miARN firma relacionado con el desenlace de los pacientes con cáncer gástrico siguientes chemotherapy

miARN firma asociada con el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico después de la quimioterapia
Resumen Antecedentes

La identificación de pacientes que es probable que o no se beneficiarán de la quimioterapia citotóxica a través del uso de biomarcadores podrían mejorar en gran medida la gestión clínica por una mejor definición de las opciones de tratamiento para los pacientes apropiados. microRNAs pueden ser biomarcadores potencialmente útiles que ayudan a guiar la terapia individualizada para el cáncer porque la expresión de microARN se desregula en el cáncer. Con el fin de identificar los genes miARN firmas para el cáncer gástrico y para predecir la resistencia clínica a cisplatino /fluorouracilo quimioterapia (CF), un análisis exhaustivo de los genes miARN microarrays se realizó con muestras de biopsia endoscópica.
Métodos
muestras de biopsia se recogieron antes de la quimioterapia de 90 pacientes con cáncer gástrico tratados con CF y de 34 voluntarios sanos. En el momento de progresión de la enfermedad, las muestras después del tratamiento se recogieron, además, a partir de 8 respondedores clínicos. miARN expresión se determinó utilizando un microarray de Agilent de diseño personalizado. Con el fin de identificar una firma miARN para la resistencia a la quimioterapia, se correlacionó con los niveles de expresión de los genes miARN el tiempo hasta la progresión (TTP) de la enfermedad después del tratamiento con CF.
Resultados
Una firma miARN distinguir el cáncer gástrico en el epitelio normal del estómago se identificó. 30 miRNAs fueron significativamente correlacionado inversamente con PTT mientras que 28 miRNAs fueron significativamente correlacionado positivamente con el TTP de 82 pacientes con cáncer (P Hotel < 0,05). Cabe destacar, entre los miRNAs upregulated asociados con quimiosensibilidad eran conocidos miRNAs para regular la apoptosis, incluyendo let-7 g, miR-342, miR-16, miR-181, miR-1 y miR-34. Cuando esto predictor 58-miARN se aplicó a un conjunto separado de muestras pre y post-tratamiento de tumores de los 8 respondedores clínicos, todas las 8 muestras de pre-tratamiento se predijo correctamente como de bajo riesgo, mientras que las muestras de la post-tratamiento tumores que se desarrolló la quimio-resistencia se prevé que sea en la categoría de alto riesgo por el 58 miARN firma, lo que sugiere que la selección para la expresión de estos miRNAs ocurrido como quimio-resistencia surgió.
Conclusiones
Hemos identificado 1) una firma miARN expresión que distingue el cáncer gástrico de epitelio estómago normal de voluntarios sanos, y 2) un chemoreresistance miRNA firma la expresión que se correlaciona con TTP después de la terapia CF. La firma quimio-resistencia miARN expresión incluye varios miRNAs previamente demostrado para regular la apoptosis in vitro
, y garantiza en mayor validación.
Antecedentes
miRNAs son cortos (~ 22 nucleótidos), los ARN no codificantes que regulan la expresión génica principalmente por la represión de traducción o degradación transcripcional [1]. miRNAs tienen un gran potencial como biomarcadores de cáncer debido a su expresión específica de tejido y su expresión aberrante de las células del cáncer [2]. Además, los miRNAs tienen funciones importantes en la regulación del ciclo celular y la apoptosis. La expresión de miRNAs puede ser dysregulated en el cáncer por una variedad de mecanismos incluyendo la regulación de la transcripción, amplificación, deleción, mutación, y silenciamiento epigenético [3]. Por lo tanto, los microARN puede ser biomarcadores potencialmente útiles que ayudan a guiar la terapia individualizada.
La identificación de pacientes que es probable que o no se beneficiarán de la quimioterapia citotóxica a través del uso de biomarcadores podría mejorar en gran medida la gestión clínica por una mejor definición de las opciones de tratamiento adecuadas para los pacientes. La mayoría de los estudios previos que intentan identificar los factores predictivos de la quimio-resistencia miARN en el cáncer han examinado sólo miRNAs individuales [4]. Hasta el momento, sólo un análisis de microarrays de alto rendimiento publicado ha evaluado miARN expresión firmas como predictores de la resistencia a la quimioterapia en pacientes con tumores sólidos metastásicos [5]. En este estudio de microarrays miARN de la etapa III-IV de cáncer de ovario, let-7i se encontró expresión que ser reducido de manera significativa en los pacientes 27 resistentes a la quimioterapia, en comparación con 42 pacientes con respuesta completa, aunque no había cohorte de validación independiente [5].
a continuación se presentan los resultados de un estudio prospectivo que utiliza un análisis de miARN microarrays de alto rendimiento en el que una firma la expresión de los genes miARN se ha identificado que distingue el cáncer gástrico en el epitelio normal del estómago. Además, hemos identificado una segunda firma que se correlaciona con el tiempo hasta la progresión (TTP) para los pacientes con cáncer gástrico tratados con cisplatino y fluorouracilo (CF), un régimen de quimioterapia de referencia para el cáncer gástrico. Estas firmas miARN pueden ser útiles como biomarcadores potenciales para ayudar en el diagnóstico de cáncer gástrico en los casos difíciles y para predecir la respuesta de los pacientes con cáncer gástrico a CF terapia.
Resultados
La identificación de un cáncer gástrico miARN firma
Noventa muestras de tejido de cáncer gástrico pretratamiento estuvieron disponibles para este análisis y sus características clínico-patológicas se describen en la Tabla 1. Todos los pacientes tenían enfermedad metastásica en el momento de la inscripción y después se recogieron muestras de tejido de biopsia endoscópica, los pacientes fueron tratados con cisplatino y fluorouracilo (o capecitabina ) la quimioterapia de combinación. Todos los datos de microarrays se ha depositado en el GEO y está disponible desde su publicación. Acceso Crítico: http://​www.​ncbi.​nlm.​nih.​gov/​geo/​query/​acc.​cgi?​token=​ftixhsoiemwgyfi&​acc=​GSE30070Table 1 características clínico-patológicas de los pacientes

