PLoS One: Normál fibroblasztok Váltsa E-Cadherint Loss és növelése nyirokcsomó-metasztázis Gyomor Cancer

absztrakt katalógusa

Háttér katalógusa

A tumor tartják heterogén komplex háromdimenziós környezetben, amely öblítsük kórélettani és biomechanikai jeleket. Cell-stroma interakciók irányítsák a fejlődés és a termelés a daganatok. Itt értékeljük a járulékok normális fibroblasztok gyomorrák. Katalógusa

Módszertan /fő eredményei katalógusa

coculturing normális fibroblasztok egyrétegű BGC-823 gyomorrák sejtek, tumorsejtek szórványosan kifejlesztett rövid, orsó -mint morfológiai és mutatták, hogy megnövekedett proliferációs és inváziós potenciált. Továbbá, a transzformált tumorsejtek bizonyította csökkentette a tumor kialakulása és fokozott lymphomatic és bélrendszeri metasztatikus potenciálját. Nem-transzformált BGC-823 sejtekben, ezzel szemben kimutatták primer tumor kialakulása és késleltetett bél és a nyirokcsomó invázió. Azt is megfigyelték, E-cadherin veszteség és a túlszabályzását vimentint kifejezés a transzformált daganatsejtek, amely azt sugallta, hogy a megnövekedett metasztázis váltottuk ki epithelialis-mesenchymalis to-átmenet. Katalógusa

Következtetés katalógusa

Együttesen adataink azt mutatták, hogy a normális fibroblasztok kellően indukálják epithelialis- a mesenchymalis átalakulás a rákos sejtekben, ami viszont áttét. katalógusa

Citation: Xu W, Hu X, Chen Z, Zheng X. Zhang C, Wang G, et al. (2014) Normál Fibroblasztok Váltsa E-Cadherint Loss és növelése nyirokcsomó-metasztázis gyomorrákban. PLoS ONE 9 (5): e97306. doi: 10,1371 /journal.pone.0097306 katalógusa

Szerkesztő: Elad Katz, AMS Biotechnology, Egyesült Királyság katalógusa

Beérkezett: december 10, 2013; Elfogadva: 16. április 2014; Megjelent: május 20, 2014 katalógusa

Copyright: © 2014 Xu et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: A kutatás ben támogatták a Nemzeti egészségügyi Key Special Fund (http://program.most.gov.cn; No.200802112), a Nemzeti Tudományos Alap Bizottsága (http://www.nsfc.gov.cn; általános számú projekt .81372302 No.81272120), az egészségügyi Minisztérium Alap (http://program.most.gov.cn; No.2007A093), a Key Project Zhejiang tartomány (http://www.zjkjt.gov.cn; No. 2013C030445 2009C030125). A Természettudományi Alap Zhejiang tartomány (http://www.zjnsf.gov.cn; No.Y2080001, Y12H160121 és Z2080514), valamint a hagyományos kínai orvoslás Iroda Alap (http://wst.zj.gov.cn; No.2007ZA019). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

áttétek felelős akár 90% a rákhoz kapcsolódó mortalitás. Sok beteg, akik bizonyítani nincs bizonyíték áttét a kezdeti diagnózis végül fejleszteni áttét. Bár áttétek okozzák a legtöbb rákos halálozás, ez a folyamat továbbra is az egyik legrejtélyesebb szempontból a betegség. Katalógusa

Az áttételes tumorsejtek adja szövet keresztül kiáramlást. A szövet azonban megy keresztül, világos, eljárások, amelyek révén a sejteket ágyazott a szöveti mátrix és kerülnek közvetlen érintkezésbe stromális sejtek, amelyek többsége normális fibroblasztok. Tumorsejtek minden esélye, hogy érintkezzenek stromális sejtek, beleértve a neoplasztikus és metasztázisos sejtek [1]. Ez vezet a kölcsönös áthallás normál fibroblasztok a szövetben. Katalógusa

A fibroblasztok a legnagyobb mennyiségben kötőszöveti sejteket, és serkentik a mikrokörnyezet és szolgálhat a gazdag forrása a parakrin úton alatt tumorigenezis és progresszióját. A hatások a normális fibroblasztok tumorsejteken vitatják. Leírták, hogy a normális fibroblasztok elnyomják a rosszindulatú átalakulását immortalizált prosztata epithelium [2], mivel emlő tumorok, a fibroblasztok transzformációs ductalis carcinoma invazív karcinóma [3].

