PLOS ONE: múltiple a múltiples relaciones entre los microARN y los genes diana en el cáncer gástrico

Resumen

Los microARN (miARN) actuar como reguladores de la transcripción y juega un papel fundamental en la carcinogénesis. De acuerdo con las bases de datos miARN, uno miARN puede regular muchos genes como sus objetivos, mientras que un gen puede ser el blanco de muchos miRNAs. Estos hallazgos indican que las relaciones entre miRNAs y sus objetivos pueden no ser uno-a-uno. Sin embargo, muchos informes han descrito solamente un uno-a-uno, uno-a-múltiple o múltiple a-uno entre los genes miARN y su gen diana en los cánceres humanos. Por lo tanto, es necesario determinar si es o no una combinación de algunos miRNAs regularía múltiples objetivos y estar integrados en la carcinogénesis. Para encontrar algunos grupos de miRNAs que pueden regular de forma sinérgica sus objetivos en el cáncer gástrico humano (GC), que volvieron a analizar nuestros datos miARN expresión serie anterior y se encontró que 50 miRNAs fueron reguladas en el tratamiento con 5-aza-2'- desoxicitidina en una línea celular GC. La base de datos destino miARN "TargetScan" predicho que algunos de estos miRNAs tienen genes diana comunes. También nos hemos referido a la base de datos de GEO para la expresión de estos genes diana comunes en los GC humana, que podrían estar relacionados con la carcinogénesis gástrica. En este estudio, se analizaron dos combinaciones de genes miARN, miR-224 y -452, y miR-181c y -340. La sobreexpresión de las dos combinaciones de genes miARN drásticamente las reguladas sus genes diana, DPYSL2
y KRAS
, y KRAS
y MECP2
, respectivamente. Estas combinaciones de genes miARN disminuyó sinérgicamente la proliferación de células después de la transfección. Además, reveló que estos miRNAs se redujeron regulado a través de la hipermetilación del promotor en las células de GC. Por lo tanto, es probable que las relaciones entre miRNAs y sus objetivos no son uno a uno, sino de múltiples a múltiples en GCs, y que estas relaciones complejas pueden estar relacionados con la carcinogénesis gástrica

Visto:. Hashimoto y, Akiyama y, Yuasa y (2013) múltiple a múltiples relaciones entre los microARN y los genes diana en el cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (5): e62589. doi: 10.1371 /journal.pone.0062589

Editor: Hiromu Suzuki, de la Universidad Médica de Sapporo, Japón

Recibido: 14 Diciembre, 2012; Aceptado: March 24, 2013; Publicado: May 8, 2013

Derechos de Autor © 2013 Hashimoto et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del programa de prospectiva A3 de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP) (YY), y becas de investigación de las JSP para jóvenes científicos (YH). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

microARNs (miARN), una clase de pequeños ARN no codificantes de proteínas, se han identificado como un nuevo tipo de regulador de gen que se unen a las regiones 3 'no traducidas (UTRs) de ARNm diana, dando como resultado de ese modo en la degradación del ARNm o el bloqueo de la traducción del mRNA [1]. En general se sabe que las alteraciones de genes miARN están asociados con la tumorigénesis [1]. De acuerdo con las bases de datos miARN, uno miARN puede regular muchos genes como sus objetivos, mientras que un gen puede ser el blanco de muchos miRNAs. Sin embargo, numerosos estudios revelaron una relación de uno a uno entre miARN y su gen diana. También se ha informado de que múltiples o un grupo de miRNAs regular co-operativamente un gen, que está relacionada con la carcinogénesis [2] - [4]. Por otra parte, múltiples genes están dirigidos por uno de los genes miARN [3], [4]. Incluso con múltiples a múltiples relaciones entre miRNAs y objetivos se han reportado mediante el uso de análisis computacional [5], [6]. Sin embargo, ha habido sólo unos pocos documentos que validan experimentalmente múltiples a múltiples relaciones en las células cancerosas.

El cáncer gástrico es la cuarta enfermedad maligna humana más común y la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer en todo el mundo, con un estimado de un millón de nuevos casos por año [7]. Los cánceres gástricos se clasifican histológicamente en dos tipos principales, los tipos intestinales y difusos [8]. De tipo difuso GC es a menudo intratable y exhibe un mal pronóstico del paciente. Recientemente, hemos demostrado que la pérdida de las funciones Cdh1 y Trp53 induce tipo CG difuso utilizando modelos de ratones [9]. Aunque este hallazgo nos ayudará a desarrollar nuevas terapias humanas de cáncer gástrico, nuevas investigaciones sobre la carcinogénesis gástrica mecanismos moleculares subyacentes son necesarias para desarrollar otros enfoques para la terapia dirigida
.