paciente con cáncer gástrico
La voluntario sano

Formación
establece
prueba de principio
pruebas conjunto gratis (respondedor)

Número
82 página 8
34
Edad - año
cubre la mediana de
56
56
48
intercuartil gratis (44-63) gratis (44-58) gratis ( 43-57) Sexo seguro - no. (%)
Hombre
64 (78,0%) página 7 (87,5%)
23 (67,6%)
Mujer
18 (22,0%)
1 (12,5% ): perfil 11 (32,4%)
estado funcional (EF) - no. (%)
ECOG1 PS 0 ó 1 | 73 (89,0%) página 8 (100%): perfil del ECOG PS 2 ó 3 página 9 (11,0%): perfil 0
El tipo histológico - no. (%)
Intestinal
de Lauren 34 (41,5%): perfil 3 (37,5%)
difuso de Lauren
48 (58,5%) página 5 (62,5%) Localización de
lesión primaria - no. (%)
Superior 1/3 página 11 (13,4%): perfil 1 (12,5%)
Medio 1/3
18 (22,0%) página 5 (62,5%)
Baja 1/3
43 (52,4%)
1 (12,5%)
Todo el estómago
10 (12,2%)
1 (12,5%)
régimen de quimioterapia - sin . (%)
Cisplatino /fluorouracilo
80 (97,6%) página 8 (100%)
cisplatino /capecitabina página 2 (2.4%)
0
* intensidad de dosis relativa - La mediana%

81,2 76,6

rango intercuartil gratis (75,3-87,3) gratis (64,7-84,9)
Número de ciclos de quimioterapia
La mediana página 4 cubre la
10
intercuartil gratis (2-5) gratis (7-11)
respuesta a la quimioterapia (criterios de la OMS) -no (%)
PR2
16 (24,6% ): perfil 6 (100%)
SD3
25 (38,5%)
PD4
24 (36,9%)
Inmensurable
16
2 no evaluables
1 | quimioterapia de segunda línea
55 (67,1%) página 6 (75,0%)
La mediana de seguimiento de 35,5 meses sobrevivientes

- La supervivencia global - . mo
La mediana de 8,2

16
rango intercuartil gratis (06/08 a 10/05) gratis (11,3-26,7)
tiempo hasta la progresión - mo. La mediana de 3,1


