PLoS ONE: hyönteisiä Bats Digest Kitiini vatsassa käyttäminen Happamat Nisäkkäiden Chitinase

tiivistelmä

ruoansulatuskanavassa Eläinten on mukautettu niiden ensisijainen lähde elintarvikkeiden optimoida resurssien käyttöä ja energian saantia. Lauhkean lepakkolajien syövät pääasiassa niveljalkaisten. Nämä sisältävät energiaa runsaasti hiilihydraatteja kitiini, joka on sulamaton varten endogeeniset entsyymit tyypillisen nisäkkään ruoansulatuskanavassa. Kuitenkin ruoansulatuskanavasta lepakkolajien olisi mukautettava niiden ruokavalio ja voi sulattaa kitiini. Oletimme, että (i) Euroopan vespertilionid lepakkolajien on ruoansulatus entsyymi kitinaasia ja että (ii) kitiiniä aktiivisuus sijaitsee suolistossa, koska on löydetty Pohjois-Amerikan lepakkolajien. Mahasuolikanavissa seitsemän lepakkolajien ( Pipistrellus pipistrellus
, Plecotus auritus
, Myotis bechsteinii
, Myotis nattereri
, Myotis daubentonii
, Myotis Myotis,
ja Nyctalus leisleri
) testattiin kitiiniä aktiivisuuden diffuusion määrityksessä. Mahasuolikanavissa P. pipistrellus
, P. auritus
, M. nattereri
, M. Myotis,
ja N. leisleri
tutkittiin hapan nisäkkään kitinaasia Western blot -analyysillä. Kudosleikkeiden maha-suolikanavan P. pipistrellus
oli immunohistokemiallisesti analysoitiin paikantaa happaman nisäkkäiden kitinääsi. Kitiiniä aktiivisuutta havaittiin vatsat kaikkien lepakkolajistoa. Western blot-analyysi vahvisti hapan nisäkkäiden kitinaasiaktiivisuuden vatsassa näytteissä. Immunohistokemia on P. pipistrellus
ruoansulatuskanavassa osoitti, että hapan nisäkkään kitinaasiaktiivisuuden sijaitsee mahassa pääsoluissa juuressa mahalaukun rauhaset. Lopuksi Euroopan vespertilionid lepakkolajien happamia nisäkkäiden kitinaasiaktiivisuuden joka tuotetaan maharauhanen vatsaan. Siksi mahasuolikanavissa hyönteisiä lepakkolajien kehittynyt entsymaattinen sopeutumisen ruokavaliostaan.

Citation: Strobel S, Roswag A, Becker NI, Trenczek TE, Encarnação JA (2013) hyönteisiä Lepakot Digest Kitiini vatsassa käyttäminen hapan Nisäkkäiden kitinääsi. PLoS ONE 8 (9): e72770. doi: 10,1371 /journal.pone.0072770

Editor: François Blachier, National Institute of Agronomic Research, Ranska

vastaanotettu: 26 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 12 heinäkuu 2013; Julkaistu: 03 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Strobel et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eläimet on nielemään ja sulavaa ruokaa varmistamiseksi jatkuvaan toimintaan sisäisen aineenvaihdunnan peittämällä, esimerkiksi niiden energiaa, proteiineja ja vitamiini vaatimukset [1]. Monivaiheinen prosessi ruuansulatusta sisältää mekaanisen, kemiallisen ja entsymaattisen vaiheen muuntamiseksi ravintoaineiden [2]. Lepakkolajien on korkea massa erityisiä energian kysyntään, koska niiden pieni koko ja kyky lentää aktiivisesti [3], [4]. Vuonna lentävät eläimet, ruoka täytyy käsitellä nopeasti vähentää energian kysynnän aiheuttama lisääntynyt lennon massa [2]. Euroopan bat lajit ovat ruokavalio koostuu pääasiassa niveljalkaisten [5]. Niillä on lyhyt retentioajat [6], mutta korkea ruoansulatus hyötysuhde [7]. Tämä viittaa siihen, että niiden maha (GI) on erittäin mukautettu niiden ruokavalioon, koska se sulattaa niveljalkaisten nopeasti ja perusteellisesti. Siksi voitaisiin väittää, että Euroopan lepakkolajien riippuvaisia ​​niveljalkaisten erityisiä ruoansulatusentsyymien. Koska niveljalkaisten koostuvat jopa 75% kitiini (energiapitoisuus 21,2 kJ /g, [8]), on erittäin todennäköistä, että lepakkolajien pystyvät sulattamaan kitiinistä materiaalia, kuten on osoitettu muilla selkärankaisilla, kuten Euroopan vihreä lisko ( Lacerta viridis
), yhteinen mustarastas ( Turdus merula
) ja kettu ( vulpes vulpes
) [9], [10].