Promotor de la isla CpG hipermetilación es uno de los mecanismos más comunes por el que los genes supresores de tumores se inactivan en los cánceres humanos [10]. Recientemente, se ha puesto de manifiesto que algunos miRNAs también son objetivos de silenciamiento epigenético en cáncer [11]. Nuestros grupos y otros han demostrado previamente que la interrupción farmacológica o genética de la metilación del ADN en líneas celulares de cáncer induce sobre regulación de un número considerable de miRNAs [12] - [15]. Estos datos llevaron a la identificación de miRNAs con el tumor supresor candidatos cuyo silenciamiento está asociada con la isla CpG metilación. Hasta ahora, la metilación de miembros de la familia miR-124 se ha identificado en el cáncer colorrectal y en los tumores de otros órganos [11]. Además, el grupo de miR-34b /c tiene una típica isla CpG, y es el regulado a través de la metilación frecuente en el cáncer gástrico y colorrectal [12]. Del mismo modo, se encontró que la metilación de miR-181c está asociado con la carcinogénesis gástrica a través de la regulación de los genes oncogénicos KRAS
y Notch4
[13]. El descenso de regulación de muchos miRNAs través de la metilación se produce simultáneamente en las células cancerosas, y puede mejorar-múltiple de múltiples relaciones entre los miRNAs y objetivos.

En este estudio, para validar múltiples a múltiples relaciones entre miRNAs y objetivos en las células cancerosas, hemos demostrado que dos pares de múltiples miRNAs, miR-224 y -452, y miR-181c y -340, tenían múltiples genes diana y sinérgicamente disminución de la proliferación celular a través de la regulación de sus objetivos en las células humanas GC.

resultados

50 miRNAs fueron hasta reguladas en una línea celular GC, KATO-III, después de 5-aza-2'- desoxicitidina Tratamiento

Para identificar miRNAs candidatos que afectan a su forma sinérgica genes diana, nos re-analizados nuestra microarrays de datos anteriores (GEO nº de acceso GSE16006) [13]. Se consideró que los niveles de miARN fueron reguladas en el tratamiento 5-aza-2'- desoxicitidina (5-aza-CDR) cuando las intensidades netas de particulares 3 puntos eran más de 1,5 veces. miRNAs Por otra parte, también seleccionadas de las que se encontraron los promedios que se incremente más de 3 veces en el análisis de microarrays. Sobre la base de estos nuevos criterios, se encontró que 50 miRNAs son regulados hasta en una línea celular GC, KATO-III (Tabla S1). Se confirmó la regulación de 5 de 6 miRNAs precursores representativas, es decir, el miR-145, -148a, -152, -224 y -340, después de 5-aza-CDR tratamiento por RT-PCR (Figura 1A).

TargetScan predicha del objetivo común de los genes de los candidatos miRNAs

para determinar si o no regulados epigenetically miRNAs tienen genes diana comunes, se realizaron búsquedas en la base de datos TargetScan (versión 5.1) para sus objetivos comunes. Según TargetScan, 50 miRNAs podrían clasificarse en 46 grupos basados ​​en sus secuencias de semillas. TargetScan también mostró que estos 46 grupos pueden dirigirse a 6.460 genes. Entre estos genes diana, se seleccionaron 13 de los cuales se informó de la expresión que aumentarse en GC en la base de datos GEO (GEO adhesión No. GSE2685) o estar relacionada con la carcinogénesis gástrica (Tabla S2). Aquí, nos centramos en cuatro miRNAs, MIR-152, -181c, -224 y -340, porque ya hemos informado de que el miR-181c es epigenetically el regulado en GC [13] y las islas CpG están ubicados en las regiones de aguas arriba otros tres miRNAs (Figura 2A y C, y la Figura S1). La figura 2a también revela que el miR-452 está agrupado con el miR-224. TargetScan predijo que los cinco miRNAs pueden regular objetivos comunes. Por ejemplo, DPYSL2 gratis (dihidropirimidinasa 2 similar, también conocido como el colapso de respuesta de las proteínas mediador 2, CRMP2
) está dirigido por el miR-224, -452 y -181c, KRAS fotos: por miR-224, -452, -181c, -340 y -152, y MECP2 gratis (proteína de unión a metil CpG 2) por el miR-181c y -340, respectivamente (Figura 3).