8.2
rango intercuartil gratis (2.5 a 3.9) gratis (4,3-21,2)
1Eastern Cooperative Oncology Group, la respuesta 2partial, enfermedad 3stable, enfermedad 4progressive
* intensidad de dosis relativa
* La media de las intensidades relativas de dosis de cisplatino y fluorouracilo. intensidad de la dosis se define como la cantidad de fármaco administrado por unidad de tiempo, expresada como miligramos por metro cuadrado por semana. intensidad de la dosis relativa se define como la intensidad de la dosis real con relación a la intensidad de la dosis prevista de cada fármaco.
primero Se compararon los perfiles de miARN de las 90 muestras de pretratamiento obtenidos a partir de pacientes con cáncer gástrico con los datos de expresión de genes miARN desde 34 muestras de biopsia de la mucosa gástrica normal obtenido a partir de voluntarios sanos (Figura 1). Para estimar la capacidad de predicción de los perfiles de miARN específicos del cáncer, predicción de la clase de los análisis se lleva a cabo también mediante la división al azar toda la muestra en subgrupos de dos (formación y la prueba) a una relación de 1-a-1. La aleatorización se realizó utilizando el software nQuery Asesor (versión 7.0, Soluciones de Estadística, Saugus, MA). Entonces etiqueta de clase de cada muestra en la prueba estaba prevista para cada una de las 100 de formación al azar para probar las particiones de acuerdo con Predictor compuesto de covarianza (PCC), el análisis discriminante lineal diagonal (LDA), 1- y 3-vecinos más cercanos (NN), más cercana baricentro de la máquina (Carolina del Norte), y vectores de soporte (SVM). En una selección de características P
< 0,05, la exactitud mediana predicción en equipos de prueba era > 90% en todos los clasificadores (91,9%, 90,3%, 90,3%, 93,5%, 93,5% y 91,9%, para CCP, LDA, 1-NN, NN-3, Carolina del Norte, y SVM, respectivamente), en 100 particiones aleatorias de capacitación para el examen. Figura 1 esquema de estudio para identificar y probar los miRNAs de predicción de la resistencia a la FQ sobre Table 2 se enumeran los miRNAs que son expresados ​​diferencialmente entre los 90 tumores de cáncer gástrico y las 34 muestras normales en una selección de características de P Hotel < 0,005. Muchos miRNAs que se sobreexpresan en el grupo de cáncer gástrico pertenecen a los miR-106b-17-92 y 25 agrupaciones, como se informó anteriormente [6, 7]. reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (Q-RT-PCR) Los análisis confirmó la expresión diferencial de algunos de estos miRNAs en muestras de cáncer gástrico (Figura 2). A pesar de que el miR-25 fue significativamente hasta reguladas por el análisis conjunto de los tumores, esto no alcanzó significación estadística por Q-PCR, tal vez debido al número limitado de muestras que estaban disponibles para el ensayo. Aunque un estudio anterior informó que el miR-486 está regulado por disminución en el cáncer gástrico, encontramos la expresión de miR-486 a ser elevados en nuestra serie de pacientes con cáncer gástrico tanto por microarrays y Q-PCR (archivo adicional 1: Figura S1) .Tabla 2 miRNAs expresados ​​diferencialmente en el cáncer gástrico y el epitelio normal del estómago.
sobreexpresa en el cáncer gástrico
p
FDR
relación de
hsa-miR-25 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
1,64
hsa-miR-106b Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
1,85
hsa-miR-93 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
1.49
hsa-miR-503 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
2.17
hsa-miR-18a Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
2.27
hsa-miR-224
1.00E-07
2.59E-06
3.85
hsa-miR-451
1.00E-07
2.59E-06
3.23
hsa-miR-18b
2.00E-07
4.60E-06
2.17
hsa-miR-17-5p
2.00E-06
3.60E-05
1.61
hsa-miR-486-5p
3.00E-06
5.18E-05
2.22
hsa-miR-144
9.60E-06
0.000159
5.56
hsa-miR-552
1.03E-05
0.000164
2.38
hsa-miR-425-5p
1.32E-05
0.000195
1.35
hsa-miR-92
1.88E-05
0.000268
1.39
hsa-miR-106a
2.61E-05
0.000347
1.52
hsa-miR-223
2.68E-05
0.000347
2.13
hsa-miR-205
2.98E-05
0.000363
4.76
hsa-miR-196b
4.42E-05
0.000508
1.67
hsa-miR-19a
0.0001836
0.00181
1.69
hsa-miR-191
0.0003112
0.0028
1.27
hsa-let-7i
0.0004468
0.00385
1.20
hsa-miR-185
0.0004764
0.00394
1.32
hsa-miR-769-5p
0.0006683
0.00532
1.37
hsa-miR-196a
0.0008274
0.00646
1.45
hsa-miR-301
0.0009715
0.00745
1.82
hsa-miR-21
0.0012598
0.00948
1.49
hsa-miR-130b
0.0015411
0.0112
1.30
hsa-miR-19b
0.0015959
0.0114
1.39
hsa-miR-424
0.0019249
0.0135
1.52
hsa-miR-484
0.0020451
0.0139
1.33
hsa-miR-767-5p
0.0048511
0.03
1.64
hsa-miR-183
0.0050428
0.0305
1.52
hsa-miR-210
0.0053848
0.0318
1.35
hsa-miR-302c*
0.006328
0.0364
1.41
hsa-miR-520g
0.0070896
0.0402
2.13
hsa-miR-324-5p
0.0095742
0.0497
1.23
hsa-miR-103
0.0095861
0.0497
1.16
hsa-miR-376b
0.0096083
0.0497
1.85
hsa-miR-151
0.0100422
0.0513
1.20
hsa-miR-596
0.011231
0.0556
1.61
hsa-miR-545
0.011422
0.0556
1.69
hsa-miR-221
0.0129139
0.0608
1.27
hsa-miR-20a
0.0133176
0.0619
1.35
hsa-miR-181b
0.0148487
0.0655
1.28
