Persistente baja expresión de hZIP1 en los carcinomas mucinosos de ovario, colon, estómago y pulmón

Persistente baja expresión de hZIP1 en los carcinomas mucinosos de ovario, colon, estómago y pulmón
Resumen Antecedentes

carcinomas mucinosos de diferentes órganos son morfológicamente similares y podría compartir similitudes en los niveles moleculares y bioquímicos que pueden iluminar su patogénesis y la gestión de influencia. Los factores implicados en la patogénesis de carcinomas mucinosos siguen siendo desconocidas; que es probable que un contribuyente a la actual escasez de biomarcadores para la detección. Debido a los cambios de zinc están implicados en algunos tipos de cáncer, por ejemplo, de la próstata; se evaluó la posibilidad de un papel similar en los carcinomas mucinosos.
Métodos comentario El objetivo del presente trabajo es estudiar la expresión de hZIP1 por inmunohistoquímica en los carcinomas mucinosos, en comparación con el epitelio no neoplásico y los carcinomas convencionales. diapositivas de microarrays de tejidos que contienen los carcinomas mucinosos de ovario (n = 35
), colon (n = 51
), estómago (n = 32
) y pulmón (n = 21
) se utilizaron.
resultados
hZIP1 mostraron persistente baja expresión en comparación con mucinoso carcinomas de ovario seroso y el tejido normal (P
< 0,05), adenocarcinoma de colon y la mucosa normal (P
< 0,001), y adenocarcinoma gástrico y el epitelio normal (P
< 0,05). hZIP1 también mostró una baja expresión en carcinomas mucinosos pulmonares.
Conclusiones
hZIP1 disminuye constantemente en los carcinomas mucinosos de una variedad de órganos. A pesar de que estos resultados preliminares son poco probable que sea de mucha importancia diagnóstica, estos hallazgos sugieren que hZIP1 juega un papel fundamental en la carcinogénesis de los tumores mucinosos.
Estómago Palabras clave
zinc transportador hZIP1 mucinoso carcinomas de ovario de Colón de pulmón de fondo
Los estudios clínicos y pruebas experimentales han demostrado que los niveles de zinc disminuyeron sistemáticamente en el adenocarcinoma de próstata en comparación con glándulas prostáticas normales. La absorción transportador Zip1 zinc, además de otros miembros de los genes transportadores de zinc, es responsable de la absorción y la acumulación de zinc de la circulación en las glándulas normales contra el gradiente de concentración. Las glándulas prostáticas malignas presentan una regulación a la baja de Zip1, normalmente una proteína expresada de forma ubicua, la expresión que eliminará la absorción y la acumulación de zinc intracelularmente [1-4].
En contraste con el papel antes mencionado de zinc en la próstata, la papel de la expresión hZIP1 en los adenocarcinomas de otros órganos previamente no se ha examinado exhaustivamente. No existe tal fondo concluyentes para el cáncer de ovario epitelial, por ejemplo, que se considera uno de los menos entendidos de todos los cánceres malignos humanos [5]. Identificación de las alteraciones iniciales más importantes en el cáncer de ovario puede facilitar el desarrollo de mejores métodos para el diagnóstico precoz, a través del descubrimiento de epiteliales biomarcadores de cáncer de ovario, y para el desarrollo de enfoques terapéuticos más óptimas que se dirigen a las vías moleculares clave [6].
Hay pruebas de que se refiere zinc como agente supresor de tumores potencial y ZIP1
transportador como un gen supresor de tumor en algunos tipos de cáncer de ovario epitelial. Lightman et al. mostró una disminución muy significativa en la concentración de zinc de tejido ovárico maligno en comparación con sus contrapartes no neoplásicas [7]. Bae et al. mostró que el tratamiento de zinc de células OVCAR-3 ejerce efectos supresores de tumores con un aumento de la apoptosis [8]. El OVCAR-3 es una línea de ovario epitelial humano de células de cáncer que se estableció a partir de la ascitis maligna de un paciente con poco diferenciado "adenocarcinoma papilar" del ovario [9]. Una correlación significativa entre una disminución en los niveles sanguíneos y zinc cuero cabelludo-pelo con un aumento en la incidencia de cáncer de ovario se ha informado [7, 10]. Estos datos preliminares hacen que sea razonable esperar que hay una diferencia en los niveles de zinc entre las células malignas y no malignas que pueden estar relacionados con la alteración del transportador de la absorción de zinc; presumiblemente Zip1.