Ez nem értenek egyet azt jelzi, hogy a befolyása a fibroblasztok tumorsejteken más, mint a CAF-ek (rák társított fibroblasztok). Ehhez a vizsgálathoz mi együtt tenyésztjük tumorsejtek normál fibroblasztok Petri-csészékben annak érdekében, hogy utánozza hogyan tumorsejtek kapcsolatba fibroblasztokban. Mi középpontjában a hozzájárulás normális fibroblasztok gyomorrák. Mi tenyésztettük a szokásos fibroblasztok alkotnak sűrű egyrétegű, amelyeket ezt követően terjesztett tumorsejtekkel annak érdekében, hogy utánozza a metasztatikus tumorsejtek. Feltételeztük, hogy a magas aránya fibroblasztok tumorsejtek meglehet utánozzák a szövetekben, ahol áttétes daganatos sejtek laknak. Így dermális fibroblasztok egészséges egyének voltak előállításához használt celluláris környezetet. A gyomorrák sejtvonal BGC-823-t használtuk itt, mert ez morfológiailag eltér fibroblasztok. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Etikai nyilatkozat katalógusa

Primer humán dermális szöveteket szereztünk gyermekek átesett körülmetélés megszerzését követően írásos beleegyezést gondozóik, amely bekerült a orvosi feljegyzések. Ezt a kísérletet felül és hagyja jóvá az intézményi felülvizsgálati tanács a második Affiliated Kórház Zhejiang University School of Medicine (etikai felülvizsgálati kód: Kutatás 2013-047). A betegek ebben a vizsgálatban kaptak egy példányt írásos beleegyezési és megadta az engedélyt, hogy közzéteszi. Katalógusa

A kísérleteket végeztek az iránymutatás szerint a Care és a laboratóriumi állatok felhasználását a Tanács Tudományos és Technológiai Kína. A vizsgálati protokollt jóváhagyta az Animal Care and Use Committee Zhejiang Egyetem. Katalógusa

Reagensek és antitestek katalógusa

A penicillin G /streptomycin, foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBS), Triton X-100, szarvasmarha szérumalbumin, kollagenáz I típusú, és a tripszin vásárolt JiNuo (Kína). Nagy glükóz DMEM kapunk Gibco (Kína), és magzati borjúszérumot (FBS) vásároltunk a Gibco (SA). Ciszplatin, 5-fluor-uracil, puromicin, és I. típusú kollagén a Sigma (USA). A ciszplatint feloldunk dimetil-formamidban (DMF), az 5-fluor-uracil DMSO, és puromicin, PBS-ben annak érdekében, hogy törzsoldatokat hogy ezután -20 ° C-on. I. típusú kollagén (5 mg /ml) hígítjuk, hogy 1 mg /ml. DAPI-t (4,6-diamino-2-fenil-HCI) PBS-ben nyert Roche, és kecske anti-egér és nyúl IgG szekunder antitest-TIRTC, és másodlagos ellenanyagokat nyertünk ZSGB-Bio (Kína). Antihumán-E-cadherin nyúl (ab40772), antihumán-vimentin nyúl (ab92547) és antihumán-β-catenin nyúl antitesteket (ab9274) kaptuk ABCAM (UK). Antihumán-Pan-CK-egér antitesttel (C11) és az N-kadherin nyúl antitest (C4061) kaptuk a Cell Signaling Technology (Kína), és anti humán β-aktin és a másodlagos kecske anti-nyúl antitestet nyertünk Boster (Kína) . Antitesteket, majd 5% FBS dolgozó koncentrációban, azt külön jelezzük. Katalógusa

