Kako stanice integrirati više obrazaca signale kako bi se postigla rani endoderm regionalizacija i dalje u velikoj mjeri nepoznanica. Između gastrulacije i neurulation, retinoična kiselina (RA) signalizacija je potrebno, dok Wnt /β-katenina signalizacija mora biti potisnuta u specifikaciji gušterače, jednjaka, želuca, i dvanaesnika primordia u oocitima pregled embrija. U pokušaju da sijanju RA reguliranih gena u Xenopus pregled, endoderm, identificirali smo izravnu RA ciljani gen, N-myc nizvodno regulirani genski 1a ( ndrg1a pregled) koji su pokazali ekspresiju u ranim archenteron krova endoderm i kasno u razvoju gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesnika. Oba negativna morfolino oligonukleotidne posredovana obaranje ndrg1a Izvor:. Zhang T Guo X, Chen Y (2013.) retinoičnom kiselinom aktivirano Ndrg1a potiskuje Wnt /beta-katenina signalizaciju kako bi se omogućilo Xenopus pregled, Gušterača, Jednjak, želudac, dvanaesnik i specifikacije. PLoS ONE 8 (5): e65058. doi: 10,1371 /journal.pone.0065058 pregled Urednik: Michael Schubert, Laboratoire de Biologie du Développement de Villefranche-sur-Mer, Francuska pregled Primljeno: 29. prosinca 2012. godine; Prihvaćeno: 22. travnja 2013; Objavljeno: 31. svibnja 2013 pregled Copyright: © 2013 Zhang i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan financiranja. Ovo djelo je potpomognut sredstvima iz Nacionalnog Basic Research programa Kine (2009CB941200) i Nacionalna zaklada prirodoslovni Kine (31271554). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled Uvod pregled regionalizacija endoderm događa istovremeno sa formiranjem vrijeme gastrulacije. Do kraja gastrulacije, široka antero-posterior (AP) domene unutar endoderm su uspostavljeni, što se očituje u prednjem izražavanja Hhex pregled, vpp1 pregled, SOX2 retinoične kiseline (RA) signalizacija ima očuvanu ulogu u AP obrazaca vertebrata endoderm već gastrulacije [9]. Studije u žaba, ptica, i miševi pokazuju da RA signalizacija posebno je potreban za formiranje dorzalnoj gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesnika primordia [10], [11], [12], [13], [14] [15]. U zebraste ribice, RA signalizacija prije kraja gastrulacije je potreban za početno razvoju i jetri i gušterače endoderm [16]. RA aktivira ekspresiju RA-ponižavajućem enzima cyp26a1 pregled u prednjem prtljažniku endoderm zauzvrat modulira RA signalizaciju i definira prednji granicu gušterače polju u zebraste ribice embrija [17]. mnx1 pregled identificiran kao RA nizvodno gena koji potiče stvaranje beta stanica u razvoju zebraste ribice gušterači u [18], dok je RA nizvodno gen exdpf pregled regulira ribe razvoj egzokrine gušterače [19]. U endodermal RA ciljne gene koji posreduju rane aktivnosti RA signalizacije navesti gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesnika Anlagen pravilno i dalje biti identificirani. Pregled Canonical Wnt signalni također igra važnu ulogu u AP obrazaca za kralježnjak endoderm. Kod miševa, spoj knockout u Tcf1 Netlogu i Tcf4 N-myc nizvodno regulirani genski 1 (NDRG1) pripada NDRG protein obitelj se sastoji od četiri člana, NDRG1-4, koje karakterizira sadrži NDR domene i α /ß hidrolaze puta motiv [27]. NDRG1 pregled je RA-induktivni gena u različitim staničnim linijama i ljudskim pacijentima [28], [29], [30], [31]. Ndrg1 pregled nedostatak u miševa dovodi do disfunkcije Schwann stanica, sugerirajući da NDRG1 je bitno za održavanjem mijelinske ovojnice u perifernim živcima [32], [33]. Ndrg1 pregled -null miševi su pokazali smanjenu mastocita sazrijevanje i degranulaciju i oslabljene alergijske reakcije [34]. U Xenopus Netlogu, ndrg1 pregled je identificiran kao gen obogaćen za ekspresiju u endoderm i pronephros [35], [36]. Nedavno istraživanje korištenjem stanične linije raka otkriva da supresorski gen metastaze tumora, NDRG1, potiskuje Wnt /β-katenina signaliziranja izravno interakciju sa Wnt receptora LRP6, posljedično uzrokuje supresiju Wnt /β-katenina ciljanog gena ATF3 pregled izraz [37]. Aktivirajući transkripcijski faktor 3 (ATF3) pripada ATF /cikličkog AMP odgovornim elementom za vezanje obitelji bazičnih leucinskog zatvarača faktore transkripcije. To je adaptivno gen odgovor i može djelovati kao transkripcijski aktivator ili repressor, ovisno o tipu stanica i sredstvu za podražavanje [38], [39], [40]. ATF3 u ovom istraživanju koristili smo DNA mikročipa u kombinaciji s cijelom brdu in situ hibridizacije na zaslonu RA propisane gena u oocitima pregled endoderm. ndrg1a pregled je identificiran i ovjeren se direktno aktivira RA u archenteron krova endoderm i kasno u razvoju gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesnika. Pružamo dokaza koja govori da postoji da RA aktivirani Ndrg1a potiskuje Wnt /β-katenina signalizaciju u endoderm stanicama archenteron krovnih i time oslobađa inhibicijski učinak Wnt /β-katenina signalne aktivnosti na formiranje gušterače, jednjaka, želuca i duodenuma. Rezultati pregled ndrg1a pregled, Ra reguliranog gena, izražena je u ranim Endodermal Archenteron krov pregled S obzirom na endodermal organogeneze, Xenopus ndrg1a pregled izražavanja u Archenteron Krov endoderm stanica direktno aktiviran RA pregled Kako bi se dodatno provjeriti podatke microarray, analizirali smo ndrg1a Da bi se riješila ako RA može izravno regulirati ndrg1a pregled izraz, tretirani smo Xenopus pregled embrija s cikloheksimida (CHX), inhibitor sinteze proteina, 15 minuta prije primjene RA. Naši podaci pokazuju da je izazvana širenje RA ndrg1a pregled izraz u archenteron krova endoderm nije bio pod utjecajem CHX (Sl. 2S), podržava ideju da RA direktno aktivira ndrg1a ndrg1a pregled obaranje u Xenopus pregled Embriji Phenocopies BMS453 Liječenje pregled Da biste generirali ndrg1a pregled morphants, kupili smo dva ndrg1a pregled negativna morfolino oligonukleotidima (MO) iz Gene alati. Jedan pokriva ATG start kodon (MO1), a drugi (MO2) smješta u 5 'netransliranoj regiji ndrg1a kako bi se ispitalo da li Ndrg1a funkcionalno može posredovati RA signalizaciju navesti prednjem crijevu endoderm, mi ubrizgava MO1, MO2 ili Como odvojeno u biljnog dijela sva četiri blastomera od 4-cell stage embrija, prikupljeni embriji u fazama od 36 do 42, i analiziraju s pločom endodermal marker gena. ptf1a pregled / P48 pregled je specifično za prekursora stanica gušterače tijekom ranog embriogeneze, a kasnije postaje ograničena na exocrine gušterače [10], [44], [45]. pdx1 Podaci pokazuju da je MO1 i MO2 jednako učinkovito ukida inzulin pregled, ptf1a pregled / P48 pregled, PDIP pregled, pdx1 pregled i SOX2 pregled izraz u gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesnika, ali je imao manji utjecaj na darmin Netlogu, hhex pregled i nkx2 pregled. 