hsa-miR-181d
0.0154891
0.0668
1.16
hsa-miR-623
0.0189476
0.0809
1.43
hsa-miR-519d
0.0220958
0.0915
1.59
hsa-miR-563
0.0229302
0.094
1.37
hsa-miR-505
0.0241657
0.097
1.25
hsa-miR-107
0.0242694
0.097
1.11
hsa-miR-320
0.0282982
0.111
1.20
hsa-miR-96
0.0285699
0.111
1.39
hsa-miR-339
0.0312524
0.12
1.32
hsa-miR-181a
0.0318141
0.121
1.20
hsa-miR-345
0.0322275
0.121
1.19
hsa-miR-20b
0.0325811
0.122
1.28
hsa-miR-33b
0.0339343
0.125
1.64
hsa-miR-135b
0.0352682
0.129
1.59
hsa-miR-431
0.0374687
0.134
1.41
hsa-miR-193a
0.0377098
0.134
1.35
hsa-miR-550
0.0380645
0.134
1.30
hsa-miR-565
0.0446875
0.15
1.20
Underexpressed en el cáncer gástrico
p
FDR
Relación
hsa-miR-146a Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,39
HSA-miR-133a Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,34
hsa-miR-625 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,56
hsa-miR-375 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,27
hsa-miR-133b Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,32
hsa-miR-195 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,47
hsa-miR-148a Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,47
hsa-miR-1 | < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,27
hsa-miR-26a Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0.67
hsa-miR-204
2.00E-07
4.60E-06
0.26
hsa-let-7c
7.00E-07
1.53E-05
0.74
hsa-let-7a
9.00E-07
1.86E-05
0.72
hsa-let-7g
1.10E-06
2.17E-05
0.71
hsa-miR-497
1.70E-06
3.20E-05
0.56
hsa-miR-26b
1.28E-05
0.000195
0.58
hsa-miR-145
2.04E-05
0.000282
0.65
hsa-miR-34a
2.89E-05
0.000363
0.75
hsa-miR-143
4.28E-05
0.000506
0.63
hsa-miR-650
9.15E-05
0.00101
0.57
hsa-miR-150
9.25E-05
0.00101
0.49
hsa-miR-768-5p
0.0001037
0.0011
0.65
hsa-let-7d
0.0001302
0.00132
0.76
hsa-miR-203
0.0001311
0.00132
0.52
hsa-miR-29c
0.0002112
0.00203
0.52
hsa-let-7f
0.0002446
0.0023
0.69
hsa-miR-30d
0.0002592
0.00238
0.78
hsa-miR-642
0.0004345
0.00383
0.62
hsa-miR-30c
0.0004556
0.00385
0.75
hsa-miR-155
0.0004998
0.00406
0.66
hsa-miR-34b
0.0013651
0.0101
0.64
hsa-miR-551b
0.0019808
0.0137
0.53
hsa-miR-28
0.0027537
0.0184
0.85
hsa-let-7e
0.0034793
0.0227
0.84
hsa-let-7b
0.0035019
0.0227
0.85
hsa-miR-212
0.0039061
0.0249
0.76
hsa-miR-564
0.0047906
0.03
0.72
hsa-miR-770-5p
0.0050814
0.0305
0.71
hsa-miR-30b
0.0060842
0.0355
0.76
hsa-miR-30a-5p
0.0077597
0.0434
0.80
hsa-miR-199b
0.0083572
0.0461
0.67
hsa-miR-125a
0.0085563
0.0466
0.77
hsa-miR-621
0.0093423
0.0497
0.69
hsa-miR-31
0.0106862
0.054
0.66
hsa-miR-365
0.0113404
0.0556
0.78
hsa-miR-381
0.0123061
0.0592
0.70
hsa-miR-626
0.0128738
0.0608
0.78
hsa-miR-127
0.0138033
0.0635
0.69
hsa-miR-660
0.0142991
0.0651
0.75
hsa-miR-342
0.0146193
0.0655
0.75
hsa-miR-146b
0.0148729
0.0655
0.77
hsa-miR-361
0.0152056
0.0663
0.86
hsa-miR-489
0.0191692
0.081
0.71
hsa-miR-29a
0.0204334
0.0854
0.79
hsa-miR-95
0.0243644
0.097
0.54
hsa-miR-567
0.0265025
0.104
0.54
hsa-miR-152
0.0376121
0.134
0.78
hsa-miR-429
0.0378151
0.134
0.65
hsa-miR-200b
0.0396617
0.138
0.75
hsa-miR-504
0.0412648
0.142
0.63
hsa-miR-668
0.041717
0.143
0.77
hsa-miR-186
0.0437991
0.149
0.83
hsa-miR-135a
0.0468793
0.157
0.58
hsa-miR-485-5p
0.047683
0.158
0.82
Figura 2 Validación de la expresión de miR por cuantitativa en tiempo real inversa reacción en cadena de la polimerasa con transcripción (Q-RT-PCR). análisis Q-RT-PCR de miR-18a, miR-25, miR-1, y let-7 g de 4 normal (se muestra en blanco |) y 4 muestras de cáncer (mostrado en negro
), lo que confirma exceso la expresión de miR-18a y miR-25 y sub-expresión de miR-1 y let-7 g como se observa en los datos de microarrays de las muestras de cáncer. La prueba t Student valor de p
entre 4 normales y 4 muestras de cáncer se muestra para cada miARN. Doble cambio (FC) de -1 indica una disminución del 50% en la expresión RNU6-normalizada de un miARN.
Identificación dada de una firma miARN para la resistencia a la terapia CF
tiempo hasta la progresión (TTP), no la respuesta radiográfica, se utilizó como indicador clínico para la respuesta a la quimioterapia, sobre todo porque hemos querido incluir a los pacientes que no tenían la enfermedad cuantificable mediante técnicas de imagen estándar. Para definir una de 82 muestras como el conjunto de entrenamiento para desarrollar un predictor (Figura 1). Estas 82 muestras de pretratamiento se recogieron de pacientes que no se sometieron segundas biopsias. Cincuenta y ocho miRNAs se correlacionaron significativamente con el TTP de estos 82 pacientes (función de selección P
value < 0,05) (Tabla 3). La sobreexpresión de 30 miRNAs se asoció con retraso TTP mientras que la sobreexpresión de 28 miRNAs se asoció con un TTP más rápida. Seis miRNAs * que se asociaron con la quimio-resistencia, incluyendo el miR-518f *, miR-520a, miR-520d *, miR-519e *, miR-363 *, y miR-517 *, mientras que no hay miRNAs * se asociaron con chemosensitivity.Table 3 miRNAs cuya expresión se asocia con la quimiosensibilidad o quimio-resistencia.
miRNAa cuya expresión está asociada con la quimio-resistencia
p
FDR

