hemmte die invasive und metastatische Fähigkeit von GC-Zellen in-vitro-

da let-7f wirkt als Agitator in Invasion und Metastasen Prozesse, untersuchten wir die Auswirkungen auf weniger metastatischen Zelllinien let-7f verringert und erhöht let-7f auf mehr metastatischen Zelllinien. Um dies zu erreichen, wurden kurze interferierende RNA (siRNA) Oligonukleotide von let-7f konstruiert und eingeführt in GC9811 Zellen und SGC7901 -NM Zellen zur Metastasierung Assays in vitro, als GC9811-let-7F-siRNA-Zellen, SGC7901-NM-let-7f -siRNA Zellen und Kontrollzellen. Gleichzeitig Mimik-let-7f und negativen Kontroll-Oligonukleotide wurden ebenfalls konstruiert und in GC9811-P-Zellen und SGC7901-M-Zellen für die Metastasierung Assays in vitro eingeführt, als GC9811-P-let-7f-mimische Zellen, SGC7901-N-hat lassen -7f-mimische Zellen und Kontrollzellen. Depletion von let-7f die Fähigkeit von GC9811 Zellen zu migrieren und dringen durch die Matrigel-beschichteten Membranen oder den nicht-Matrigel-beschichteten Membranen auf serumhaltigem Medium in einer modifizierten Boyden-Kammer-Assay (2A) wesentlich beeinträchtigt. Erhöhte Expression von let-7f die Fähigkeit der GC9811-P-Zellen signifikant unterdrückt zu migrieren und dringen durch Matrigel-beschichtete Membranen oder nicht-Matrigel-beschichteten Membranen auf serumhaltigem Medium in einer modifizierten Boyden-Kammer-Assay (2B) im Vergleich mit die Kontrollzellen. Ähnliche Ergebnisse wurden in SGC7901-NM-Zellen (3A) und SGC7901-M-Zellen (3B), während let-7f Knockout in GC-Zelllinien führte zu höheren Invasion und Migrationsraten.

Let-7f hemmt gefunden Tumorinvasion und Metastasierung in einem Nacktmaus-Xenotransplantat-Modell

GC9811-P oder SGC7901-M transfizierten Tumorzellen mit der lentivirus pGCsil-GFP- let-7F oder negative Kontrolle pGCsil-GFP in Nacktmäuse injiziert und die Mäuse wurden vier Wochen nach der Inokulation getötet. Die Zahl der metastatischen Nodi wurde in Nacktmäusen mit den pGCsil-GFP- let-7f transfizierten Zellen injiziert dramatisch reduziert, im Vergleich zu den Negativkontrollen (4A, 4B). Diese Daten liefern starke Beweise dafür, dass-7f lassen können Tumorinvasion und Metastasierung in vivo hemmen.

Let-7f downregulates Myosin IIA-Expression durch direkt Targeting seinem 3'-UTR

Um den Mechanismus erforschen, indem die let-7f Unterdrückt GC Invasion und Metastasierung, wir potenzielle nachgeschaltete Tumormetastasierung bezogenen Zielgene in silico analysiert. Wir konzentrierten uns auf let-7f Zielgene, insbesondere solche Gene, die Migration waren und /oder Invasion bezogenen und festgestellt, dass Myosin IIA, bei der Förderung der Krebszellmigration oder Invasion beteiligt sind, könnte das Zielgen von let-7f sein. In dem Bemühen, ob Myosin IIA zu bestimmen, wird reguliert durch let-7f durch direkte Bindung an seinem 3'-UTR, konstruierten wir Wildtyp und Mutanten-Fragmente MYH9 mRNA 3 voller Länge 'UTR und eingefügt sie in den Bereich unmittelbar hinter ein Luciferase-Reportergen (5A). Anschließend let-7f mimic Oligos wurden co-transfiziert mit verschiedenen Luciferase 3 'UTR-Konstrukten in GC9811-P-Zellen. Wir fanden, dass let-7f der relativen Luciferase-Aktivität in Wildtyp-3 'UTR von MYH9 (5B) verringert. Allerdings hat die Luciferase-Aktivität nicht scharf in den UTR mit mutierten Bindungsstellen fallen, im Vergleich zu den mut-Typ Pendants (5C). Diese Daten stützen, daß MYH9 unmittelbare Ziel let-7f ist.