1 pregled izraz u crijeva, jetre, štitne žlijezde i pluća, što je vrlo sličan učinku BMS453 (sl. 4A a [10]). Jedina razlika je u tome što nema trbušna izraz gušterače od ptf1a pregled / P48 pregled, PDIP pregled ili pdx1 pregled zabilježeno je u ndrg1a injekciju čak 4 ng ndrg1a pregled mRNA u Xenopus pregled embrija uzrokuje ni morfološki poremećajima, niti ekspresije preinake marker-genima analizirani (sl. S2A, B). Co-injekcija ndrg1a pregled mRNA sa mos nije mogao spasiti MO fenotip ili (podaci nisu prikazani). Čini se da smo bili u mogućnosti da biste dobili funkcionalnu Ndrg1a proteina u Xenopus pregled embrija kroz rutinske mRNA za ubrizgavanje protokol koji radi za većinu, ako ne i sve analiziraju drugi geni. Ndrg1a-GFP konstrukt pokazalo da je protein proizveden (Sl. S3) Mi nedavno utvrđeno gena pomoću talen ciljanje Xenopus pregled [54]. Dalje verifikacije MO fenotip, dizajnirali smo ndrg1 pregled TALENs unutar trećeg egzona Xenopus tropicalis ndrg1 pregled gena (Sl. 5A), koja djelotvorno uzrokovane somatske mutacije na ciljanu lokusa (Slika. 5B). U skladu s MO fenotipom dobivenog u Xenopus laevis RA Aktivni Ndrg1a potiskuje Wnt /β-katenina Signalizacija u Archenteron Krovna endoderm stanicama kako bi se omogućilo gušterače , Jednjak, želudac, i dvanaesnika Specifikacija pregled Mehanistički, NDRG1 može komunicirati s Wnt receptora LRP6 i blokirati Wnt /β-katenina signalizaciju u staničnim linijama karcinoma [37]. Da pitam, ako RA aktivira Ndrg1a može potisnuti Wnt /β-katenina signalizaciju u Xenopus pregled embrija, usporedili smo razine nuklearnog β-katenina u ndrg1a pregled pozitivnih archenteron krov endoderm stanice fazi 20 embrija koji su bili podvrgnut RA, BMS453 liječenje, ili MO1 injekcije. Imunolokalizacija nuklearnog P-katenina je pouzdana metoda za karakterizaciju aktivnost Wnt /β-katenina signalizacija u Xenopus pregled embrija [55]. U odabranom području archenteron krova endoderm, nekoliko stanica pokazala nuklearne β-katenina bojanje pod normalnim uvjetima, koji je postao još manje na RA tretmana. Nasuprot tome, broj nuklearne β-katenina pozitivnih stanica u archenteron krova endoderm značajno povećava nakon BMS453 liječenja ili MO1 injekcije (sl. 6A, B). Zajedno, ovi podaci ukazuju na to da RA i Ndrg1a potisnuti Wnt /β-katenina signalizaciju u oocitima Kako bi se ispitalo da li RA, Ndrg1a i Wnt /β-katenina signaliziranje funkcionalno povezani u istom kaskade u kontroli gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesnika specifikacije, mi ko-ubrizgava ndrg1a pregled MO1 s GR-ΔNTcf3, dominantnog negativnog oblika Tcf3 spojen s domenom hormona vezanje receptora glukokortikoida služi potiskivanju Wnt /β-katenina signalizaciju na deksametazon indukcije [56]. Naši podaci pokazuju da potiskujući Wnt /β-katenina signalizacija spasio ndrg1a pregled obaranje fenotip (sl. 7a, b). Ektopično aktivacija nkx2 Netlogu. 1 pregled (Sl. 7B44, 45), SOX2 pregled (Sl. 7A19, 20 i B24, 25), i foxa1 pregled (Sl. 7B14, 15), faktor forkhead transkripcije obilježavanja želudac, duodenum i proctodaeum [44], u korelaciji s gubitkom darmin pregled ekspresije (Sl. 7A24, 25, 7B29, 30 ) nakon injekcije 0.25 ng GR-ΔNTcf3 mRNA. U skladu s prethodnom istraživanju [22], veće doze (0,8 ng) GR-ΔNTcf3 mRNA potrebno za indukciju izvanmaterničnu izražavanje pdx1 u punom dogovoru s ranijih studija [22], aktiviranje kanonske WNT signalizacija na Xenopus Atf3, navodni Wnt /β- katenina ciljnog gena u Xenopus pregled embrija Naime Koči Xenopus pregled, Gušterača, Jednjak, želudac, a Aduodenum Specifikacija pregled Naime, pokazalo se da je ATF3, a Wnt /β-katenina meta gena u staničnim linijama karcinoma [37], ili mogu transcriptionally potisnuti Pdx1 pregled izraz [59] ili fizički interakciji s PDX1 blokirati