Hazard Ratio

hsa-miR-526a
0.0000
0.0103
1.482
hsa-miR-122a
0.0002
0.0379
1.545
hsa-miR-518f*
0.0004
0.0537
1.298
hsa-miR-591
0.0007
0.0598
1.492
hsa-miR-524-3p
0.0010
0.0682
1.268
hsa-miR-320
0.0013
0.0701
1.865
hsa-miR-520a*
0.0014
0.0701
1.252
hsa-miR-183
0.0031
0.119
1.39
hsa-miR-516-5p
0.0034
0.119
1.306
hsa-miR-629
0.0036
0.119
1.42
hsa-miR-595
0.0043
0.119
1.858
hsa-miR-640
0.0054
0.132
1.3
hsa-miR-520d*
0.0063
0.143
1.326
hsa-miR-519e*
0.0091
0.164
1.24
hsa-miR-363*
0.0096
0.166
1.407
hsa-miR-513
0.0137
0.193
1.347
hsa-miR-328
0.0163
0.211
1.736
hsa-miR-519a
0.0170
0.211
1.118
hsa-miR-185
0.0189
0.217
1.697
hsa-miR-658
0.0200
0.223
1.532
hsa-miR-517*
0.0218
0.226
1.305
hsa-miR-515-5p
0.0349
0.301
1.145
hsa-miR-519c-5p
0.0368
0.304
1.157
hsa-miR-661
0.0392
0.315
1.437
hsa-miR-182
0.0416
0.315
1.408
hsa-miR-206
0.0417
0.315
1.606
hsa-miR-193b
0.0419
0.315
1.433
hsa-miR-601
0.0436
0.317
1.599
miRNAs cuya expresión está asociada con la quimiosensibilidad
p
FDR
cociente de riesgos instantáneos
hsa-miR-195
0.0007
0.0598
0.593
hsa-miR-146b
0.0016
0.0733
0.565
hsa-miR-26b
0.0037
0.119
0.686
hsa-miR-374
0.0042
0.119
0.84
hsa-miR-199b
0.0051
0.132
0.729
hsa-miR-132
0.0068
0.143
0.62
hsa-miR-140
0.0069
0.143
0.759
hsa-miR-487b
0.0088
0.164
0.679
hsa-let-7g
0.0091
0.164
0.539
hsa-miR-340
0.0103
0.171
0.82
hsa-miR-155
0.0109
0.174
0.704
hsa-miR-95
0.0115
0.176
0.856
hsa-miR-186
0.0137
0.193
0.662
hsa-miR-130a
0.0140
0.193
0.72
hsa-miR-342
0.0151
0.202
0.685
hsa-miR-577
0.0173
0.211
0.804
hsa-miR-128b
0.0184
0.217
0.701
hsa-miR-146a
0.0209
0.226
0.776
hsa-miR-16
0.0214
0.226
0.698
hsa-miR-503
0.0241
0.243
0.721
hsa-miR-224
0.0259
0.25
0.853
hsa-miR-223
0.0259
0.25
0.794
hsa-miR-128a
0.0294
0.276
0.704
hsa-miR-181b
0.0300
0.276
0.668
hsa-let-7f
0.0312
0.281
0.725
hsa-miR-1
0.0339
0.298
0.839
hsa-miR-421
0.0367
0.304
0.738
hsa-miR-127
0.0404
0.315
0.783
hsa-miR-34c
0.0435
0.317
0.74
hsa-miR-497
0.0493
0.351
0.769
La figura 3 muestra una curva de Kaplan-Meier para los grupos de riesgo estratificado por estos 58 miRNAs. Un nivel de significación de permutación para la estadística de log-rank de la licencia-un-out-validados cruz curvas de Kaplan-Meier fue 0,021, lo que sugiere que la asociación entre los datos de expresión de genes miARN de TTP es estadísticamente significativa. Figura 3 curvas de Kaplan-Meier para el tiempo hasta la progresión (TTP) de 2 grupos de riesgo estratificados según la expresión de 58 miRNAs se correlacionaron con TTP en una selección de funciones P < 0.05. La asociación de los datos de expresión de genes miARN a TTP fue estadísticamente significativa (P permutación
valor para las estadísticas de log-rank de curvas con validación cruzada de Kaplan-Meier = 0,021).
Expresión de la firma quimio-resistencia se correlaciona con la evolución de la quimio-resistencia en Los tumores que antes eran sensible a la quimioterapia Francia El 58 de firma miARN identificado arriba es predictivo para identificar a los pacientes que son o no son propensos a responder favorablemente a la terapia con FQ. Hemos postulado que los pacientes que inicialmente demostraron un favorable firma la expresión de los genes miARN 58 cambiarían a una firma la expresión desfavorable en el momento en que desarrollaron resistencia a la terapia CF. Con el fin de probar esta posibilidad como una prueba de principio, 8 pares de muestras aparatos de prueba (obtenido por vía endoscópica de tratamiento previo y posterior) se recogieron a partir de 8 pacientes que inicialmente demostraron una respuesta clínica al tratamiento de la FQ, pero que finalmente se mostraron enfermedad progresiva momento en el cual se tomó una segunda biopsia endoscópica. Como se muestra en la Tabla 4 todas las 8 muestras de pretratamiento de los respondedores clínicos se predijo correctamente por el predictor 58-miARN para estar en el grupo de bajo riesgo (precisión, 100%). Notablemente, 6 de 8 pares fueron identificados correctamente para quimiosensibilidad (es decir
., Las muestras después del tratamiento se les asignó un índice de predicción más alta para respuesta a la quimioterapia que las muestras de pretratamiento, y por lo tanto, prevé que sea más resistente a la terapia) (precisión, 75% ). Cuando la misma predicción se ha realizado mediante la selección de funciones P
valor de 0,01, el resultado sigue siendo el mismo de predicción (Tabla 4) .Tabla 4 Predicción para la quimio-resistencia en la prueba de prueba de principio
ID de la muestra
La selección de características de P < 0,05