En los sistemas actuales de clasificación de los tumores de ovario, tumores mucinosos se clasifican como tumores epiteliales superficiales. tumores mucinosos primarios de ovario se clasifican en categorías benignos, borderline o malignos dependiendo de sus características histopatológicas. Las células neoplásicas pueden ser del tipo gastrointestinal, tipo endocervical, o mezclas de ambos tipos de células que existen en los tumores seromucosas [11]. Primarios carcinomas mucinosos invasivos de ovario son muy poco frecuentes, que representa sólo el 3-10% de todos los tumores epiteliales de ovario y tumores metastásicos, más comúnmente en el tracto gastrointestinal (GIT), son más comunes [12, 13]. Por lo tanto, la posibilidad de que un tumor mucinoso en el ovario es metastásico en lugar de carcinoma de ovario primario siempre debe ser entretenido. sitios primarios más comunes son GIT, especialmente el intestino grueso [14], apéndice [15, 16], y el páncreas [17] y menos comúnmente de estómago [18]. adenocarcinomas endocervicales en ocasiones se extienden al ovario [19].
La hipótesis de que los carcinomas mucinosos, independientemente del sitio diferente de órganos, pueden compartir similitudes en los niveles moleculares y bioquímicos, que se manifiestan por la morfología similar en diferentes sitios anatómicos. El sitio anatómico, obviamente, dictará el abordaje quirúrgico; Sin embargo, las características moleculares y bioquímicos podrían ser más útiles en el desarrollo y la composición de los protocolos de tratamiento adyuvante.
En este informe, muestran, por primera vez, un cuadro persistente de baja expresión de la proteína en los carcinomas mucinosos hZIP1 de diferentes órganos, incluyendo el ovario, colon, estómago y pulmón. La evidencia presentada en este documento apoya indirectamente la probabilidad de que ZIP1
gen es un paso esencial en el desarrollo de los tumores mucinosos.
: Resultados de la baja expresión de hZIP1 en los carcinomas mucinosos de ovario en comparación con alta expresión en los carcinomas serosos de ovario
la edad media de los pacientes con carcinomas de ovario fue 51,4 (rango de 22-81 años). microarrays de tejidos (TMA) compuesto por 17 el tejido ovárico normal, todos los cuales estaban fuertemente (3 +) positivo para hZIP1. El sesenta por ciento (21/35) de los carcinomas mucinosos fueron negativos (0) a débil (1+) positivo para hZIP1 (Fig. 1a). En cambio, la expresión hZIP1 fue moderadamente (2+) a fuertemente (3 +) positivo en el 91% (138/152) de los carcinomas serosos (Fig. 1b). La expresión de hZIP1 fue significativamente menor en carcinomas mucinosos de ovario en comparación con carcinoma seroso (1,3 frente a 2,6; p < 0,001) y el tejido de ovario normal (P = 0,015) (Fig 1c.). Higo. 1 hZIP1 expresión en carcinomas mucinosos y no mucinosos de ovario, colon, estómago y pulmón. IHC análisis se llevó a cabo en las diapositivas de microarrays de tejidos compuestos por 35 carcinomas mucinosos de ovario, 152 carcinomas de ovario seroso, 51 carcinomas mucinosos del colon, 129 adenocarcinomas de colon convencionales, 31 carcinomas mucinosos gástricos, 4 adenocarcinomas gástricos convencionales y 21 carcinomas mucinosos pulmonares. un carcinoma mucinoso de ovario negativo representativas en relación con el caso b carcinoma seroso fuertemente positiva para la proteína hZIP1. c Diagrama que muestra las puntuaciones medias hZIP1 IHC en carcinomas de ovario, mucinosos y serosos normales. d Representante débil carcinoma mucinoso del colon positiva en comparación con el caso de adenocarcinoma de colon correo convencional fuertemente positiva para la proteína hZIP1. f Diagrama que muestra las puntuaciones medias hZIP1 IHC en el epitelio normal del colon, mucinoso