posredovanog transaktiviranje PDX1 u mišjem β-stanične linije [60]. Tijekom Xenopus pregled embriogeneza, atf3 pregled teško se otkriva cijelu gori in situ hibridizacije (Sl. S4). RT-PCR analiza je pokazala da je atf3 pregled ekspresija regulira prema gore na ndrg1a pregled obaranje ili β-katenina pojačanom ekspresijom u Xenopus pregled zameci (Sl. 8A). Pronašli smo vezna mjesta tri osnovna TCF /LEF (5'-A /TA /T CAAAG-3 ') u Xenopus tropicalis atf3 pregled promotorska regija, što smjestiti na -1467 bp (TACAAAG), -5591 bp ( AACAAAG) i -8.889 bp (AACAAAG), respektivno. Zajedno, ovi podaci ukazuju na to da atf3 pregled je i ciljni gen Wnt /β-katenina u oocitima pregled embrija. Nevjerojatno, pojačanom ekspresijom Atf3 u Xenopus pregled endoderm vodila potpunom gubitku inzulin pregled, ptf1a pregled / P48 pregled, PDIP pregled pdx1 pregled, foxa1 pregled i SOX2 pregled izraz u gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesnika, ali nije imala očigledan učinak na darmin pregled hhex pregled i nkx2 pregled. 1 pregled izraz (Sl. 8B, C), koji je upravo identična ndrg1a Rasprava pregled ndrg1a pregled direktno aktiviran RA u archenteron krov endoderm stanicama oocitima pregled neurulae. Nuklearna razina β-katenina je vrlo niska u endoderm stanicama archenteron krovnih i čini se da RA aktivira Ndrg1a potiskuje Wnt /β-katenina signalizaciju u tim stanicama. Obaranje ndrg1a pregled oponaša inhibicija RA signaliziranje ili aktiviranjem Wnt /β-katenina signala u Xenopus pregled embrija u odnosu na gušterače, jednjaka, želuca, i dvanaesnika razvoj, što dovodi do gotovo potpuni gubitak specifikaciju tih organa primordia. Blokiranje Wnt /β-katenina signalizacija može spasiti ndrg1a pregled obaranje fenotip. Dakle, Ndrg1a koordinira RA i Wnt /β-katenina signalizaciju u specifikaciji Xenopus pregled, gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesnika. Pregled ndrg1a pregled može biti određena oznaka Gene za dorsalnog gušterače, Jednjak, želudac, dvanaesnik i prekursora u Xenopus pregled Neurulae pregled Nekoliko studija opisani mikropostrojima temelji screening reaktivnih gena RA u Xenopus pregled [61] ili zebraste ribice [17], [18], [62] zametaka. Korištenje mikročipa u kombinaciji s cijelom brdu in situ hibridizacija, bili smo u mogućnosti identificirati archenteron krov endoderm specifičan gen ndrg1a. Ndrg1a je neophodan za Xenopus pregled, Gušterača, Jednjak, želudac, dvanaesnik i specifikacija pregled izraz Rano endodermal u cyp26a1 Netlogu i cdx4 Netlogu u zebraste ribice embriji se čini da se suprotstavi RA signalizaciju iz mesoderm postaviti prednji i stražnji granice teritorija gušterače, odnosno [17], [64]. ndrg1a pregled je prvi gen identificiran koja je izravno aktivira RA rano u oocitima Brojne studije pokazuju da prekomjerna ekspresija NDRG1 u staničnim linijama karcinoma stvara upadljive fenotipova [27]. Također je izvijestio da je izražajnost Ndrg1a u Xenopus pregled zameci rezultate u smanjenom pronephros i neorganiziranim somites [36]. Nepoznatih razloga, nismo mogli dobiti izvanmaterničnu Ndrg1a u funkciji u oocitima pregled embrija. Treba naglasiti da je okrnjena verzija Ndrg1a sa prvih 48 aminokiselina na N-terminalnom nestalima se koristi i za injekcije mRNA i MO dizajn u ranijoj studiji [36]. Također smo pokušali injekciju mRNA s ovom kratkom verzijom i utisnutog embriji bili zdravi, čak i pri visokim dozama (4 ng mRNA). Nismo mogli spasiti našu ndrg1a Ndrg1a posrednika preslušavanja između RA i Wnt /β-katenina