Kitiini voidaan hajottaa kitinaaseilla (EY 3.2.1.14) ja jotkut lysotsyymejä (EY 3.2.1.17) [11], [12]. Nisäkkäillä vain kahden kitinaaseja on tunnistettu: chitotriosidase ja hapan nisäkkään kitinaasi (AMCase) [13], jotka molemmat luokitellaan endochitinases [14]. Chitotriosidase pääasiassa erittävät fagosyyttien ja toimii vastoin kitiini-taudinaiheuttajia sisältäviä [15]. AMCase on toistaiseksi ainoastaan ​​tunnistettu hiirillä (Mus musculus), makakit (Macaca fascicularis) ja ihmisillä [16], [17]. Se ilmentyy voimakkaasti mahassa ja keuhkoissa, mikä osoittaa, kaksi ruoansulatuskanavan ja immuunijärjestelmän funktio [16], [17]. Kitiiniä toiminta voi myös olla peräisin endogeeniset entsyymit, nautitun ruoan läsnä ruuansulatuskanavassa, tai tuottamat entsyymit mikro-organismien [18], [19].

kitiiniä toimintaa ruoansulatuskanavasta on löytynyt useista hyönteisiä lepakkolajistoa [8], [9]. Kuitenkin, ei ole tietoa siitä, että vastaavaa entsyymiä. Jeuniaux [9] todennettu kitiiniä toimintaa ruuansulatuskanavassa Rhinolophus ferrumequinum
, eurooppalainen lepakkolajien perheen Rhinolophidae. Whitaker, et ai. [8] osoitti kitiiniä aktiivisuutta ruuansulatuskanavassa pohjoisamerikkalaisten vespertilionid bat sukuihin Myotis
, Eptesicus
, Nycticeius
, Lasiurus
Pipistrellus
ja Lasionycteris
. Ne eristettiin kitinaasia tuottavien bakteerien kannat suolesta lähteenä kitiiniä toimintaa. Sen sijaan Jeuniaux [9] löytänyt todisteita kitiiniä toimintaa mahan limakalvon vatsaan Rhinolophus ferrumequinum
taas suolistossa ei esiintynyt kitiiniä aktiivisuutta. Kuitenkin Buchholz, Wells & Conaway [20] ei havainnut mitään kitinaasiaktiivisuuden että hyönteisiä lepakkolajien Pipistrellus subflavus
ja Myotis grisescens
. Lisäksi kitinaaseja, jotkut lysotsyymit pystyvät liuottamaan kitiini [11], [12]. Esimerkiksi Phillips, Weiss & Tandler [21] havaittu lysotsyymin sylkirauhaset hyönteisiä lepakkolajien ja arveltu, että se voisi toimia kitiiniä entsyymi syljessä. Kuitenkin lysotsyymit ovat pääasiassa antibakteerinen ja ovat tärkeä osa immuunijärjestelmää [22] tai pilkkomiseen bakteerien märehtijöiden [12].

Hypoteesimme että (i) Euroopan hyönteisiä lepakkolajien perheen Vespertilionidae hallussaan kitiiniä toimintaa ruoansulatuskanavasta, kuten on osoitettu Pohjois-Amerikan hyönteisiä lepakkolajien [8] ja yksi Euroopan lepakkolajien perheen Rhinolophidae [9] ja (ii) kitiiniä aktiivisuus sijaitsee suolistossa, mikä on ollut esitetään Pohjois-Amerikan lajien [8]. Tässä tutkimuksessa olemme sijaitsee kitiiniä toimintaa ja tunnistaa vastaavan entsyymin AMCase käyttämällä entsyymiä määritystä, immunoblottauksen ja immunohistokemia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki yksilöt käytetyt tässä tutkimuksessa kuoli vapaaehtoista kuntoutuskeskuksille lepakoiden. Ne toimitetaan vapaaehtoisvoimin ilman minkäänlaista tukea. Saksan Animal Welfare Act (TSchG §4 (3)) ja liittovaltion luonnonsuojelulaki (BNatSchG kohta 45 (4)) ei tarvitaan lupa työskennellä ruhojen. Hiiren vatsa oli jäänne tutkimuksen instituutin anatomian ja solubiologian Justus-Liebig-yliopisto Giessen joka hyväksyttiin maakuntaliiton (nro V54-19C20 /15C Giessen 20/23 400AZ). Eläintä kuoli varten tässä tutkimuksessa.