y adenocarcinomas de colon convencionales. carcinoma gástrico negativa g Representante mucinoso h en comparación con el caso de adenocarcinoma gástrico convencional fuertemente positiva para la proteína hZIP1. i diagrama que muestra las puntuaciones medias hZIP1 IHC en la mucosa gástrica normal, mucinoso y adenocarcinomas gástricos convencionales. j representativos débiles y fuertes k casos positivos pulmonares de carcinoma mucinoso de proteína hZIP1. ZIP1 proteína se visualizó utilizando DAB con contratinción de hematoxilina. Las flechas muestran las células negativas /positivas débiles mucinoso carcinoma. * No hay diferencias estadísticamente significativas
Hubo una menor expresión estadísticamente significativo de hZIP1 en bajo grado seroso en comparación con los carcinomas serosos de alto grado (P < 0,05). Además, hubo una menor expresión de hZIP1 en grado bajo en comparación con los carcinomas mucinosos de ovario de alto grado (P = 0,6). No hubo asociación entre el estadio clínico y anota hZIP1 IHC.
Baja expresión de hZIP1 en los carcinomas mucinosos frente alta expresión en el adenocarcinoma del colon convencional Francia El promedio de edad de los pacientes con carcinomas de colon fue 57,4 (rango de 20-90 ) años. TMA compuesta por 12 el tejido normal del colon de los cuales el 83% (10/12) fueron moderadamente (2+) a fuertemente (3 +) positivo para hZIP1. Cincuenta y cinco por ciento (28/51) de los carcinomas mucinosos fueron negativos (0) a débil (1+) positivo para hZIP1 (Fig. 1d). En cambio, la expresión hZIP1 fue moderadamente (2+) a fuertemente (3 +) positivo en el 96% de adenocarcinoma de colon convencional (124/129) de los casos (Fig. 1e). La expresión media de hZIP1 fue significativamente menor en carcinomas mucinosos del colon (1,7) en comparación con los adenocarcinomas de colon convencionales (2.8) y la mucosa colónica normal (2,2) (P
< 0,001). (Fig. 1f)
hZIP1 la expresión se redujo en función de la creciente grado en ambos tumores mucinosos y no mucinosos del colon con una diferencia estadísticamente significativa. No hubo asociación entre el estadio clínico y anota hZIP1 IHC.
Baja expresión de hZIP1 en los carcinomas mucinosos frente alta expresión en los adenocarcinomas convencionales del estómago Francia El promedio de edad de los pacientes con carcinomas gástricos fue de 56 (rango de 22 a 78 ) años. TMA compone de 5 epitelio gástrico normal, todos los cuales estaban fuertemente (3 +) positivo para hZIP1. El veintidós por ciento (7/32) de los carcinomas mucinosos fueron negativos (0) a débil (1+) positivo para hZIP1 (Fig. 1 g). Por el contrario, todos los casos de adenocarcinoma convencionales (n
= 4) fueron fuertemente (3 +) positivo para hZIP1 (Fig. 1H). La expresión de hZIP1 fue significativamente menor en carcinomas mucinosos gástricos en comparación con adenocarcinoma gástrico convencional (2,2 frente a 3; P
< 0,05). Y normal epitelio gástrico (P
= 0,027) (Fig. 1i)
la puntuación media de hZIP1 fue significativamente menor en los carcinomas mucinosos de alto grado del estómago en comparación con sus contrapartes de bajo grado (1,9 vs 2,7, p Restaurant < 0,01). No hubo asociación entre el estadio clínico y anota hZIP1 IHC.
Baja expresión de hZIP1 en los carcinomas mucinosos del pulmón Francia El promedio de edad de los pacientes con carcinomas mucinosos pulmonares fue de 55,1 (rango de 38-71 años). TMA compone de 21 carcinomas mucinosos pulmonares, de los cuales 1, 3, 4 y 13 casos fueron negativos (0), 1+, 2+, 3+ y positivas para la expresión de proteínas hZIP1, respectivamente, con una puntuación media de 2,4. epitelio pulmonar normal en las secciones adyacentes fuerte (3+) expresa hZIP1 (Fig. 1j yk). No hubo asociación entre el estadio clínico y anota hZIP1 IHC.
Tabla 1 resume los resultados de la expresión de proteínas hZIP1 en el tejido normal, los carcinomas mucinosos y no mucinosos de ovario, colon, estómago y lung.Table 1 de expresión en condiciones normales hZIP1 , carcinomas mucinosos y no mucinosos de ovario, colon, estómago y pulmón
Diagnóstico
hZIP1 IHC puntuación total