Signalizacija je ograničen na Xenopus pregled, Gušterača, Jednjak, želudac, i dvanaesnika Forming stanice Tijekom embriogeneze, stanice moraju stalno integrirati više signalne putove kako bi se postigla svoj poseban sudbinu u pravo vrijeme i mjesto. Integrirani Uloga FGF, RA i Wnt signalni putevi u navodeći pravijeku pluća i kontrolu rasta pluća pupoljak definirano u miševa [65] čuva se u Xenopus pregled [66]. Kod miševa, čini se da RA potiskuje Wnt antagonist Dkk1 pregled izraz u potencijalnom pluća endoderm od E8.5-E9.5 embrija, čime se omogućuje kanonski Wnt signalni plućna specifikacije [65]. RA i Wnt putevi su povezani RA nizvodno ciljnih gena OSR1 pregled i osr2 pregled za održavanje prsne peraje razvoj u zebraste ribice [67]. Zajedno, ovi slučajevi otkrivaju okolnost da RA promiče Wnt /β-katenina signalizaciju. Pregled Ovdje ćemo dati uvjerljive dokaze za prvi put, da naše znanje, koje RA aktivira endodermal izraz Ndrg1a potiskuje Wnt /p katenina signalizaciju i time oslobađa suzbijanje aktivnosti Wnt /beta-katenina signalizacija na Xenopus pregled, gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesnika formacija, što se ne odnosi na specifikaciji jetre i pluća. U prilog našim saznanjima, prekomjerna ekspresija izlučenog Wnt antagonističke Sfrp5 može zamjena za RA u odnosu na indukciju egzokrine gušterače diferencijacije u VegT ubrizgava životinja kape u Xenopus pregled [24]. Štetne učinke ranog izvanmaternične Wnt /β-katenina aktivacije signalnog o formiranju jetre i pluća pupova vidjeli u ovom istraživanju, kao iu ranijim istraživanjima [22] nije u suprotnosti s pozitivnu ulogu kanonske Wnt signaliziranja u promicanju jetru i pluća razvoj, koji je primijetio kada je Wnt /β-katenina signalizacija aktivirati u Xenopus pregled embrija iz etapa od 30 do 42 za jetru i iz faze 28 do 35 godina za pluća, odnosno [22], [66]. Nasilje učinak RA na Xenopus pregled blastula Wnt /β-katenina signalizacija [26] vjerojatno je posredovan Ndrg1a, jer
u Xenopus laevis
i aktivatora transkripcije, kao što su efektorske nukleazama (talen) posredovane poremećaje u ndrg1
u oocitima tropicalis pregled pokaže da kao RA signalizacije, Ndrg1a je posebno potreban za specifikaciju Xenopus pregled, gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesterac primordia. Imunofluorescencija podaci ukazuju na to da RA-aktivirati Ndrg1a potiskuje Wnt /β-katenina signalizaciju u oocitima
archenteron stanica krov endoderm. Blokiranje Wnt /β-katenina signalizacija spasio Ndrg1a obaranje fenotip. Nadalje, pojačanom ekspresijom navodni Wnt /β-katenina ciljnog gena Atf3 phenocopied obaranje Ndrg1a ili inhibiciju RA signalizacije, a Atf3 obaranje može spasiti Ndrg1a obaranje fenotip. Na kraju, gušterača /želudac /dvanaesnika transkripcijski faktor Pdx1 je mogao spasiti Atf3 ekspresiju ili Ndrg1a obaranje fenotip. Zajedno, možemo zaključiti da je RA aktivira Ndrg1a potiskuje Wnt /beta-katenina signalizacija kako bi se omogućilo specifikaciju gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesnika nezrelih stanica u Xenopus pregled embrija pregled
i Foxa2 pregled i izraz stražnji od repna tipa homeobox pregled geni Cdx1 Netlogu, 2 pregled, i 4 pregled [1], [2], [3]. Na kraju, endoderm dovodi do epitela dišnih i probavnih puteva i njihovih povezanih organa, kao što štitnjače, pluća, gušterače, jetre i žučnog mjehura. Loza traganje za kralježnjaka endodermal organogeneze je u velikoj mjeri ovisi o vitalnim boja označavanja na temelju studije sudbina mapiranje [4], [5], [6], [7], [8]. Rano izraz hhex pregled i vpp1 pregled u Xenopus pregled, embriji mogu poslužiti kako bi se prikazali prekursora za jetru i trbušnih gušterače, odnosno [3]. Do sada, postoji nekoliko specifičnih marker geni prijavio, koji se može obilježiti prekursore za leđnih gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesnika vrijeme gastrulacije i neurulation. Pregled