La selección de características de P < 0,01


Predictive
Index
Percentile1

Prediction
For
Pretreatment
Sample2

Overall
Prediction3


Predictive
Index
Percentile

Prediction
for
Pretreatment
Sample

Overall
Prediction

1 pre
39%
baja
incorrecta
35%
baja
incorrecta
1 mensaje
22% 24%
página 2 pre
48%
baja
corregir
49%
baja
correcta página 2 de post
79% 77%
página 3 pre
55%
bajo
corregir
46%
baja
correcta página 3 de post
73% 77%
página 4 pre
13%
baja
correcta
24%
baja
correcta página 4 de post
72% 73%
página 5 pre
31%
baja
correcta
33%
baja
correcta página 5 de post
48% 46%
página 6 pre
13%
baja
corregir
27%
bajo
correcta página 6 de post
16% 66%
página 7 pre página 7%
baja
corregir
12%
baja
correcta
7 después
66% 57%
página 8 pre
52%
baja
incorrecta
50%
baja
incorrecta
8 después
17%
24%
1El índice predictivo se calcula para cada muestra mediante este método supervisado componente principal, donde un alto valor predictivo del índice corresponde a una progresión rápida después de la quimioterapia (es decir,
., corto TTP). Si el índice predictivo de una muestra en la prueba correspondía al índice predictivo de la mediana del conjunto de entrenamiento, la muestra se le asigna un índice predictivo del 50%.
Riesgo 2La se predijo baja, si el percentil del índice de predicción de la muestra fue de pretratamiento menos del 67%
predicción 3El se considera correcta si las muestras post-tratamiento se les asignó un índice predictivo más alto que las muestras de pre-tratamiento.
Discusión
este estudio se ha utilizado un enfoque prospectivo para identificar una firma miARN para gástrica cáncer vs. epitelio normal del estómago y una firma miARN que predice la respuesta a la terapia CF estándar.
Dado que las técnicas de histopatología de rutina a veces no conducen a un diagnóstico definitivo de cáncer gástrico, la adición de una firma miARN de tales muestras de pacientes puede mejorar la exactitud de un diagnóstico de cáncer gástrico. En estudios anteriores miARN microarrays de cáncer gástrico, tejidos de control se obtuvieron de las regiones del estómago de los pacientes de cáncer gástrico que se determinó que eran histológicamente normales y no de tejido del estómago de voluntarios normales sanos [6, 7]. Dado que las anormalidades moleculares se encuentran a menudo en histológicamente de aspecto normal del tejido adyacente al tejido tumoral, que elegimos para obtener tejidos de control a partir de muestras de biopsia endoscópica de voluntarios normales, libres de cáncer. La mayoría de los miRNAs expresados ​​diferencialmente notificado a ser característico de cáncer gástrico en anteriores estudios de microarrays [6, 7] También se han detectado dentro de la firma de cáncer gástrico en los análisis actuales. Sin embargo, además de estos miRNAs previamente reportado en el cáncer gástrico, que, además, se identificaron posibles miRNAs supresores de tumores (en P Hotel < 0,05 [6] y P Hotel < 0,01 [7], incluyendo el miR-1 [8 , 9] y let-7 [10] que hemos encontrado para ser underexpressed en el cáncer gástrico (en P Hotel < 0,001). (Tabla 2) Curiosamente, Oh et al conocer la expresión de miR-486 a reducirse en muchos . cánceres gástricos, en algunos casos, asociado con una pérdida genómica de la región [11] encontramos miR-486 que se sobreexpresa en nuestra cohorte cáncer gástrico por tanto microarray y análisis Taqman PCR (archivo adicional 1: Figura S1). es posible que esta diferencia en los resultados se debe a diferentes poblaciones de pacientes estudiados.
en este estudio, se presenta por primera vez a nuestro entender, un predictor de miRNA de respuesta a la terapia de la FQ. el 58 miARN firma que proporciona un índice para evaluar la respuesta potencial a la terapia CF puede ser útil en la estratificación de los pacientes en un grupo que debe recibir el tratamiento estándar y un grupo que probablemente no se beneficiarán de este tipo de tratamiento y debe ser colocado en un ensayo terapéutico diferente. Varios de los 58 miRNAs que hemos identificado en la Tabla 2 que están asociados con TTP son consistentes con los informes publicados en relación con su expresión quimiorresistencia y la biología del tumor. Cabe destacar, entre los miRNAs upregulated asociados con un TTP prolongado (definido por una relación de riesgos < 1) se miRNAs que se han demostrado para inducir la apoptosis en células de cáncer gástrico y otros, tales como miR-16, let-7 g, miR-181, miR-342, miR-1 y miR-34 [8, 12-18]. miR-16 aumenta la inducción de apoptosis por nutlin y genisteína [12], y modula la resistencia a múltiples fármacos de las células de cáncer gástrico humano [13].