Tissue varastointi

ruhot varastoitiin välittömästi kuoleman jälkeen -20 ° C: ssa. Lepakot toimitettiin jäällä eli jäädytetään yliopiston Giessen. Ruhot varastoitiin enintään kuuden kuukauden -80 ° C: ssa, kunnes kudosvalmistuksen. Makro- ja mikroskooppinen havainnot tarkistanut erittäin hyvä säilyttäminen elinten ja solujen tehty entsymaattinen ja histologiset tutkimukset kudosten mahdollista.

Kudospreparointi

ruhot seitsemän hyönteisiä lepakkolajien ilman merkkejä mätäneminen ( Pipistrellus pipistrellus
( n
= 14), Plecotus auritus
( n
= 3), Myotis bechsteinii
( n
= 1), Myotis nattereri
( n
= 3), Myotis daubentonii
( n
= 2) Myotis Myotis
( n
= 1) ja Nyctalus leisleri
( n
= 1)), käytettiin tässä tutkimuksessa (taulukko 1) . Avaamisen jälkeen vatsan, maha-suolikanavan poistettiin, pestiin 0,9% NaCl, ja kuivataan suodatinpaperilla. Maha-suolikanavan jaettiin ruokatorvi, mahalaukku, pohjukaissuoli, jejunum /ileum, ileum /paksusuolen ja paksusuolen /peräsuolen jälkeen Ishikawa et al. [23] ja punnittava digitaalivaaka (EW2200-2NM, tarkkuus: 0,01 g; Kern & Sohn GmbH, Balingen, Saksa). Lisäksi vatsaan Mus musculus
(kanta C57BL /6, musta 6; n
= 1) käytettiin positiivisena kontrollina AMCase havaitsemista western blottauksella.

valmistaminen liukoista jakeet

maha-suolikanavan segmenttien ei-kiinteä, raikas yksilöitä P. pipistrellus
( n
= 11), P. auritus
( n
= 3), M. bechsteinii
( n
= 1), M. nattereri
( n
= 3), M. daubentonii
( n
= 2), M. Myotis
( n
= 1) ja N. leisleri
( n
= 1) ja mahan M. musculus
yksilöllisesti jauhetaan morttelissa ja survin extra-puhdas meri hiekka (Merck, Saksa) ja 0,9% NaCl (standardoitu kudos määrä: 1 ml per 100 mg kudosta). Homogenaatteja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa [10], ja sitten se sentrifugoitiin (20 min, 3500 g, 4 ° C). Supernatantit pidettiin -20 ° C: ssa lisäanalyyseihin saakka.

määritys kitiiniä toiminnan

mittaamiseksi kitiiniä toimintaa, agaroosigeelillä levyt valmistettiin, kuten on kuvattu Zou, Nonogaki & Welbaum [24] joitakin muutoksia. Fosforihappoa turvonnut kitiinin valmistettiin sekoittamalla 10 g kitiiniä päässä rapu kuoret (Roth, Saksa) 100 ml: lla 85%: ista fosforihappoa ja inkuboitiin 48 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Sitten 2 L kylmää vesijohtovettä lisättiin ja saatua kakkua pestiin, kunnes pH 6,5 oli saavutettu [25], [26]. Agaroosia (1,6%) liuotettiin inkuboimalla puskurissa (pH 5,0) [24] mikroaaltouunissa ja jäähdytettiin 50-60 ° C: ssa. Sen jälkeen fosforihapolla turvotettua kitiini (0,5%) lisättiin ja 10 ml tätä suspensiota pipetoitiin 85 mm: n Petri-maljoille. Polymeroinnin jälkeen, 4 mm: n läpimittaiset kuopat puhkaistiin agaroosi ja geelin paloja poistettiin käyttäen vesisuihkupumpun.