negativo
1 +
2+ 3+

Ovario normal

0
0 0

17 (100%)
17 carcinomas mucinosos

15 (43%) página 6 (17%) página 3 (9%) página 11 (31%)
35 carcinomas serosos

1 (0,7%) página 13 (9%)
32 (21%)
106 (70%)
152
colon normal

0 página 2 (17%) página 6 (50%) página 4 (33%) página 12 carcinomas mucinosos
Estrellas: 3 (6%)
25 (49%) página 7 ( 14%)
16 (31%)
51
adenocarcinomas
1 (1%) página 4 (3%): perfil 15 (12%)
109 (84% )
129
estómago
normal
0
0 0
página 5 (100%): perfil 5
carcinomas mucinosos
0 página 7 (22%) página 12 (37%) página 13 (41%)
32
adenocarcinomas
0
0 0
página 4 (100%)
4
pulmón normal

0 0

0
21 (100%)
21 carcinomas mucinosos

1 (5%)
3 (14%) página 4 (19%) página 13 (62%)
21
Discusión
Como regla general, los carcinomas mucinosos representan una pequeña fracción de los tumores en diferentes órganos con alrededor 3-10% entre los tumores de ovario, el 7% de todos los cánceres colorrectales, el 1,5% de los carcinomas gástricos, y muy rara vez en el pulmón [12, 20]. En comparación con adenocarcinomas convencionales, los tumores mucinosos tienden a estar asociados con la edad joven, el estadio del tumor avanzado, y patrones moleculares distintas, tales como la inestabilidad de microsatélites y las mutaciones del BRAF y KRAS
genes [21, 22]. La diferenciación de
carcinoma mucinoso de ovario primario de las metástasis de otros órganos en su mayoría apéndice y colon y recto puede ser un reto [13, 23]. Esta diferenciación es fundamental y de importancia clínica ya que los protocolos de tratamiento tienden a ser adaptada a cada sitio de órganos. Por ejemplo agentes de taxano a base de platino se utilizan en el tratamiento de los carcinomas de ovario primarios en contraste con fluorouracilo que es el agente quimioterapéutico principal utilizado para el carcinoma metastásico en el originario ovario del colon y recto [24, 25].
Para que un tumor considerarse carcinoma mucinoso en lugar de un adenocarcinoma convencional depende en el sitio de órganos y sistemas de clasificación. carcinomas mucinosos de ovario muestran cantidades visibles de mucina intracelular en más de 90% de las células tumorales [11]. En contraste, carcinoma mucinoso colorrectal se define si al menos 50% del volumen del tumor se compone de mucina extracelular [26]. carcinomas mucinosos son distintos de los carcinomas convencionales de anillo de sello y en diferentes órganos con alteraciones genéticas específicas y los resultados clínicos [25]. Las características comunes entre los carcinomas mucinosos de ovario y colorrectal incluyen una mayor prevalencia en la edad más temprana y mayor tamaño del tumor en la presentación. Por el contrario, una mayor proporción de carcinomas mucinosos de ovario en comparación con los carcinomas serosos son diagnosticados en una etapa baja, mientras que los carcinomas colorrectales mucinosos parecen igualmente probable que los carcinomas no mucinosos para presentar en una etapa baja [23, 27, 28].
hace más de 2 décadas, Lightman et al. [7] informó de bajas concentraciones séricas de zinc y el tejido tumoral en pacientes con tumores malignos de ovario "". Sin embargo, en esta publicación, no se menciona el tipo de tumores de ovario fueron incluidos en el estudio y fue proporcionado mucha información clínica [7]. Relativamente más recientemente, Bae et al. [8] informó de que el tratamiento de OVCAR-3 (línea celular de ovario maligno) y la nariz (línea celular de ovario normal) con el zinc-citrato de compuesto de plomo a la acumulación de zinc inducida más en la línea celular primero que lo segundo. Esto dio lugar a una disminución en el número de células y la actividad de la aconitasa en M-OVCAR-3 con un aumento de la apoptosis. Los autores llegaron a la conclusión de que la exposición a la alta concentración de zinc evita la proliferación de células OVCAR-3 [8]. La línea celular OVCAR-3 utilizado por Bae et al. es una línea de ovario epitelial humano de células de cáncer que se estableció a partir de la ascitis maligna de un paciente con poco diferenciado "adenocarcinoma papilar" en lugar de carcinoma mucinoso del ovario [8, 9]. Estudios más mecanicistas preferentemente con líneas celulares de carcinoma de ovario mucinoso, por ejemplo, RMUG-L, RMUG-S, MN-1, MAC-1 y MCAS [29] se recomiendan para explorar aún más el papel del zinc y sus transportadores en la patogénesis y al menos en teoría, la gestión de los carcinomas mucinosos influencia.