dovelo do prednjeg transformacije dvanaesnika u želucu s malo ili bez crijeva razvijenim [20]. Želudac mezenhimalnih transkripcijski faktor Barx1 posredovana izlučivanje wnt antagonista SFRP1 i SFRP2 je potrebno inhibirati endodermal Wnt /β-katenina signaliziranje i na taj način omogući specifikaciju želuca epitela [21]. Dosljedno, u Xenopus pregled, Wnt /β-katenina signalizacija mora biti potisnuta u prednjem endoderm između gastrula i početkom odsječak fazama razvoja kako bi se omogućilo formiranje jetre, kao i gušterača, želudac, i dvanaesnika primordia [ ,,,0],22], [23]. Izlučeni Wnt antagonist sfrp5
izražena u trbušnoj prednjem crijevu endoderm koordinira specifikaciju jetre i trbušne gušterače poboljšati antagonizmom i kanonski i nekanonskim Wnt signalnog puta [24], [25]. Osim toga, pokazano je da se može potisnuti RA Xenopus pregled blastula Wnt /β-katenina signaliziranje [26]. Pregled
knockout miševi razvili normalno i ne pokazuju nikakve zamjetljive fenotipova u normalnim uvjetima [41]. Nasuprot tome, transgenski miševi koji ekspresiraju ATF3 u jetri, gušterače duktal epitela ili beta stanica pankreasa je dovelo do disfunkcije jetre, grešaka u razvoju gušterači ili disfunkcije otočića, respektivno [41], [42], [43]. Pregled
embriji liječiti sa RA antagonista, BMS453, prije kraja gastrulacije prikazuje određeni gubitak leđnoj gušterače i dio trbušnih gušterače, želuca, i dvanaesnika [10]. Kako prepoznati RA regulirana gena u endoderm, prvo smo učinili microarray analize uspoređujući genske razine ekspresije između divljeg tipa i RA-deficijentnih embrija, koji su tretirani s BMS453 na početku gastrulacije te su prikupljeni u fazama 12, 23, i 34, odnosno , Dobiveni podaci ukazuju na to da geni dolje regulira više od 2 puta u tri različite faze pokazali ograničeno preklapanje (sl. S1 i Tablica S1). U embrija prikupljenih na pozornici 23, ima 138 gena koji su dolje regulirane više od 2 puta po BMS453 liječenja. Prema 138 gena 'strukturalne i funkcionalne informacije dostupne u NCBI bazi podataka, dali smo prioritete faktora transkripcije kinaze, RNK vezujuće proteine, transmembranski proteini, kao i gene koji pokazuje izraz endodermal, i na taj način izabrao 9 gena (Tablica S1) do dodatno analizirati svoje embrionalne izraz uzoraka po cijelom brdu in situ hibridizacije. Jedan od njih, ndrg1a pregled, pokazalo je specifičan izraz u ranim archenteron krova endoderm (sl. 1 B), koji nije otkriven na temelju ranijih studija, vjerojatno zbog nedovoljne osjetljivosti cijelog gori hibridizacije in situ tehnika u prethodna publikacije [35], [36]. U dogovoru s izvješćem iz Zorn laboratorija [35], naši podaci pokazuju da je ndrg1a pregled transkripti su detektirani u leđnoj endoderm u ranoj repnog pupoljka fazi razvoja (sl. 1 C, D, E, G). U kasnom repnog pupoljka, te punoglavac fazama razvoja, pored njegove ekspresije u oku, proctodaeum prekursora i pronephros, ndrg1a pregled je pokazao određeni izraz u ždrijela, jednjaka, gušterače, želuca i dvanaesnika (Sl. 1E , F, H, I, J). Nismo bili u mogućnosti detektirati ndrg1a pregled izraz u jetri [35]. Umjesto toga, jasno ndrg1a pregled signal zabilježen je u razvoju žučni mjehur (Sl. 1i, J). Pregled