RT-PCR zeigte, dass die Expression von MYH9 in GC9811 Zellen und SGC7901-NM-Zellen transfiziert mit let-7F-Mimetika wird herunterreguliert im Vergleich zu den Zellen, transfiziert mit Kontrollstrukturen (5D). Western-Blot-Ergebnisse zeigten eine Expression von Myosin IIA in GC9811 und SGC7901-NM-Zellen, die mit let-7f-Mimetika sind herunterreguliert im Vergleich zu denen, transfiziert mit Negativkontrolle (5E). Furthmore, Real-time PCR zeigt, dass die mRNA relative Expression der MYH9 in GC Geweben und entfernten metastatischen Gewebes herabreguliert im Vergleich zu ihren normalen benachbarten Nicht-Krebsproben (6A). Immunhistochemie zeigte, dass die Expression der Myosin-IIA in GC Lymphknotenmetastase hochreguliert im Vergleich zu seinem primären GC Gewebe (Tabelle 2; 6C; Fig S1B), und es ist hochreguliert in GC Gewebe im Vergleich zu seinem abgestimmten angrenzenden normalen Magen Gewebe (Tabelle 1; 6B; Abbildung S1A) .Diese Daten zeigen, dass let-7f herunterregulieren können die mRNA-Expression von MYH9 und Proteintranslation davon

Diskussion

verdrängen In. in der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass let-7f Expression in metastatischen GC-Zelllinien nach unten reguliert wurde, als in nicht-metastasierten GC-Zellen zu let-7f Ausdruck verglichen. Die ektopische Expression und siRNA Knockdown von let-7f bestätigte seine Invasion-unterdrückende Aktivität in vitro und in vivo. Darüber hinaus zeigen wir, dass MYH9 ein direktes Ziel für let-7f und das let-7f vermittelte Unterdrückung von MYH9 ist auf seinem 3'-UTR abhängig ist. Daher streichen diese Ergebnisse die Bedeutung von let-7f als Tumorsuppressor in Zellinvasion und Metastasierung von MYH9 bei Magenkrebs-Targeting.

Neuere Studien zeigen, dass miRNAs als Aktivatoren oder Inhibitoren von Tumormetastasen wirken kann [27] . Zum Beispiel microRNA-10b [28], miR-373 und miR-520c [29], [30] angeregt Krebszellmigration und Invasion in Brustkrebs. Zusätzlich miR-155 können Tumorinvasion und Metastasierung bei Brustkrebs durch Herunterregulieren sein Ziel, RhoA [31] und zur Förderung der Tumorinvasion und Metastasierung in Pankreasgangkarzinom durch Unterdrückung der Expression von TP53INP1 [32] zu fördern. Die miRNA-200-Familie (miRNA-200a, miRNA-200b, miRNA-200c, miRNA-141 und miRNA-429) können Tumorinvasion und Metastasierung durch die EMT Regelung [33] hemmen. MiR-126 wurde gefunden, Zelladhäsion, Migration und Invasion teilweise durch die Unterdrückung von CRK in einem in vitro-Modell von nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom zu hemmen [34]. Es hat sich gezeigt, dass miR-29c deutlich in sehr invasive und metastatische Nasopharynxkarzinoms reduziert wird [35]. MiR-218 hemmt die Invasion und Metastasierung von Magenkrebs durch die Robo1 Rezeptor-Targeting [26]. Obwohl viele Studien, die den Mechanismus der miRNA und Tumormetastasierung zu untersuchen, wurde der Mechanismus nicht klar gemacht worden sind. Am wichtigsten ist, haben nur wenige Studien über die Mechanismen der GC Metastasierung Regulation durch MikroRNA geschehen.