Nosotros y otros probado concluyentemente que los niveles de zinc y transportador hZIP1 se redujo significativamente en los adenocarcinomas de próstata. El fondo y las pruebas se presentan plenamente y ampliamente en varios estudios e informes [1-4]. Esto nos animó a ampliar el estudio de los carcinomas mucinosos desafiantes en diferentes órganos y para comparar la expresión hZIP1 en comparación con los carcinomas mucinosos no mucinosos en algunos de estos órganos.
Nuestro hallazgo novedoso en este informe es que hZIP1 mostró consistentemente baja expresión en carcinomas mucinosos de ovario, colon, estómago y pulmón con ninguna asociación entre el estadio clínico y anota hZIP1 en cualquiera de los tumores mucinosos. Curiosamente, hemos identificado una baja expresión de hZIP1 en los carcinomas mucinosos frente a los no mucinosos en tres órganos que llevamos a cabo la comparación de, a saber; ovario, colon y estómago.
Específicamente, hZIP1 se expresa fuertemente en todos los casos de tejido ovárico normal y fue de moderada a fuertemente positiva en 91% de los carcinomas serosos. En contraste, el 60% de los carcinomas mucinosos de ovario fueron negativos a positivos para la expresión débil hZIP1. El segundo hallazgo interesante es que había una menor expresión estadísticamente significativo de hZIP1 en bajo grado de ovario seroso en comparación con el carcinoma seroso de alto grado. Aunque no fue estadísticamente significativa, siendo la expresión hZIP1 fue inferior en grado bajo en comparación con los carcinomas mucinosos de alto grado. Estas observaciones pueden indicar que los tumores de ovario de grado superior pueden adquirir diferentes mecanismos para acumular más cantidad de zinc desconectando los mecanismos inhibitorios, que ABAJO expresar el transportador de zinc hZIP1
gen, o tal vez otros miembros de la familia del gen transportador de zinc.
el escenario era el mismo en los carcinomas de colon y gástricos con baja expresión de hZIP1 en el carcinoma mucinoso versus alta expresión en adenocarcinomas convencionales en estos dos órganos. En el colon y el estómago, 55% y 22% de los carcinomas mucinosos fueron negativos a débilmente positivo para hZIP1, respectivamente. En contraste, la expresión hZIP1 fue moderadamente a fuertemente positivo en el 96% y el 100% de los adenocarcinomas convencionales, respectivamente en el colon y el estómago. El número de adenocarcinomas gástricos convencionales incluidos en la TMA fue pequeño (n = 45). En contraste con carcinomas de ovario, la expresión hZIP1 se disminuyó como una función del aumento de grado en ambos tumores mucinosos y no mucinosos del colon y el estómago. Esta observación puede apuntar a diferentes mecanismos implicados en la progresión tumoral con respecto a la regulación de la concentración de zinc que necesitan más estudios mecanicistas. En el pulmón, también identificó una baja expresión de hZIP1 en los carcinomas mucinosos pulmonares. Por desgracia, y debido a la no-disponibilidad de adenocarcinoma de pulmón convencional TMA diapositivas, no se comparó la expresión de hZIP1 en los carcinomas pulmonares mucinosos y convencionales.
Conclusiones
expresión hZIP1 parece ser descendido de forma constante en los carcinomas mucinosos de una variedad de los órganos relativos a los tejidos no neoplásicos en estos órganos. Sin embargo, hZIP1 también se reduce como una función de aumentar el grado en ambos tumores mucinosos y no mucinosos en el colon y el estómago. Estos hallazgos sugieren que hZIP1 juega un papel fundamental en la carcinogénesis de algunos órganos que se acentúa especialmente en los tumores mucinosos. Se requieren estudios adicionales para definir con precisión la naturaleza de este papel. Sin embargo, en la práctica, hay poco valor en la baja expresión de hZIP1 para el diagnóstico diferencial de los carcinomas mucinosos.