lyofilisoituna jauheena standardin kitinaasiaktiivisuuden alkaen Serratia marcescens
(5 U; Sigma-Aldrich, Saksa) liuotettiin 1 ml: aan inkubaatiopuskuria kuin standardiliuosta. Tunnettu pitoisuus standardin kitinaasia lisättiin kullekin maljalle referenssinä ja inkubointia puskuria käytettiin negatiivisena kontrollina. Ensimmäinen, 6 ui näytettä kutakin liuosta pipetoitiin kuoppaa kohti, jonka jälkeen levyjä inkuboitiin 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, jotta näytteet diffundoitua agar. Sitten ylimääräinen L näytettä lisättiin jokaiseen koloon ja levyjä inkuboitiin huoneen lämpötilassa 20 min, minkä jälkeen inkuboitiin 37 ° C: ssa 20 h. Agaroosi jälkeen levyt värjättiin 0,1% calcofluor (Calcofluor valkaisuun M2R, Sigma, MO, USA) 10 minuutin ajan ja pestiin tislatulla vedellä 2 h. Lyyttinen vyöhykkeet tehtiin näkyviksi UV-läpivalaisulla ja sitten valokuvattiin. Halkaisijat lyyttistä vyöhykkeiden mitattiin GIMP (versio 2.6.11; www.gimp.org). Käyttämällä viite laimennus sarjassa kitinaasiaktiivisuuden kantaliuosta inkubointipuskurilla entsyymin toimintaa laskettiin alueen halkaisija verrattuna logaritmi keskittymistä ja vaihtelua maljoja säädettiin sisäisten kitinaasiaktiivisuuden standardeihin jokaiseen petrimaljaan.

analysoimiseksi entsyymiaktiivisuus eri pH-arvoilla, geeli-levyt valmistettiin kuten edellä, mutta eri pH-arvoja (pH 4,0, pH 5,0, pH 6,0, pH 7,0 ja pH 8,0). Supernatantit mahan, pohjukaissuolen, tyhjäsuolen /ileum, ileum /paksusuolen ja paksusuolen /peräsuolen yksi yksilö on P. pipistrellus
käytettiin. Lyyttisen vyöhykkeet visualisoitiin UV-läpivalaisulla ja analysoitiin kuten aiemmin. Lisäksi pH-arvot maha-suolikanavan osissa viisi henkilöä on P. pipistrellus
mitattiin monivärinen-koodattua pH-paperilla (pH 0,0-6,0: Acilit, tarkkuus 0,5; pH 6,5-10,0: Special Indicator, tarkkuus 0,3, Merck).

ilmentäminen kitinaasiaktiivisuuden ruuansulatuskanavassa

Western blot-analyysi.

Western blottaus suoritettiin tunnistamiseksi ja biokemiallisesti paikantaa kitinaasiaktiivisuuden ruuansulatuskanavassa eurooppalaisten lepakkolajien ja jättää kitiiniä toiminnan aiheuttamia lysotsyymin. Supernatantit kudosnäytteitä kuudesta lepakkolajien (maha-suolikanavan osassa näytteistä (mahalaukku, pohjukaissuoli /ileum, ileum /paksusuolen ja paksusuolen /peräsuolen): P. Pipistrellus
( n
= 2 ), P. auritus
( n
= 2), M. nattereri
( n
= 1), M. Myotis
( n
= 1) ja N. leisleri
( n
= 1); ylimääräinen vatsa näytteet: P. pipistrellus
( n
= 9), M. nattereri
( n
= 1), M. daubentonii
( n
= 2)) ja vatsaan M. musculus
käytettiin positiivisena kontrollina [27] tehtiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidielektroforeesilla (SDS-PAGE) (Laemmli [28] jälkeen muokatut Sambrook, Fritsch &Maniatis [29]).