Cell Culture katalógusa

A létrehozott sejtvonal humán gyomorrák BGC-823 használt sejtek a kísérletben vásárolt a sejtbank Guangzhou Intézet biomedicina és egészség. A sejteket felolvasztottuk, és passzáltuk 4-5-szer, majd alkalmaztuk a társ-tenyésztési kísérleteket. Elsődleges dermális fibroblasztok kapott műtéti mintából származó gyermekek, akik elvégezték ezt a műveletet, és informált beleegyezést. Fibroblasztokat után használható a harmadik járaton (belül 50 passzázs), tenyésztettük magas glükóz tartalmú DMEM 10% FBS-t, és karbantartani, párásított inkubátorban (5% CO _{2) 37 ° C-on. A sejt tápközeget helyettesítettük minden második nap.}

a generáció a TBGCs a fibroblasztok (FBS) és BGC-823 sejteket együtt tenyésztjük egy arány 10:01 további 10 nap után a tenyésztett sejtek összeértek. Dome képződés volt megfigyelhető a társ-tenyésztési rendszer. A sejt elegyet ezután passzáltuk tripszinezéssel friss fibroblasztok (1 × 10 ^{6 sejt /ml). A második és az azt követő szakaszokat, látszólagos doom formáció és a felfüggesztett kör alakú sejtek jelentek meg, amelyek kiállított változatos morfológiai jellemzői és hosszan kötődés után folyosón. Miután az ötödik folyosón a vegyes szuszpendált sejtek és sűrű normális fibroblasztok, egységes, rövid, orsó alakú sejtek úgynevezett "TBGCs" állítottak elő, és nem bizonyította, morfológiai visszatérés BGC-823 sejtekben, míg > 10-15 részeket. Katalógusa}

Proliferation Assay

az exponenciálisan növekedő sejteket szélesztettünk 96 mérőhelyes lemezeken további 6 napig inkubáltuk 37 ° C-on, nedvesített, 5% CO _{2 atmoszférában. A sejtproliferációt mértük quintuplicate minden nap pipettázással 20 jil CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent (Promega, USA) az egyes lyukakba, hogy tartalmazott 100 ul magas glükóz DMEM, majd a sejteket inkubáljuk további 2 órán meghatározása előtt a relatív abszorbancia 490 nm-en egy mikrotitráló lemez leolvasó.}

Drug gátlásának vizsgálata

Öt ismétlődése exponenciálisan növekvő sejteket szélesztettünk 96 mérőhelyes lemezeken, és 24 órán keresztül inkubáltuk. 24 óra elteltével a tápközeget helyettesítettük különböző koncentrációjú gyógyszerek (0-80 uM) és a tenyésztést további 24 órán át. Kábítószer-toxicitást értékeltük mérésével az életképes sejtek számát a proliferációs vizsgálati eljárás fent leírt módon.

Vakarózás Assay

sejtet oltunk 24 mérőhelyes lemezekre (5 × 10 ^{4 sejt /is) és kulturált a torkolat. Pipettavégeket előállításánál használt karcolásoktól. PBS-t használjuk, hogy a sejttörmeléket eltávolítsuk, majd helyettesítjük FBS-mentes közegben. Kép kaptuk 3 egymást követő napon. A szélessége a semmiből mértük ImageJ 1.47 szoftver Windows (http://rsb.info.nih.gov/ij/) és ábrázoljuk a semmiből távolságot naponta. Katalógusa}

migrációs és behatolás vizsgálat

sejtmozgás assaying végeztük transwell-betétek (8 jim pórusméretű) (Corning, USA). A sejteket-GFP (zöld fluoreszcens fehérje) (1 × 10 ^{5/500 | il) szuszpendálunk FBS-mentes tápközeggel, és felett elhelyezett betétek három példányban, és 800 ul táptalajt betöltve alatta. Miután egy éjszakán keresztül inkubáljuk, a lapkák mostuk 3 × PBS-sel, és letöröljük nedvesített tamponnal fenti ahol fixáltuk 4% PFA alatt és a megfigyelt fluoreszcens mikroszkóp (Olympus, Japán). Ugyanezt az eljárást alkalmaztuk, hogy hajtsa végre a inváziós vizsgálati eljárás, de betétek, amelyek arra előzetesen bevont Matrigel (BD, USA) használtunk. Mindkét vizsgálatot mennyiségileg, mint a sejtek száma megszámolt 5 véletlen mezőt (200 × nagyítás).}

Az apoptózis assay

Az apoptotikus sejteket mértük az Annexin V-FITC apoptózis detektáló kit (Keygen, Kína), a gyártó utasításai szerint. A sejteket vagy kezeletlenül vagy gyógyszerrel kezelhető 24 órán át, majd a betakarított, kétszer mossuk PBS-sel, reszuszpendáltuk kötőpufferben tartalmazó 5 ul FITC-Annexin V és 5 pl PE, és szobahőmérsékleten inkubáltuk 30 percig. Analízist áramlási citometriával (FACSCalibur, Becton Dickinson, USA).

kvantitatív valós idejű PCR-

Nukleáris extraktumokat készítettünk az RNeasy mini-kit alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Tisztított RNS-mintákat (1 ng) DEPC vizet reverz transzkripció révén PrimeScript II 1. Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Kína). RT-PCR és amplifikáció alkalmazásával hajtottuk végre a SYBR Premix Ex Taq II készlet (Takara).