Métodos
se realizaron microarrays de tejidos (TMA)
Todos los procedimientos de conformidad con las leyes y directrices institucionales con la aprobación de Junta de Revisión Institucional. TMA diapositivas comprados a los Estados Unidos Biomax (Rockville, MD) fueron utilizados en el presente estudio. Ovario diapositiva TMA compone de 35, 152, 11 y 6 carcinomas interpretable mucinoso, carcinomas serosos de ovario, cáncer de tejido normal adyacente y de los tejidos normales (no malignas), respectivamente, en un único núcleo de tejido por caso. No se sabe si los carcinomas mucinosos incluidos en el TMA de los tumores de ovario son de origen ovárico primario o tumores metastásicos. Colón TMA diapositivas compone de 51, 129 y 12 carcinomas mucinosos interpretables, adenocarcinomas convencionales y el tejido normal, respectivamente, en un solo núcleo de tejido por caso. Estómago TMA diapositivas compuesta de 32 carcinomas mucinosos interpretables, 4 adenocarcinomas convencionales y 3 casos de tejido gástrico normales no malignas normal y tumoral adyacente 2 en los núcleos de duplicados por caja. Pulmón TMA diapositivas compuesta de 21 carcinomas mucinosos interpretables en un solo núcleo de tejido por caso.
Inmunohistoquímica (IHC)
hZIP1 expresión de la proteína se determinó por IHC utilizando un anticuerpo anti-hZIP1 por protocolo estándar [1, 4]. Brevemente, los portaobjetos TMA se desparafinaron en xileno y se rehidrataron mediante incubación en concentraciones decrecientes de etanol. La recuperación del antígeno se llevó a cabo por calentamiento en 10 mM Tris-EDTA (base Tris 10 mM, EDTA 1 mM ,, 0,05% de Tween 20, pH 9,0) tampón a 98 ° C durante 20 min, la tinción IHC se llevó a cabo mediante la incubación de las diapositivas de 5% BlokHen (AvasLabs, Tigard, Oregón), seguido de incubación durante la noche a 4 ° C con hZIP1 anticuerpo en 5% BlokHen seguido de incubación con rábano picante de cabra anti pollo IgY anticuerpo secundario marcado con peroxidasa a una dilución de 1: 200 (AvesLabs, Tigard , Oregon). El color se desarrolló con DAB + sustrato cromógeno y hematoxilina fue utilizado como colorante de contraste.
Todas las secciones se examinaron con un microscopio Olympus (BX53). Las imágenes se procesaron con el software estándar cellSens XV Procesamiento de Imágenes (Olympus Corporation de América, Center Valley, PA). IHC puntuación se lleva a cabo por una junta anatomopatólogo certificado (MMD). La apariencia de la membrana y citoplásmica asociada hZIP1 inmuno-positividad de las células epiteliales glandulares se utilizó para la puntuación tal como se describe anteriormente [1, 4]. intensidad de la tinción del tumor se obtuvo semicuantitativamente como negativo (sin tinción), débil (1+) (< 10%), moderada (2+) (10-50%) y fuerte (3+) (> 50%) positivo dependiendo en el porcentaje de células positivas. el análisis estadístico
las puntuaciones medias de expresión hZIP1 en diferentes categorías fueron analizados por la t de Student
-Test. Los resultados de IHC se consideraron nominal para averiguar la significación. P
≤ 0,05 fue considerado significativo
abreviaciones
IHC:.
Inmunohistoquímica
TMA:
Tissue microarrays


hZIP1:
de zinc humana miembro transportador 1
Declaraciones
Agradecimientos
Este trabajo está financiado por el premio clínica y traslacional mejora de investigadores del Departamento de Patología , Microbiología e Inmunología de MM Desouki.
Conflicto de intereses
los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
contribuciones de los autores y MMD dE participaron en el diseño del estudio y la interpretación de datos. MMD, RBF y LC participaron en la creación de datos. MMD concebido del estudio, llevado a cabo el análisis de los marcadores inmunohistoquímicos y realizó el análisis estadístico. Todos los autores redactaron, leído y aprobado el manuscrito final.

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