supernatantit kustakin 750 ug kudoksen sekoitettiin 01:01 2 x SDS-latauspuskuria, ja kuumennettiin 95 ° C: ssa 3 min. Kutakin näytettä, 15 ui saatettiin 12% ratkaista geeliä ja 5% pinoaminen geeli. Elektroforeesi suoritettiin pelkistävissä olosuhteissa jännitteellä 100 V. erotetut proteiinit elektroblotattiin 1 h vakiovirralla 0,8 mA /cm ^{2 PVDF-membraaneille. Blotit blokattiin 5% rasvatonta maitojauhetta tris puskuroidulla suolaliuoksella (TBS, pH 7,5), joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä (Roth) 1 h ennen inkuboinnin kanin polyklonaalinen vasta-aine on suunnattu N-terminaalisen happamien kitinääsi ( AVIVA Systems Biology, CA, USA; laimennettiin 1:1000 TBS, joka sisälsi 1% BSA) 4 ° C: ssa yön yli. Sen jälkeen kun oli pesty TBS: llä, joka sisälsi 0,05% Tween 20 ja 0,1% BSA: ta, kalvot inkuboitiin 1 h alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vuohen polyklonaalinen vasta-aine kanin lgG: tä (H & L) (Roth, Anti Rabbit-AP 4751; laimennettu 1:7500 TBS: ssä, joka sisälsi 1% BSA: ta). Täplät pestiin neljä kertaa, ja vasta-aineen sitoutuminen visualisoitiin inkuboimalla bromochloroindoyl fosfaatti (Bethesda Research Laboratories, MD, USA) ja nitrosinitetratsoliumia alustan (Biotech Trade & Service GmbH, Saksa) mukaan Harlow ja Lane [30].}

immunohistokemia.

paikallistaa AMCase solutasolla, immunohistokemiallinen analyysi tehtiin maha-suolikanavan segmenteillä P. pipistrellus
( n
= 3). GI-kanavan osat kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (pH 7,0) 24 tunnin ajan, ennen kuin ne pestiin 4 x 1 h TBS: llä. Sitten kudos lohkot poistettiin vesi asteittaisella etanolissa (30%, 50%, 70%, 90%, 100%) ja lopuksi upotettiin parafiiniin. Parafiini lohkot leikattiin osiin 4-9 um paksuus käyttämällä kelkka mikrotomi (Leitz, Saksa) ja kuivattiin yön yli. Saada helposti antigeenisitoutumiskohtaa kudosleikkeet esidi- pepsiinillä (Sigma) jälkeen Goto et al. [27]. Leikkeet pestiin 0,01% Tween 20 TBS: ssä. Epäspesifinen estettiin 5% vuohen seerumia (Merck), 3% BSA: ta (AppliChem, Saksa). Leikkeet altistettiin kanin polyklonaalinen vasta-aine on suunnattu N-terminaalisen happamien kitinaasi (AVIVA Systems Biology, laimennettiin 1:200 TBS, joka sisälsi 1% BSA: ta), kosteassa kammiossa. Sitoutumattoman vasta-aineet poistettiin pesemällä TBS, ennen sekundaarista vasta-ainetta (ChromeoTM 546, Abcam, UK; laimennettiin 1:2500 0,5% BSA TBS) on sovellettu. Ydin- counterstaining leikkeitä inkuboitiin 0,05% 4 ', 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) (AppliChem). Jälkeen lopullinen huuhtelu TBS: llä, leikkeet asennettu 1,4-diatsabisyklo [2.2.2] oktaani-liuosta (DABCO) (Sigma). Valvonnasta autofluorisaatiota ja sitovat vasta-aineiden spesifisyys leikkeet käsiteltiin fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) leimattua sekundaarista vasta-ainetta, mutta ilman primaarista vasta-ainetta. Leikkeet arvioitiin käyttämällä fluoresenssimikroskoopilla (Olympus BX60 F-3, Olympus Optical Co LTP, Saksa).

Tulokset

kitiiniä aktiviteetti

Pystyimme tunnistamaan kitiiniä aktiivisuus vatsassa näytteet kaikista yksilöiden (esimerkiksi Fig. 1) ja paksusuolen /peräsuolen näyte yhden, M. Myotis, M. nattereri
ja N. leisleri
kukin (taulukko 2). Ei kitiiniä aktiivisuutta voitiin mitata pohjukaissuoli, jejunum /ileum tai sykkyräsuoli /paksusuolen näytteitä. Kitiiniä aktiivisuus vatsassa näytteissä oli korkein välillä pH 5,0 ja pH 6,0 (Fig. 2). Tukeminen aikaisemmat tulokset, ei kitiiniä aktiivisuutta havaittiin muilla alueilla ruuansulatuskanavassa, riippumatta pH-arvo. Keskimääräinen pH-arvo ruuansulatuskanavassa P. pipistrellus
( n
= 5) oli 5,6 ± 0,2 vatsassa, 7,0 ± 0,3 pohjukaissuolessa, 7,1 ± 0,2 tyhjäsuolessa /ileum, 7,0 ± 0,2 sykkyräsuolessa /paksusuolen ja 7,0 ± 0.5 paksusuolen /peräsuolen.