A 20 ul reakció-rendszer, amely 1 ul hígított cDNS mintákat 10 ul SYBR Premix Ex Taq II (2 ×), 0,4 ni ROX Referencia festéket (50 ×), 7 ul steril kétszer desztillált H _{2O, és 1 ul forward és reverz primerek (lásd anyagok és módszerek S1) állítottunk elő és értékeltük olvadási görbe analízisen, valamint az összehasonlító küszöb ciklus (Ct) módszer. A következő kerékpározás körülményeket alkalmaztuk: 95 ° C-on 10 percig, majd 40 ciklus 95 ° C-on 15 másodperc, és 58 ° C 1 percig. GAPDH használtuk a kontroll gén.}

Western-blot analízis

A fehérjéket extraháljuk exponenciálisan növekvő sejtek és primer szövetekben. Az extraktumokat forraljuk loading pufferben oldani 10% -os Tris-HCl SDS-poliakrilamid gélen, és nitrocellulóz membránokra visszük át (Millipore, USA) a szokásos módszerek alkalmazásával. A membránokat blokkoltuk 5% zsírmentes tej Tris-pufferolt sóoldattal Tween-20 (TBST) 30 percig, szobahőmérsékleten. A membránokat mostuk TBST-vel, és egy éjszakán át inkubáljuk 4 ° C hőmérsékleten a primer antitestekkel elleni E-cadherin (1:5000), vimentin (1:5000), β-catenin (1:5000), N-kadherin (1:1000), és β-aktin (1:1000). A mosás után a 3 × TBST-vel, a másodlagos kecske anti-nyúl (1:1000) adtunk hozzá, és 2 órán át inkubáltuk szobahőmérsékleten. Végül immunkomplex tettük láthatóvá kemilumineszcenciás ECL (Electro Chemical lumineszcencia) (Millipore). A fehérje-koncentrációt normalizáltuk p-aktin.

Szövettani és immunhisztokémiai elemzések

A mintákat gyorsan lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, -80 ° C-on, fix 4% PFA, és szekcionált hogy vastagsága 10 jim (LEICA, Németország).

hematoxilin-eozin (HE) festés, a paraffint metszeteket megfestettük hematoxilin 15 percig, mostuk 3 x PBS-sel, a sav-alkohol 5 másodpercig, majd eozin 5 percig (Boster, Kína).

immunhisztokémiai festésre, a lemezeket rehidratált és hővel indukált epitóp visszakeresés végeztük citrát pufferben alkalmazásával kukta (20 percig 80 pKA), blokkoltuk 3 % H _{2 O 2 15 percig, majd a normál kecske szérummal alkalmaztunk (30 perc, szobahőmérséklet). Metszeteket a következő primer antitesteket: anti-E-cadherin (1:250), anti-vimentin (1:250), anti-β-catenin (1:250), és anti-pan-CK (1:250 ). A mintákat egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on, kétszer öblítjük PBS-sel, és inkubáljuk a szekunder antitesttel 2 órán át 37 ° C-on. DAB Plus Kromogén kit (Boster) volt kimutatására használt összes antigénre. A metszeteket hematoxilinnel ellenfestettük, dehidratált, és szerelt fedőlemezek segítségével semleges balatára. Mindkét elemzés külön-külön végzett patológusok és a klinikusok, akik vakok a minta csoportok. Viták megoldódott konszenzussal. Katalógusa}