La sobreexpresión de let-7c o let-7 g se ha demostrado que disminuye la expresión de Bcl-XL en líneas de células Huh7 y HepG2 [14]. Let-7 g y miR-181b se correlacionan positivamente con la respuesta clínica del cáncer de colon para S-1, un fluorouracilo por vía oral [4]. miR-181 y miR-181b se han demostrado que funcionan como supresores de tumores que provocan la inhibición del crecimiento, inducir la apoptosis e inhibir la invasión en las células de glioma [15]. La reconstitución de hsa-miR-342 en la línea celular de cáncer colorrectal HT-29 induce la apoptosis [16]. miR-1 sensibiliza a las células de cáncer de pulmón a la apoptosis inducida por la doxorrubicina [8]. Ectópico expresión de miR-34 induce la apoptosis, la detención del ciclo celular o senescencia en células normales y tumorales [17]. De este modo, la sobreexpresión de estos miRNAs pro-apoptóticas en los tumores primarios parece ser una característica muy consistente de los pacientes que se beneficia de la FQ
Curiosamente, se identificaron seis miRNAs * que se asociaron con la quimio-resistencia, incluyendo el miR-518f *, miR 520a, miR-520d *, miR-519e *, miR-363 *, y miR-517 *, mientras que no hay miRNAs se asociaron con la quimiosensibilidad. Sólo un MIR, MIR-302 *, fue identificado en el cáncer gástrico MIR firma. MIR * s se considera que son hebras de pasajeros que se cree que ser degradados normalmente desde el pre-MIR que se traduce en la hebra nt maduro 22 que entra en el complejo RISC. Las funciones de * miRNAs siguen sin estar claros, aunque es posible que el resultado de procesamiento de alteración de pre-miRNAs (Tchernitsa et al J de Patología, 2010) o puede jugar un papel en la orientación de la traducción del ARNm (Gu y Lu, PLoS ONE, 2010 ).
también observamos que si bien 21 miRNAs se encontraron en común entre los GC y quimio-resistencia firmas de miARN, 37 miRNAs eran exclusivas de la firma quimiosensibilidad.
el análisis de la muestra de pares de pre y post-tratamiento de los 8 pacientes que inicialmente respondieron al tratamiento de la FQ, pero más tarde se hizo resistente a la terapia servido como prueba de principio para demostrar que el índice predictivo del 58 miARN firma sería pasar de un índice favorable (en la etapa de pre-tratamiento) a un índice desfavorable ( post-tratamiento cuando la resistencia desarrollada). Desgraciadamente, no fue posible obtener pares coincidentes adicionales de muestras de pacientes similares para proporcionar un análisis estadístico más robusto. Sin embargo, los resultados son consistentes con un modelo de la selección clonal de células de tumores resistentes a pre-existentes que residen dentro del tumor primario.
De acuerdo con el modelo de selección clonal convencional para el desarrollo de resistencia adquirida a la resistencia a la quimioterapia, la resistencia de los tumores que responden inicialmente se desarrolla debido a la consecuencia selectiva de clones quimiorresistentes que ya existen dentro del tumor [18]. Teniendo en cuenta que una rápida TTP indica específicamente una resistencia intrínseca a la quimioterapia [19], los 58 miRNAs cuyos niveles de expresión se correlacionan con un corto TTP puede representar miRNAs relacionados quimiorresistencia-ya presentes en la mayoría de las células tumorales en el tumor primario. Sin embargo, los tumores primarios que aparecen no expresar esta firma miARN de la resistencia, inicialmente responden a la terapia hasta preexistente, las células resistentes selectivamente crecen a pesar de la terapia CF. En el momento se obtiene una muestra cuando se observa la resistencia, la mayor parte del tumor expresa la desfavorable, quimiorresistente firma miRNA. Dado que la resistencia en la mayoría de estos pacientes se desarrolla durante un período relativamente corto de tiempo (meses, no años), parece poco probable que los resultados de resistencia a partir de la acumulación de múltiples cambios genéticos individuales.
Los resultados de este estudio aportan nuevos datos importantes y las firmas de miARN, especialmente para predecir la respuesta a la terapia de CF y con respecto a la aparición de resistencia tumor. Sin embargo, estudios más amplios deben llevarse a cabo en el futuro para validar estos hallazgos y determinar si se pueden aplicar en un entorno clínico.
Conclusiones
Aunque limitada por el tamaño pequeño de la muestra del conjunto de validación, este estudio identifica miRNAs que pueden comprender una firma clínicamente relevante para la resistencia intrínseca de cáncer gástrico para CF y sugiere que se seleccionaron estos miRNAs para durante el desarrollo de quimiorresistencia adquirida. Dado que este factor de predicción miRNA, posiblemente, puede proporcionar una guía útil a la quimioterapia personalizada en el futuro, es objeto de nuevas investigaciones y validación en grandes estudios prospectivos.
Métodos
El reclutamiento de pacientes y el tratamiento
se recogieron muestras de tejido en el hospital de Centro de cáncer Nacional de Corea por endoscopia 2001-2006 bajo un protocolo aprobado por el Comité de Revisión Institucional (IRB) del hospital Nacional del Centro del cáncer en Goyang, Corea. Todos los pacientes y voluntarios firmaron el consentimiento informado aprobado por el IRB. La elegibilidad para la inscripción en el estudio incluyó los siguientes parámetros: 1) edad ≥ 18 años; 2) histológicamente confirmado adenocarcinoma gástrico; 3) documentado metástasis a distancia; 4) no hay enfermedades malignas previas o concomitantes distintos de cáncer gástrico; 5) sin quimioterapia previa, ya sea adyuvante o paliativo; y 6) la función adecuada de todos los órganos importantes. 34 voluntarios sanos fueron sometidos a gastroscopia para el cribado de rutina para el cáncer gástrico y tenía mucosa gástrica normal por la histología. No hubo gastritis entre los 34 voluntarios sanos.