ilmentäminen kitinaasiaktiivisuuden ruuansulatuskanavassa

Western blot analyysi M. musculus
vatsa osoitti tunnusomaisen bändi suhteellisella molekyylipaino 46 k, että niissä on AMCase. Lisäksi kaikissa vatsassa näytteitä P. pipistrellus, P. auritus, M. nattereri
, M. Myotis
, ja N. leisleri
selkeä proteiinia bändi 46 k tunnistettiin (edustavien western blot kuvia, ks. 3 Pipistrellus
ja Fig. 4 Plecotus, Myotis
ja Nyctalus
). Tämä proteiini bändi ei havaittu ruokatorven, pohjukaissuolen, tyhjäsuolen /ileum, sykkyräsuoli /paksusuolen tai paksusuolen /peräsuolen näytteitä lepakkolajistoa (Fig. 3). Kaikki immunohistokemiallista tulokset kontrolloitiin autofluorisaatiota ja epäspesifistä sitoutumista toissijaisen FITC-kytketyn vasta-aine. Vatsa kohdat olivat positiivisia anti-AMCase vasta-merkintää, kun taas ruokatorven, pohjukaissuolen, tyhjäsuolen /ileum, ileum /paksusuolen ja paksusuolen /peräsuolen osaan ei ole sitovaa havaittu. Vatsassa osaan, anti-AMCase merkintöjä rajoittui pohjaan maharauhanen pitkin mahan limakalvon noin DAPI-värjätty solutumien (Fig. 5).

Keskustelu

Oletimme että Euroopan hyönteisiä lepakkolajien perheen Vespertilionidae on ruoansulatus entsyymi kitinääsi. Tämä hypoteesi varmistettiin läsnäolo kitiiniä toimintaa vatsat tutkittujen lajien. Lisäksi todellinen kitinaasia, erityisesti AMCase voitaisiin biokemiallisesti merkittävä kaikissa mahalaukussa näytteissä. Aktiivinen kitinaaseja ovat yleisiä ja konservoitunut nisäkkäissä [14]. Kuitenkin sijainti ja toiminta AMCase eroavat lajien välillä eikä niitä ole täysin ratkaistu [31].

lisäksi arveltu, että kitiiniä aktiivisuus sijaitsee suolistossa, erityisesti ohutsuolessa, koska se on , jossa tärkeimmät entsymaattista ruoansulatusta ja imeytymistä tapahtuu [32]. Tuloksemme ei vahvistanut tätä hypoteesia kuin kitiiniä aktiivisuus paikallistettiin pääasiassa mahassa ja kolme yksilöitä Hiljaiset paksusuolen /peräsuolen. Korkea vaihtelevuus kitiiniä toimintaa tutkittiin henkilö saattaa johtua vaihtelemalla ruoansulatuskanavan toiminnan yksilöiden kuolinhetkellään. Tätä tukee eri määriä ruokaa löytyy GI kirjoituksia. Kitiiniä aktiivisuus vatsassa näytteistä mutta ei paksusuolen /peräsuolen näytteet voitaisiin jäljittää aktiivisuutta AMCase eikä joka lysotsyymin western-blottauksella. Aktiivisuus bat AMCase oli optimaalinen välillä pH 5,0 ja pH 6,0. Nämä pH-tasot ovat verrattavissa hapan miljöö vatsat hyönteisiä lepakkolajien mitattuna tässä tutkimuksessa ja raportoineet Naumova ja Zharova [33]. Tämä on ensimmäinen osoitus biologista merkitystä AMCase ruoansulatuksen aikana tässä osassa ruoansulatuskanavasta. Kuitenkin lisäkokeita kuten ruoansulatuskanavan tehokkuutta kokeet olisi suoritettava testata, jos toimintaa AMCase muodostaa biologinen merkitys kitiini ruoansulatusta. AMCase on kaksi tehtävää koskemattomuutta ja ruoansulatusta kitiini sisältäviä organismeja [34], [35]. Esimerkiksi ihmisen AMCase ei ole mukautettu happamassa ympäristössä vatsassa, toisin kuin AMCase havaittu hiirissä [31]. Vatsa AMCase on M. musculus
sisältää aminohapposubstituutioita, jotka ovat välttämättömiä, jotta sovitus hapan miljöö mahan [31]. Lisäksi Boot et al. [17] osoitti, että AMCase mRNA M. musculus
löytyy vain mahassa. Jos nämä aminohapposubstituutiot ovat läsnä AMCase on lepakkolajien epäselvää, saadaanko.