Immunfluoreszcenciás és konfokális mikroszkópia katalógusa

A sejteket rá kamra lemezek, és a fagyasztott metszeteket fixáltuk 4% PFA és permeabilizált 0,5% Triton X-100. A lemezeket blokkoltuk normál kecske szérummal, 1 órán át 37 ° C-on, öblítettük és éjszakán át inkubáltuk primer antitestekkel 4 ° C hőmérsékleten, majd át és inkubáltuk kecske anti-egér és anti-nyúl-TIRTC antitestekkel 1 órán át 37 ° C-on sötétben. Diák mostuk segítségével glicerin és szerelt kenjük. A sejtmagokat ellenfestjük DAPI. Fluoreszcencia detektáltuk konfokális lézer pásztázó mikroszkóp (Olympus). A paraffint fagyasztott metszetek festettünk DAPI és analizáltuk immunfluoreszcens mikroszkóppal. Katalógusa

Animal Model katalógusa

Nyolcvan négy hetes nőstény BALB /c egereket szereztünk az Animal Research Center Shanghai és fenntartani a kísérleti állatok közepén a Zhejiang Orvostudományi Akadémia Science. Az iránymutatás szerint a Care és a laboratóriumi állatok felhasználását a Tanács Tudományos és Technológiai Kína, mind állatokat aszeptikus körülmények között steril és adjuk autoklávban élelmiszer és a víz megfelel a Principles of Laboratory Animal Care Zhejiang Egyetem. Negyvennégy egereket használtunk a szubkután modellben és osztották szét egyenletesen kontroll és a kísérleti csoportban. A BGC-GFPs használtuk kontrollként, ahol a TBGC-GFPs voltak felhasználásra szánnak, mint a kísérletet. A tumor sejteket összegyűjtöttük a szaporodási fázisban, és szuszpendáljuk FBS-mentes tápközegben (1 × 10 ^{6 sejt /ml). A sejteket pipettáztunk egysejtű szuszpenziókat, és minden egyes 500 | il oldatot szubkután oltottuk mindkét oldalán a mellkas. Az egereket elaltattuk 2 hetente évig 10 hetes, és patológiai vizsgálatokat végeztünk. Minden az egereket lemértük 3 naponta. Minden műtét alatt végeztük 1% -os nátrium-pentobarbitállal, és minden erőfeszítést tettek arra, hogy minimálisra csökkentsék a szenvedést. Katalógusa}

Harminchat egereket használtunk vénába injekciós csoport értékelésére rák forgalmazás (18 egerek BGC-GFP kontrollcsoport és 18 egerek TBGC-GFP kísérleti csoportban). 500 ul sejt-szuszpenziót (5 x 10 ^{5 sejt) injektáltunk a farokvénába nude egerekben. Az egereket leöltük 2 II, 5 th, 8 -én és 10 hetében patológiai vizsgálatra. Katalógusa}

Statisztikai elemzés katalógusa

A kísérleti adatokat gyűjtöttünk és belépett a táblázatok. A normalitás vizsgálatot végeztünk, mielőtt összehasonlítása az adatokat. Az összehasonlítást a két csoport között végeztük Student t katalógusa teszt. Egyutas varianciaanalízist alkalmaztunk összeh > 3 csoport, és Tukey-féle módszert alkalmaztuk post hoc
összehasonlításokat csoportok. Ebben a vizsgálatban, A p
< 0,05 tekintjük statisztikailag szignifikánsnak. SPSS 20.0 for Windows (IBM SPSS Statistics, http://www-01.ibm.com/support/docview.wss?uid=swg24029274) használtunk, hogy végre minden statisztikai elemzések. R (ggplot2) (http://www.r-project.org/; http://www.r-project.org/) alkalmaztunk továbbá minden grafikus megjelenítései. Katalógusa

Eredmények katalógusa

1. Morfológiai változások a BGC-823 sejteket utánozzák stromális sejtek

fibroblaszt (FBS) és BGC-823 sejteket együtt tenyésztjük egy arány 10:01 további 10 napon belül a tenyésztett sejtek összeértek. A sejt elegyet ezután passzáltuk tripszinezéssel friss fibroblasztok (1 × 10 ^{6 sejt /ml) (1.1 ábra). Dome kialakulását a BGC-823 sejtekben volt megfigyelhető az első járatba. A második és az azt követő szakaszokat, felfüggesztett kör alakú sejtek jelentek meg a tenyésztett rendszer: néhány összevonva fürtök vagy csomók és lazán kapcsolódik a felszínre a fibroblasztok. A párhuzamos tenyésztett BGC-823 sejtekben kimutatták csak néhány kör alakú sejtek tövében, amikor a kultúra lett zsúfolt. A vegyes szuszpendált sejteket mutatott változatos morfológiai jellemzői és hosszan tartó kötődés után folyosón. Ezek a sejtek bizonyították, egy cobblestone-szerű megjelenése hasonlít a BGC-823 sejtek vagy rövid orsó-szerű funkciókat. Egységes, rövid, orsó alakú sejtek által termelt folyosón a vegyes szuszpendált sejtek és sűrű normális fibroblasztok. Ezzel szemben áthaladását felülúszójának a BGC-823 sejtek csak igazolták törmeléket 24 óra elteltével a termesztés, amelyben a kis mennyiségű sejtekből túlélte alkotnak cobblestone-szerű klónok hasonló szülői BGC-823 sejtek (ábra 1.3A-H).}