la expresión de miR-224, -452, -152 y -340 Disminución en el ADN hipermetilación en líneas celulares de GC

Hemos examinado la implicación de los cambios epigenéticos en la baja regulación de los miRNAs. La expresión de miR-224, -340 y -152 se aumentó en 5-aza-CDR tratamiento en varias líneas celulares GC (Figura 1B). Hemos analizado cuantitativamente la expresión de miR-224 madura en 9 líneas celulares GC y una línea celular de cáncer colorrectal (CCR). Ninguna expresión de miR-224 se detectó en 7 de 10 líneas celulares de cáncer (Figura 1C). También se analizó el cambio de expresión de la agrupación miR-224 /-452 en células KATO-III tratados con una dosis baja de 5-aza-CDR (0,2 mol /l), un inhibidor de la histona desacetilasa, tricostatina A (TSA, 0,3 mol /l), o una combinación de estos dos fármacos. células KATO-III con el tratamiento de dosis baja 5-aza-CDR mostraron sobre regulación de la agrupación de miR-224 /-452, mientras que la TSA solo no causó regulación. El cúmulo de miR-224 /-452 se sinérgicamente hasta reguladas en las células KATO-III con la combinación 5-aza-CDR y el tratamiento de la TSA (Figura 1D). Estos resultados indican que el miR-224 y miR-452 pueden ser regulados hacia abajo a través de la metilación del ADN en líneas celulares de GC como la misma unidad de transcripción.

Se ha informado de que los miRNAs intrónicas están regulados a través de la metilación del promotor de su anfitrión genes [14], [15]. De acuerdo con los resultados del análisis computacional, el miR-224 /-452 clúster y miR-340 se encuentran en el intrón 6 en GABRE
y el intrón 2 en RNF130
, respectivamente, ambos de los cuales contienen las islas CpG densos sólo en las regiones promotoras de los genes del huésped (Figura 2 a y C). Se investigó la relación entre los niveles de expresión de estos miRNAs y el estado de metilación de los genes en líneas celulares anfitrionas GC mediante análisis de MSP. líneas celulares de GC sin miR-224 expresión exhibida sólo señales de metilación, mientras que las líneas celulares de expresión positivos mostraron fuertes patrones no metilación (Figura 2B). Se detectó una relación similar para el miR-340 en líneas de células GC (Figura 2D). Estos datos indican que la expresión de estos miRNAs en líneas celulares de GC puede ser silenciada a través de la metilación del promotor de sus genes del huésped.

epigenetically miRNAs Regulados podría estar relacionado con la proliferación de células GC

Para determinar si epigenetically regulada miRNAs son supresores de tumor o no, se evaluó el efecto de 5-aza-CDR-transfectadas en siDICER1 KATO-III y DICER1 KO HCT116 (D1KO) células (Figura 4A). Las células HCT116 no tratados KATO-III y parentales mostraron proliferación desacelerado después del tratamiento con 5-aza-CDR. Por otra parte, en células KATO-III y D1KO transfectadas con siDICER1, el efecto del tratamiento 5-aza-CDR sobre la proliferación celular se debilitó en ambos casos. Estos resultados sugieren que el efecto de 5-aza-CDR se redujo en las células de baja o nula DICER1, y que los miRNAs epigenetically regulados jugar un papel importante en GC y células CRC.

Con el fin de analizar la relación entre éstos miRNAs y 13 genes diana que se muestran en la Tabla S2, se transfectaron células KATO-III con siDICER1 y /o tratados con 5-aza-CDR. Si bien, la expresión de 3 ( DPYSL2
, KRAS
y MECP2
) de los 13 genes se redujeron después de 5-aza-CDR tratamiento, la expresión de estos genes hizo no cambie el 5-aza-CDR tratamiento seguido de transfección de siDICER1 (Figura 4B).

combinacional la transfección de miR-224 y -452 GC proliferación celular reprimida

transfectan líneas celulares con GC miR-224 y /o -452 imita como un representante de las agrupaciones de genes miARN, o un control negativo, y luego llevar a cabo de tetrazolio-8 ensayos (WST-8) resuelto con el agua. Setenta y dos horas después de la transfección, se observó que la expresión ectópica de miR-224 o -452 suprime el crecimiento de dos líneas celulares, KATO-III y AGS (Figura 5A). En particular, la transfección combinatorio del miR-224 y -452 imita ampliamente disminuyó el crecimiento de las líneas celulares de dos GC (Figura 5A).