Immuunihistokemialliset Tämän tutkimuksen tulokset tukevat lokalisoinnin AMCase vatsaan lepakkolajien erityisesti maharauhanen limakalvon . Lisäksi olemme havainneet, että entsyymi sijaitsi tai ympärillä pääsoluissa sijaitsee pohjan maharauhanen, kuten aiemmin esitetty mahan AMCase on M. musculus
[27], [31], [34]. Chief solut erittävät ruoansulatusentsyymien [36], jotka sijaitsevat lukuisat sytoplasman rakeet [37]. Yhteinen tuottama entsyymi tässä mahan solutyyppi on pepsinogeeni, esiaste proteolyyttistä entsyymiä pepsiini [38]. Goto et ai. [27] osoitti, että tuotantolaitos mahan AMCase on M. musculus
on näissä eritysjyvästen. Sen vuoksi on erittäin todennäköistä, että AMCase erittyy myös mahan päätoimittaja soluja lepakkolajistoa. Tämä on vastoin tulosten Whitaker et al. [8], joka totesi, että kitinaasiaktiivisuuden vuonna lepakkolajien tuotetaan kitinaasiaktiivisuuden tuottavien bakteerien kannat (lähinnä perheen Enterobacteriaceae) suolistossa. On tunnettua, että suoliston bakteerit tuottavat kitinaasia tyydyttää omat ravitsemukselliset vaatimukset [39]. Kuitenkin kitinaasiaktiivisuuden tuottavat enterobakteerit voi myös löytyä GI kirjoitusten nisäkkäiden, jotka eivät syö kitiinistä materiaali [19]. Tämä viittaa siihen, että ei ole läheinen yhteys kitiini ruoansulatusta ja kitiiniä bakteereja. Tässä tutkimuksessa, alhainen kitiiniä aktiivisuus mitattiin suolistossa vain muutamia yksilöitä, eikä AMCase voitu havaita, kun erotetaan suolistossa mahasta. Tämä satunnainen kitiiniä toiminta voidaan selittää kuljetuksen AMCase tuotettu suoleen ruoan kanssa, kuten keskusteltu Suzuki et al. [34] ja Boot et al. [17]. Lisäksi alhainen kitiiniä aktiivisuus suolistossa voi johtua kitinaasia tuottava enterobakteerit [8]. Kuitenkin kvantifiointi näiden bakteerien tarvittaisiin todentaa osallistuminen kitiinin ruoansulatus näiden symbiontit. Siksi on todennäköistä, että kitiinin hyönteisiä lepakkolajien hajotetaan yhdistelmällä endogeenisen mahan AMCase ja kitinaasiaktiivisuuden erittämä suolistobakteerien, kuten ehdotettiin M. musculus
[17]. Tämä tutkimus osoittaa selvästi, että Euroopan hyönteisiä lepakoista perheen Vespertilionidae on ruoansulatus entsyymi AMCase. Osoitimme, että tämä entsyymi on aktiivinen ja sijaitsee vatsassa, erityisesti tai ympärillä pääsoluissa juuressa mahalaukun rauhaset.

Kiitokset

Kiitämme E. Mühlbach, R. Keil , N. Dittrich ja S. Wiegand eläimelle näytteitä ja Y. Kühnel, C. von Bredow, A. Diebel ja Mammalian Ecology ryhmän avusta.

• PLoS ONE: Sonic Hedgehog välittää leviämisen ja rekrytointi transformoidut mesenkymaalisten kantasolujen mahalaukkuun
• PLoS ONE: Ehdollinen ilmentyminen Wnt9b in Six2-positiivisten solujen häiritsee Vatsa ja munuaisten toiminta