Későbbi kísérleteket végeztünk annak megállapítására, a forrás a szuszpendált sejteket a együtt tenyésztett rendszerben. BGC-823 sejtek és fibroblasztok transzfektáltunk GFP-Puro kazettát és RFP-Puro kazetta, illetve és elemzi BGC-GFP és FB-RFP, ill. Miután coculturing, BGC-GFP nőtte többrétegű és egy kupola-szerű szerkezet. Eközben a kör alakú vagy gömb alakú sejtek felfüggesztették a médiában átkerült kultúra lemezek és jelölt zöld fluoreszcens, amelyek igazolják, hogy a hosszú távú coculturing a fibroblasztok indukál BGC átalakulás. Kerek és szferoid sejtek szuszpendálunk a közegben is megfigyeltek segítségével zöld fluoreszcencia és lehetne passzáltuk hozzáadása nélkül fibroblasztok (ábra 1.2A-D). Miután több egymást követő fordulóban coculturing transzformált BGC-823 sejteket (TBGCs) kaptuk, hogy megjelent egységesebb, rövid, és az orsó-szerű. Ezeket a sejteket azután passzáltuk hozzáadása nélkül fibroblasztokban. Érdekes, hogy ezek a sejtek hajlamosak alkotnak gömb struktúrákat, mint a sejtek, hogy nőtt során összeértek, és nem bizonyította morfológiai visszatérés BGC-823 sejtekben, míg > 10-15 részeket. Katalógusa

Egy korábbi tanulmány számolt be, hogy a fibroblasztok gátolják a növekedés a más sejtek, amikor együtt tenyésztjük in vitro
mechanizmusa által kontakt gátlás [4]. Kísérleteinkben azonban normális fibroblasztok nem kapcsolatot-gátolják a BGC-823 sejtekben. Ehelyett FB-RFP fokozatosan pusztult BGC-GFP proliferációt tenyésztést 10 nap. Ezért egymást FB-pótlás szükséges átjáró és fenntartani a stabil termelés TBGCs. Azt is megfigyeltük, hogy ha kis mennyiségű TBGCs adtunk a összefolyó fibroblaszt lapot, a tumorsejtek, hogy nőtt kívül szorultak el a fibroblasztok. A központban a daganat kolónia, a sejteket kör alakú, csak lazán csatolt, hogy az alap (ábra 1.3A-H). Katalógusa

2. A hámsejtek mesenchymalis Átmenet BGC-823 cella TBGC katalógusa

Real-time PCR-t használják, hogy elemezzék mRNS expresszió. Az eredmények azt mutatják, hogy az E-cadherin expresszió figyelemreméltóan downregulált együtt fokozza a vimentin a TBGCs. Eközben a megnyilvánulásai csavar, csiga, csiga, és N-cadherin mind serkentett (1.5 ábra). Immunfluoreszcens festéssel és Western-blot-meg E-cadherin veszteség és a megnövekedett expressziója a vimentin, N-kadherin, és β-catenin (1.4 ábra), megerősítve ezzel, hogy a hosszú távú epithelialis-mesenchymalis átmenet (EMT) jelentkezik TBGCs. E-cadherin bizonyított fémjelzi EMT és fenntartja a sejt-sejt kötődés a hám. E-cadherin veszteség vezethet a tumor vedlés több sejt ki a tumor tömege. Katalógusa