izraz u BMS453 i RA liječenih embrija po cijelom brdu in situ hibridizacije. Po BMS453 liječenja, bez ndrg1a pregled, transkripti su detektirani u endoderm stanica archenteron krov (Sl. 2e) i samo tragovi ndrg1a pregled mRNA ostao u leđnoj endoderm pozornici 22 zameci (Sl. 2 H) , Kasnije, ndrg1a pregled izraz je potpuno potisnuto u leđnih gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesnika te je djelomično inhibiran u trbušnoj gušterači (Sl. 2K, N). Nasuprot tome, drugi RA antagonist BMS493 može samo djelomično inhibira ndrg1a pregled izraz u gušterači, jednjaka, želuca i dvanaesnika [11]. Osim toga, ndrg1a pregled izraz u pronephric proksimalnih kanalića je također jako inhibiran BMS453 (Sl. 2 N). Treba napomenuti da je ndrg1a
izraz u očima, mozgu i žučni mjehur bio manje pogođen nakon BMS453 liječenja (Sl. 2K, N). To je uobičajena pojava da se za gene izražavaju se u gušterači, kao iu oči i središnji živčani sustav, kao što su ndrg1a pregled, esr10 pregled, neurod pregled i ptf1a /P48 pregled, samo njihova gušterače izraz inhibirana je BMS453 liječenja (Sl. 2K, N i [10]). S druge strane, primjena RA na Xenopus pregled embrija izazvana značajno povećati ndrg1a
izraz domena u archenteron krova endoderm (Sl. 2F), leđna endoderm (Sl. 2I), gušterače, jednjaka, želuca i duodenum (sl. 2 L, O). Dakle, RA signalizacija je potrebno i dovoljno za aktiviranje ndrg1a
izraz u endoderm stanica archenteron krova. Pregled
izraz u archenteron krova endoderm Stanice. Doista, element RA odgovor je identificiran u Xenopus tropicalis ndrg1 pregled promotorska regija (AGTTCAacAGTTCA -1496bp da -1509bp). Za razliku od Xenopus laevis
je diploidne Xenopus tropicalis
ima jednu ndrg1 pregled gena. Pregled
cDNA. Njihova učinkovitost je bila testirana u in vivo testu, u kojem je GFP kodiranja slijed kondenziranog u veznom mjestu MO-a i dobivena mRNA je ko-ubrizgava sa MO u Xenopus
oplođena jaja za procjenu uživo GFP prijevod na embrijima , Oba MO1 (Sl. 3B) i MO2 (Sl. 3F) bili u mogućnosti da učinkovito inhibira prijevod GFP otvorenom okviru čitanja nakon odgovarajućeg MO1 ili MO2 obvezujući sekvencija, dok je kontrolna MO (Como), to nisu učinili (Sl. 3A, E). pregled
posebno markira razvoj gušterače, želuca, i dvanaesnika [46]. inzulin pregled, endokrini marker gena, isključivo je izražena u leđnoj gušterače pupoljak Xenopus pregled rep bud stage embrija [47], [48]. PDIP pregled je specifičan marker gena egzokrine gušterače [49]. SOX2 pregled obilježava jednjaka, želuca i prednjeg dijela duodenuma [50]. darmin pregled je crijevo specifičan marker gena [35], [51]. hhex pregled služi kao marker gena jetre i štitnjače [52]. nkx2 pregled. 1 pregled maraka razvoju pluća i štitnjače [53]. Pregled
morphants, ali tragovi ptf1a pregled / P48 pregled, PDIP pregled i pdx1 pregled izraz u trbušnoj gušterače pupova su održavane u BMS453 liječi zameci (Sl. 4A i [10]). Morfološke fenotip ndrg1a
obaranje također podsjeća BMS453 liječenja. Embriji ubrizgan MO1 ili MO2 pojavio normalno prije fazi 40, a naknadno se prikazuje teške crijevne malformacije s gubitkom od crijevo izvijanja i formiranja edema (Sl. 4B i [10]). Kao MO1 i MO2 izazvao identične fenotipova, koristili smo MO1 provesti studije odmora. Zajedno, ovi podaci ukazuju na to da RA i Ndrg1a su u istoj genetske hijerarhije u kontroli gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesnika razvoj.