El miR-224 /-452 Cluster Copropiedad disminución de expresión de DPYSL2
y KRAS

para investigar si o no el clúster de miR-224 /-452 está realmente relacionado con la regulación de los DPYSL2
y KRAS
, se analizó la expresión de DPYSL2
después de la transfección de las células KATO-III y AGS con el clúster de miR-224 /-452 solos o en conjunto. Se llevó a cabo RT-PCR y análisis de Western blot. El DPYSL2
y KRAS
niveles de mRNA se redujeron después de la transfección con el miR-224 o miR-452 imitan (Figura 5B). Curiosamente, en el caso de la transfección combinacional con miR-224 y -452, la expresión de estos genes diana fue más baja regulado (Figura 5B). La baja regulación de DPYSL2 también se observó a nivel de proteínas en las dos líneas celulares (Figura 5C). También se examinaron los niveles de expresión de otros cinco genes, MECP2, MYC, JUNB, MUC1
y SETDB1
, que no se muestra como objetivos para el miR-224 o -452 por TargetScan. Como era de esperar, no se encontraron cambios expressional de estos cinco genes en las células KATO-III después de la transfección con miR-224 o -452 (Figura S2). Estos datos sugieren que el miR-224 y -452 específicamente regulados hacia abajo DPYSL2
y KRAS
.

DPYSL2
fue asociadas con la proliferación celular GC

se examinó el efecto de la caída de DPYSL2
, que ha demostrado ser un objetivo de la agrupación de miR-224 /-452, sobre la proliferación celular. La transfección de DPYSL2
siRNA redujo claramente los niveles de la DPYSL2
transcripciones (Figura 5D), y se inhibe el crecimiento de células AGS y Kato-III de 72 horas después de la caída de DPYSL2 gratis (Figura 5E), lo que indica que DPYSL2 tiene una actividad oncogénica.

combinacional la transfección de miR-340 y GC proliferación celular -181c reprimida, e inducidos Down-regulación de KRAS
y MECP2
Expresión

Como un segundo ejemplo de múltiples a múltiples relaciones entre los microARN y los genes diana, se analizó la relación entre el miR-340 /-181c y KRAS /MECP2 .
Cuando el miR-340 y miR-181c se transfectaron en células KATO-III, la proliferación fue sinérgicamente las reguladas por dos miRNAs (Figura 6A). Para determinar si es o no regulada epigenetically miR-340 y miR-181c cooperativamente afectar a sus objetivos, se analizaron los niveles de mRNA de KRAS
y MECP2.
En el análisis RT-PCR, KRAS
y MECP2
resultaron ser las reguladas por el miR-340 y miR-181c solo, o la transfección combinatorio en células KATO-III (Figura 6B). En cuanto a los cuatro genes, MYC, JUNB, MUC1
y SETDB1
, que no muestran los sitios predichos para estos dos miRNAs por TargetScan, los niveles de expresión fueron no cambió en este estudio. Los datos representativos se muestran en la Figura 6B. Por lo tanto, los efectos de miR-340 y -181c pueden ser específicos de sus genes diana comunes, así como el miR-224 y -452.

Expresión y estado de metilación de miR-224 y -340 en casos de CG primarias

Hemos examinado el estado de metilación de miR-224 y -340 en casos GC primarios. Se detectaron patrones metilados de miR-224 en 15 de 26 (57,7%) GC tejidos primarios (Figura 7A y en la Tabla 1). mucosa gástrica no canceroso emparejado casi no mostró un patrón de metilación de miR-224. A continuación, se analizó cuantitativamente los niveles de miR-224 en los tejidos de las mucosas GC primarios y no canceroso correspondiente por RT-PCR TaqMan. Se observó una reducción significativa de la expresión de miR-224 en los tejidos de GC en los casos de cáncer de metilación positivo en comparación con los de metilación-negativas y las mucosas gástricas no cancerosas (Figura 7C).