Die let-7f Gen wird bei 9q22.3, und ist in einer Vielzahl von physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt sind, einschließlich der Angiogenese [36], Immunozyten Differenzierung [37], replikative Seneszenz [38], Wachstumsstillstand [39], pulmonaler arterieller Hypertonie und Karzinogenese [23]. Let-7f in mehreren malignen Erkrankungen nach unten reguliert wird. Ein hoch charakterisierten Beispiel Nierenzellkarzinom, bei der let-7f zu einer signifikanten Abnahme der Kallikrein (KLK) expression [40] geführt Herunterregulierung. KLKs kann auch durch let-7f bei Eierstockkrebs [25] ausgerichtet sein. In papillären Schilddrüsenkrebs, verminderte Expression von let-7f könnte eine wesentliche molekulare Ereignis in RET /PTC malignen Transformation [41] sein. Im Fall von primärem Brustkrebs jedoch let-7f nach oben reguliert wurde, wenn in den normalen benachbarten Tumorgewebe verglichen [22]. In unserer Studie haben wir gezeigt, dass let-7f auch im MC Geweben und GC-Zelllinien mit hohem metastatischem Potential nach unten reguliert wird, und wir untersucht weiter den Mechanismus, mit dem let-7f reduziert Tumorinvasion und Metastasierung.

MYH9 ist das Gen für non-muscle Myosin schwere Kette IIA (NMHCIIA), dessen Mutationen sind verantwortlich für eine komplexe Erkrankung MYH9 bezogenen Krankheit genannt, durch eine Kombination von unterschiedlichen phänotypischen Merkmale aus [42]. NMMHC-IIA, ein 1960 Aminosäuren-Polypeptid mit einer übersetzten Molekulargewicht von 220 kDa, ist ein herkömmlicher, nicht-sarcomeric in den meisten Zellen und Geweben exprimiert Myosin. Zu seinen Aufgaben gehören Rollen in Cytokinese, Zellmotilität und Aufrechterhaltung der Zellform [43]. Viele Studien deuten darauf hin, dass MYH9 /NMHC-IIA eine Schlüsselrolle bei der Tumorzelle invasive behavior.For Beispiel hat der EGF-abhängige Phosphorylierung der Myosin-IIA schwere Kette hat eine direkte Rolle Motilität und Chemotaxis in MDA-MB-231 Mensch in der Vermittlung Brustkrebszellen [44]. Myosin IIA scheint ein wichtiger zellulärer Ziel MTS1 zu sein [45], die geringe Calcium-bindendes Protein Metastasin-1 und co-lokalisiert mit MTS1 zur Vorderkante Krebszellen von migrierenden [46]; MTS1 beeinflusst sowohl das Organisationsverhalten von Myosin IIA und seine Phosphorylierung [47], [48]. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht impliziert MYH9 (NMHC-IIA) als Ziel von SRF, die Invasion und Metastasierung bei Brustkrebs beiträgt [49]. Unsere Daten zeigen, dass die direkte MYH9 Ziel von let-7f, das durch Bindung des 3'-UTR von MYH9 Invasion und Metastasierung inhibiert, die in der Herunterregulierung von Myosin IIA-Expression führte.

Abschließend unsere Studie zeigt, dass let-7f kann durch die direkte Bindung des 3'UTR von MYH9, dessen Ziel die Invasion und Metastasierung von Magenkrebs unterdrücken. Zwar gibt es noch viel zu lernen über die Rolle von let-7f bei Magenkrebs tumorigenesis ist, let-7f uns für Magenkrebs Behandlung mit einem neuen potenziellen Ziel bietet.

Grundinformationen
Abbildung S1. Die Expression von MYH9 in Magentumorproben
. (A) Expression von MYH9 in primären Magenkrebs (Ca) und den angrenzenden normalen Magengewebe (N) durch IHC. (B) Die Expression von MYH9 in primären Magenkrebs (Ca) und ihre angepassten Lymphknotenmetastasen Gewebe (M) von IHC
doi:. 10.1371 /journal.pone.0018409.s001
(TIF)
Tabelle S1.
klinisch-pathologische Merkmale in 8 frischen Magentumorproben.
doi:. 10.1371 /journal.pone.0018409.s002
(DOC)

Acknowledgments

Wir sind dankbar, dass Zheng Chen für exzellente Führung während des Experiments

• PLoS ONE: Onkogene CagA Fördert Magenkrebsrisiko durch Aktivierung von ERK Signalwege: Eine eingebettete Fall-Kontroll-Studie
• PLoS ONE: Wnt /β-Catenin Signaling Verstärkt Cyclooxygenase-2 (COX-2) Transkriptionsaktivität in Magenkrebszellen