embrija, inzulin pregled i pdx1 pregled, izraz lica bio jako inhibiran u ndrg1 pregled talen mRNA ubrizgava Xenopus tropicalis pregled embrija (sl. 5 C), iako uz nižu frekvenciju u odnosu na MO ubrizgava one, koji se dogodio i na primjenu ptf1a /P48 pregled TALENs u našem prethodnom istraživanju [54]. Stabilna se tek treba utvrditi ndrg1 pregled nokaut žaba linija. secirao smo 25 froglets koji su pokazali gušterače, želuca, i dvanaesnika hipoplazija ili čak aplazija, ali s normalnim jetre i žučnog mjehura razvijene (Sl. 5D). Dakle, ovi podaci potvrdili ndrg1a pregled MO fenotip dobiti u Xenopus laevis pregled. Pregled
archenteron endoderm stanica krova. Pregled
i for1
, jetra specifična marker gena [ ,,,0],22], [57], u Xenopus pregled embrija (podaci nisu prikazani). pregled
endoderm od biljnog injekcijom od 0,5 ng GR-LEFΔN-βCTA mRNA koji sadrži Lef1 DNA veznu domenu i β-katenina transaktivacije domenu [58] u 4 blastomeri 4-stanica stadiju embrija u rezultirala identičan fenotipa uzrokovanih Ndrg1a obaranje u kontekstu gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesterac razvoj (sl. 7A, B). Potiskivanje učinak Wnt /β-katenina signalizacije na formiranje jetre (Sl. 7A27, 32, B32, 37) i pluća (Sl. 7A37, B42), ne vidi u Ndrg1a morphants, sugerirajući da rane represiju Wnt /β-katenina signalizacija na području jetre i pluća tvori endoderm izvršava faktori osim RA aktiviranih Ndrg1a. Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju na to da Wnt /β-katenina signalizacija je nizvodno od Ndrg1a i potisnuta Ndrg1a dopustiti specifikaciju gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesnika. Pregled
obaranje fenotipa (Slika . 4A). Što je još važnije, atf3 pregled MO, koja jedino uzrokovana manjim učinkom na ekspresiju marker geni analizirao, bio je u stanju spasiti inzulin pregled, ptf1a pregled / P48
, PDIP pregled, foxa1 pregled i SOX2 pregled izraz inhibirana ndrg1a pregled MO (Sl. 9A, B). Nadalje, Pdx1 je mogao spasiti Atf3 ekspresiju ili Ndrg1a obaranje fenotip s obzirom na ptf1a pregled / P48 pregled, PDIP pregled, foxa1 pregled, i SOX2 pregled izraz osim za inzulin pregled (Sl. 9A, B). Poznato je da se Pdx1 je potrebno, niti dovoljno za aktiviranje ranog inzulin pregled ekspresija u Xenopus pregled embrija [44]. Sve u svemu, naši podaci upućuju na epistaza da RA aktivira Ndrg1a potiskuje Wnt /β-katenina signalizaciju i time oslobađa suzbijanje aktivnosti Wnt /beta-katenina signalne aktivnosti koje mogu biti djelomično posredovano sa Atf3, na gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesnika formiranje. pregled
Studiju sudbina mapiranje vitalni bojenje temeljen je pokazalo da archenteron krov endoderm stanice kasnije dovesti do dorzalne gušteraču , jednjaka, želuca i dvanaesnika [5]. Shirin pregled izgleda da se izražava u Xenopus
archenteron krova endoderm, ali u međuvremenu je također izražena u mesoderm i ektoderm [63]. fetuinish pregled posebno se obilježava archenteron krov endoderm u Xenopus pregled ranog neurulae, ali se kasnije prikazuje ekspresiju u jetri i crijevu bez izražavanja u gušterači, jednjaka, želuca i dvanaesnika [35]. Samo ndrg1a pregled pokazuje dosljednu izraz rano archenteron krova endoderm, a kasnije u gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesnika. Mi nagađaju da ndrg1a pregled može poslužiti kao specifičan leđne gušterače, jednjaka, želuca i dvanaesterac prekursor markera gena u Xenopus Netlogu koji tek treba verificirati genetskih loza praćenje studija. Pregled
archenteron stanica krov endoderm i posreduje RA signalizaciju pozitivno uzorak endoderm stanica u gušterači, jednjaka, želuca i dvanaesnika , Oba MO temelji obaranje ndrg1a pregled i talen posredovani poremećaj ndrg1a pregled pokaže da je Ndrg1a aktivnost u Xenopus pregled endoderm patterning je neophodno, što nije zabilježeno je u Ndrg1 pregled knockout miševa [32], [33], [34]. Jedno od objašnjenja za ovaj raskorak je da je bitna uloga Ndrg1a u Xenopus pregled endodermal strukturiranja nije sačuvana u sisavaca. Alternativno, bez oštećenja endodermal organa iskazane u miša Ndrg1 pregled cilja gen studija može biti zbog curi izražavanja NDRG1 u Ndrg1 pregled deficijentnih miševa [32], [33] ili zbog funkcionalnog redundancije među članovi NDRG obitelji 1-4 u miševa. pregled
MO fenotip s ovom krnje verzije Ndrg1a bilo. Na kraju, jaka endodermal izraz ndrg1a pregled je prikazano u našem istraživanju i opisao Costa i sur. [35] nije otkriven u toj studiji [36]. Pregled