Además, se analizó la DPYSL2
niveles de mRNA en comparación con el estado de metilación de miR-224 en los tejidos: GC GC con miR-224 metilación (Ca miR-224 Mt), GCS con miR-224 no metilación (Ca miR-224 Un), y no tejidos con cancerosa no metilación (N miR-224 ONU). El DPYSL2
nivel de ARNm en el grupo de "Ca miR-224 Mt" fue significativamente más altos que los de la "N miR-224 Un" y "Ca miR-224 UN" grupos p = 0,049, p = y 0.035, respectivamente (Figura 7D). Por lo tanto, existe una correlación entre el estado de metilación de miR-224 y DPYSL2
expresión en tejidos GC.

La frecuencia de metilación de miR-340 fue relativamente baja en los tejidos GC primarios probados (4 de 26, 15,4%) (Figura 7B y en la Tabla 1), mientras que ninguno de los 26 emparejado mucosa gástrica no canceroso exhibió los patrones de metilación aparentes de miR-340. En cuanto a los análisis de metilación de miR-152, probamos tres conjuntos de cebadores diseñados en la región aguas arriba de miR-152 que contienen las islas CpG (Figura S1), pero ninguno de ellos totalmente casado el miR-152 expresión en el MSP analiza (datos no mostrados).

Discusión

Aunque se ha informado de que la expresión de algunos miRNAs se reduce en varios tipos de cáncer a través de la metilación del ADN, la mayoría de los informes se describe que la relación entre la expresión aberrante de miRNAs y sus genes diana era uno-a-uno, uno-a-múltiple o múltiples a uno. Para examinar la posibilidad de múltiples a múltiples relaciones entre los miRNAs y objetivos en las células cancerosas, nos centramos en dos combinaciones de miRNAs en células de GC, el miR-224 /-452 clúster, y miR-181c y -340, en este estudio . Se encontró que los dos conjuntos de miRNAs, MIR-224 y -452, y miR-181c y -340, tenían múltiples genes diana, DPYSL2
y KRAS
, y KRAS
y MECP2
, respectivamente, y sinérgicamente disminución de la proliferación celular en líneas celulares de GC humanos. Es notable que un oncogén, KRAS
[16], se encontró que ser el blanco de cuatro miRNAs, aunque los sitios de unión de los cuatro candidatos miRNAs son diferentes en la 3'-UTR de KRAS
(TargetScan). Hemos informado anteriormente de que el miR-181c reducido regulado Notch4
demasiado [13]. Por lo tanto, de múltiples a múltiples relaciones entre los miRNAs y metas se indicaron no sólo por la base de datos de análisis, sino también por los experimentos de transfección con células humanas.

líneas celulares GC-224-miR y /o -340-expresión-negativas hipermetilación señales expuestas en el análisis de MSP y la expresión de miR-224 y -340 restaurados en el tratamiento de agente de desmetilación. Por otra parte, la hipermetilación de miR-224 y -340 se observó con mayor frecuencia en los GC primarios que corresponde mucosas no canceroso. En los casos de metilación positivo miR-224, la expresión de miR-224 fue significativamente menor que en los de metilación-negativas. Estos datos indican claramente que la metilación aberrante del ADN es uno de los mecanismos fundamentales que subyacen a la baja regulación de miR-224 y -340 en las células de GC.

Hemos demostrado que la inhibición del procesamiento de miRNA por siDICER1 transfección o usando células DICER1 nocaut disminuido el efecto de 5-aza-CDR, es decir, disminución de la proliferación celular y la baja regulación de los genes diana, en GC y células CRC. Se ha informado de que la abundancia de DICER1, la enzima que cataliza la etapa final de maduración miRNA, está directamente asociado con la progresión del tumor [17]. Estos resultados sugieren que la regulación aberrante de los genes miARN la maduración contribuye a la formación de GC y CRC.

Hemos encontrado que el clúster de miR-224 /-452 se redujo reguladas de manera aberrante en los GC a través de la hipermetilación. La expresión aberrante de miR-224 también ha sido reportado en otros tumores. La expresión de miR-224, let-7F y miR-516a se reduce en el cáncer de ovario, y de forma sinérgica a regular la expresión de peptidasa relacionados calicreína-10 (KLK10) [18]. miR-224 es el regulado en líneas celulares de CRC resistente a metotrexato en comparación con la de las células sensibles [19]. Aquí también reveló que el estado de metilación de miR-224 se correlacionó con el DPYSL2
nivel de GC humana. En su conjunto, el miR-224 juega un papel importante como un supresor tumoral miARN en GC, así como en varios otros tipos de cáncer. Por el contrario, el miR-224 está regulado en los carcinomas hepatocelulares [20] y [21] meduloblastomas en comparación con los tejidos normales. Por lo tanto, se necesitan más estudios para aclarar el papel de miR-224 en la carcinogénesis.