Este estudio miARN se ha realizado como un estudio paralelo a un estudio de análisis de la expresión de ARNm [20] diseñado para identificar predictores de mRNA de la quimio-resistencia. Noventa muestras de biopsias previas al tratamiento recogidos 2001-2006 fueron analizados en este estudio miARN. Después de una biopsia endoscópica inicial, todos los 90 pacientes fueron tratados con cisplatino (60 mg /m 2, D1) en combinación con fluorouracilo (1 g /m 2 para 5 días; n = 88) o capecitabina (Xeloda, de Roche; 1.250 mg /m 2 veces al día durante 2 semanas; n = 2) cada 3 semanas. Se pidió a los respondedores clínicos a someterse a la segunda endoscopia en el tiempo de enfermedad progresiva (PD) se observó de acuerdo a criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Los siguientes dos criterios se utilizaron para definir los respondedores clínicos: 1) los pacientes cuyos tumores demostrado más que una disminución del 50% en la suma de los productos de los dos diámetros perpendiculares más grandes de las lesiones medibles para al menos 4 semanas; o 2) los pacientes que no tenían enfermedad medible en la presentación y tuvieron una disminución dramática en el derrame pleural /ascitis durante al menos 4 semanas [21]. Post-tratamiento de datos de microarrays miARN podrían ser obtenidos de las muestras recogidas cuando la quimio-resistencia desarrollada (PD) en 8 respondedores clínicos. muestras post-tratamiento se recogieron al menos 2 semanas después de la última dosis del fluorouracilo, y antes de iniciar la quimioterapia de segunda línea, con el fin de evitar cualquier efecto de drogas agudos sobre la que influye en el perfil de expresión. Para estos 8 respondedores clínicos, muestras pre y post-tratamiento (que se recogieron en el momento de la progresión de la enfermedad) representan los tumores sensibles a la quimioterapia y chemoresistant, respectivamente. Se utilizaron muestras de pretratamiento de los 82 pacientes restantes para identificar un predictor miARN de respuesta a la quimioterapia. Este predictor se aplicó a 8 pares de muestras recogidas de los mismos pacientes pre y post-tratamiento. La predicción se considera correcta si las muestras post-tratamiento se les asignó un índice de predicción más alta para la quimiorresistencia que las muestras de pre-tratamiento. Las muestras de biopsia se recogieron de manera similar a partir de 34 voluntarios sanos. Las muestras de tejido que contienen células tumorales
al menos 50% se procesaron para el ARN como se describe anteriormente [22]. Los ARN extraídos se analizaron utilizando el Agilent Bioanalyzer 6000 de ARN total de ensayo y el espectrofotómetro Nanodrop siguiendo los protocolos del fabricante. 500 ng de RNA total fue sometido a una costumbre miARN microarray. Se utilizó una mezcla de ARN total aislado a partir de tres líneas celulares de cáncer gástrico (SNU-601, SNU-638, y AGS) como el ARN de referencia para la hibridación competitiva. experimento
Microarray
miARN microarrays de diseño
El Laboratorio Molecular de Tecnología (LMT) _miRNA_v2 microarrays fue diseñado usando la base de datos Sanger miR9.0 (http:... //microARN Sanger ac uk) y fabricado como una costumbre-sintetizado 8 × 15 K microarrays (Agilent Technologies, San Jose, CA). Hay un total de 4.361 entradas en la base de datos de genes miARN miR9.0. Algunos de los miRNAs tienen secuencias exactas de diferentes especies. Que se derrumbó la base de datos de 1.667 secuencias de genes miARN maduros únicos a través de todas las especies, incluida la humana, de ratón, rata, etc. Las secuencias de genes miARN maduros fueron incorporados en las sondas de oligonucleótidos largos 60-mer con una secuencia de unión en el extremo 3 'para separar las secuencias de genes miARN lejos de la superficie de deslizamiento de vidrio. La secuencia de engarce era una secuencia de propiedad de Agilent que tiene una homología mínima con cualquier secuencia en el GenBank. Cada maduro miARN está representado por + y - (complemento inverso) secuencias de la cadena. Esto permite que el microarray para ser utilizado con diferentes protocolos de etiquetado. Dependiendo del protocolo, una de las sondas también pueden servir como un control negativo. Cada sonda tiene 4 repeticiones dentro de cada microarray, proporcionando repeticiones técnica para medir la consistencia y el rendimiento de los microarrays. En resumen, cada uno de los genes miARN maduro única está representado por 8 sondas (4 + 4 - hebra y hebra). Un total de 3.556 identificadores únicos (LMT seq miARN, controles positivos y negativos, +/- hebra) estaban en el microarray, cada uno con 4 repeticiones. http://​www.​ncbi.​nlm.​nih.​gov/​geo/​query/​acc.​cgi?​token=​ftixhsoiemwgyfi&​acc=​GSE30070

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