Se investigaron los objetivos comunes de miRNAs epigenetically regulados hacia abajo. DPYSL2
ha demostrado ser baja regulado por el miR-224 y -452. DPYSL2 juega un papel importante en el establecimiento de la polaridad neuronal [22]. DPYSL2 también está implicado en las vías que regulan la proliferación de células no neuronales a través de su fosforilación por proteínas reguladoras. DPYSL2 sufre cambios dinámicos de fosforilación en respuesta al contacto quiescencia y la hiperfosforilación de la inhibición inducida de DPYSL2 se produce en un tumor [22]. Aunque el papel de DPYSL2 en GC no está claro, nuestra caída a base de siRNA de expresión DPYSL2 indujo una reducción de la proliferación en las dos líneas celulares GC, lo que sugiere la actividad oncogénica de DPYSL2.

En resumen, nuestros resultados indican que -múltiples y de múltiples relaciones entre miRNAs y genes diana realmente existen en GC. Es probable que la metilación aberrante disminuye la expresión de múltiples miRNAs-tumorales de supresión, tales como miR-224, -452, -340 y -181c, que luego inducir la sobre-expresión de múltiples genes oncogénicos, como KRAS
, DPYSL2
, y MECP2
. Estas relaciones anormales-múltiples a múltiples entre miRNAs y objetivos serían uno de los mecanismos importantes carcinogénesis gástrica subyacente. Es, por lo tanto, muy posible que los fármacos epigenéticos pueden normalizar la expresión no sólo de genes de tumor supresor sino también múltiples miRNAs-tumorales de supresión, lo que resulta en una disminución de las anormales-múltiples a múltiples relaciones entre miRNAs y objetivos, y por tanto pueden convertirse excelentes fármacos terapéuticos contra el cáncer.

Materiales y Métodos

ética Declaración

escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los sujetos y el comité de ética de Tokio Médico y la Facultad de Odontología de la Universidad Medicina aprobó esta investigación.

líneas celulares y muestras de tejidos

Se estudiaron 9 líneas de células GC (KATO-III, MKN45, AGS, MKN74, TGBC11TKB, HSC59, HSC43, HSC58 y GCIY), 2 líneas celulares de CRC 26 casos GC primarios (HCT116 y DICER1
knock out HCT116 [23]), y. MKN45, MKN74, TGBC11TKB y GCIY se adquirieron de banco de células RIKEN, y Kato-III y AGS fueron de ATCC (American Type Cell Collection). HSC59, HSC43 y HSC58 se obtuvieron del Dr. Kazuyoshi Yanagihara [24], [25]. KATO-III, MKN45, MKN74, HSC59, HSC43 y HSC58 se cultivaron en RPMI 1640, y AGS, TGBC11TKB, GCIY y las dos líneas celulares de CRC en Dulbecco del medio de Eagle modificado, medio esencial mínimo o 5A de McCoy, suplementado con 10% de bovino fetal suero. especímenes resecado quirúrgicamente a 26 pacientes GC primarios se obtuvieron al azar del Hospital Afiliado de la Facultad de Medicina, Tokio y Dental Medical University.

análisis in silico

Nos referimos a la base de datos GEO y miARN los perfiles de expresión génica (GEO nº de acceso GSE16006 y GSE2685). También utilizamos miARN base de datos destino "TargetScan".

Tratamiento de Drogas de las células y la extracción de RNA

Para los estudios de desmetilación, las células fueron tratadas diariamente con 5 mmol /l 5-aza-CDR (Sigma Aldrich, St Louis, MO) durante 72 h. También tratamos las células con 0,3 mol /l TSA solo, y con una combinación de 0,2 mol /l 5-aza-CDR y TSA. ARN total fue aislado utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) o un kit miRNeasy mini (Qiagen, Hilden, Alemania).

Cuantitativo en tiempo real de transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa

reacción en cadena de transcripción inversa-polimerasa en tiempo real (RT-PCR) análisis se llevaron a cabo utilizando un sistema de PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) StepOne en tiempo real, EagleTaq Master Mix con ROX (Roche, Mannheim, Alemania), una TaqMan Reverse Transcription kit (Applied Biosystems), y los ensayos TaqMan miARN (Applied Biosystems), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de expresión de los genes miARN se calculan en base de la cantidad de los genes miARN objetivo con respecto al de RNU6B como control para normalizar la entrada inicial de ARN total.

El análisis de metilación

tratamiento con bisulfito del ADN era realizado con Methylamp (Epigentek, Brooklyn, Nueva York). análisis específica de metilación reacción en cadena de la polimerasa (MSP) se realizaron como se describe anteriormente [26]. Las secuencias de los cebadores y tamaños de productos de PCR se muestran en la Tabla S3.

Sintético miARN transfección

células KATO-III y AGS fueron transfectadas con una molécula precursora imitando el miR-224, -452, -340 o -181c, o la secuencia codificada miARN (Sigma) para dar una concentración final de 25 a 50 nmol /l usando un electroporador, neón (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En 24-72 h después de la transfección, las células fueron cosechadas por RT-PCR o Western blot.

Ensayo de proliferación celular
células

-mímica transfectadas con el miR-KATO III y AGS se sembraron a 1 × 10 ^{3 o 1 × 10 4 células por pocillo en placas de 96 pocillos. La proliferación celular se evaluó en los días 1-4 después de la transfección mediante la determinación del número de células con reactivo de proliferación celular WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Mashikimachi, Japón), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.}

miRNA Predicción objetivo y Western Blot

Los objetivos de predecir miRNAs y sus lugares de destino se analizaron mediante TargetScan. Los niveles de expresión de ARNm de los objetivos previstos en las células transfectadas transitoriamente se analizaron 24 h después de la transfección por RT-PCR. Western blot análisis se realizaron como se describe anteriormente [26]. El anticuerpo primario utilizado fue de conejo anti-DPYSL2 (1:500;Ϋ3, Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Utilizamos ratón anti-α-tubulina (1:1000; sc-8085, Santa Cruz Biotechnology) como control interno para la transferencia Western. Los anticuerpos secundarios utilizados eran conjugada con fosfatasa alcalina anti-IgG de conejo y anti-IgG de ratón (1:2000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Las transferencias se desarrollaron con sustrato ImmunoStar AP (Bio-Rad Laboratories).

Apoyo a la Información
Figura S1.
Representación esquemática de la COPZ2
región que contiene el miR-152. cajas llenas representan los exones de COPZ2
A y un cuadro en blanco denota la región no traducida del COPZ2
. Una flecha doblada indica el sitio de inicio de transcripción de COPZ2
. Una flecha vertical indica la localización de miR-152. Las líneas verticales indican los sitios CpG. Las puntas de flecha indican las regiones examinadas para MSP
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062589.s001 gratis (TIFF)
figura S2.
Efectos de la transfección de miR-224 y -452 en las células KATO-III. RT-PCR análisis después de la transfección con el miR-224 y /o -452. La expresión de los genes diana se analizó 48 h después por RT-PCR. miR-224 y -452 específicamente regulados hacia abajo DPYSL2
y KRAS
, pero no otros cinco genes examinados, que son consistentes con los resultados del análisis de bases de datos (Figura 3).
doi: 10.1371 /journal.pone.0062589.s002 gratis (TIFF)
Tabla S1.
perfiles de expresión de miRNAs humanos en células KATO-III después del tratamiento 5-aza-CDR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062589.s003 gratis (XLSX)
Tabla S2. List de los genes diana de los que la expresión que examinó por RT-PCR tras el tratamiento con o sin 5-aza-CDR, y la transfección con 20 nmol /L de siDICER1 o revueltos siRNA
doi:. 10.1371 /journal.pone .0062589.s004 gratis (XLSX) sobre Table S3.
Las secuencias de los cebadores utilizados en este estudio
doi: 10.1371. /journal.pone.0062589.s005 gratis (XLSX)

Reconocimientos

Deseamos agradecer al Dr. Bert Vogelstein para proporcionar la línea celular HCT116 ronda DICER1.

• PLOS ONE: La hipoxia estimula la EMT de células de cáncer gástrico a través de autocrina TGF Signaling
• PLOS ONE: Flotillin2 expresión se correlaciona con los niveles de HER2 y mal pronóstico en gástrico Cancer