3. Proliferáció, invázió, és mobilitása TBGCs katalógusa

TBGC elterjedése elemeztük az MTS-vizsgálat. TBGCs bizonyította gyorsított proliferációs ráta ( p katalógusa < 0,01) (2.1 ábra). Áramlási citometria (lásd Anyagok és Módszerek S1) azt mutatja, hogy 13% -a TBGCs megmaradtak az S fázisban, szemben a csak 7% -a BGC-823 sejtek (ábra S1.3). A karcolás vizsgálat azt mutatja, hogy TBGC motilitás képest emelkedett apai BGC-823 sejtek (ábra 2.2-2.3A-H). TBGC anastomosis szükséges 3 nappal megkezdése után a karcolásoktól, míg > 4 napra volt szükség a BGC-823 sejteket ( p katalógusa < 0,05) (2.2 ábra). Katalógusa

Az eredmények a Matrigel inváziós vizsgálatból azt mutatják, hogy TBGCs sokkal agresszívabb, mint a BGC-823 sejtekben. Összesen 683,67 ± 170,83 TBGCs beszivárgott a Matrigel képest 188,33 ± 58,62 BGC-823 sejtek a kontroll csoportban ( p
< 0,01) (2.4 ábra, ábra 2.5A, B). Azonban TBGCs bizonyította jelentős csökkenését migrált sejtek: 2-szeres nél kisebb BGC-823 sejtek szerint a Transwell migrációs assay ( p
< 0,01) (2.4 ábra, ábra 2.5C, D). A felfüggesztett jellege TBGCs tudható be ez a csökkenés a tapadást arány csupán 68,33 ± 10,41% -ban TBGCs Matrigelen míg 99,77% ± 6,25% volt BGC-823 sejtekben kimutatták lassú ragaszkodás a Matrigel felület TBGCs (táblázat S1) .

Ahhoz, hogy jobban utánozzák in vivo tumor katalógusa viselkedés, I. típusú kollagén gélt használtunk, hogy meggyőződjenek a kapcsolatát a fibroblasztok és a invazív kapacitásait BGC-823 sejtek és TBGCs. I. típusú kollagén gélt készítünk a transwell lapkák fibroblasztok (lásd Anyagok és Módszerek S1). Fibroblaszt-terhelt gélek tenyésztettünk 7 napig, majd a GFP-jelölt rákos sejtet oltunk a gélről, és tenyésztjük a következő 7 napon. Ellenőrzés a betakarított gélek feltárta, hogy a tumorsejtek már behatolt a kollagén gélek. Amikor a géleket megrakott fibroblasztok, TBGCs kiállított fokozottabb invazív képességét mint BGC-823 sejtekben, amint azt a cellák száma, hogy beszivárgott a gélek (ábra S1.2).

4. TBGCs Kiállítva Cisplatin Resistance

Ezután megvizsgáltuk az érzékenységét TBGCs standard gyomorrák kemoterápiás. Életképes BGC-823 sejteket és a TBGCs után meghatároztuk a 24 órás expozíció ciszplatin (0, 20, 40, 60, 80 uM) beépülésének mérésével MTS. Az eredmények azt mutatják, hogy a TBGCs mutatott figyelemre méltó ellenállás a ciszplatin, mivel kevés BGC-823 sejtek túlélték, amikor a ciszplatin koncentrációja emelkedett volt, hogy 40 jim ( p
< 0,001) (3.1 ábra). Életképes TBGCs is lehetett kimutatni, amikor a ciszplatin koncentrációja emelkedett volt akár 200 uM (az adatokat nem mutatjuk be). Végeztünk sejt apoptózis vizsgálata áramlási citometriával érvényesítéséhez ciszplatin ellenállás. Az eredmények azt mutatják, hogy a túlélési arány a TBGCs körülbelül 42,40%, szemben a 13,80% -os BGC-823 sejtek kezelést követően 40 jiM cisplatinnal 24 órán át (ábra 3,3-3,4). Azonban, ha kezeljük az 5-FU, nem volt szignifikáns különbség a tumor gátlás között TBGCs és BGC-823 sejtek szerint a MTS-vizsgálat (3.2 ábra). Mindkét tumorsejtek bizonyította kemorezisztenciájának az 5-FU (3.2 ábra). Katalógusa

5. TBGCs kiállítás In vivo katalógusa nyirokcsomó Hajlandóság katalógusa

Az egyes in vivo katalógusa forgalmazása TBGCs, 5 × 10 ^{5 BGC-823 sejteket vagy TBGCs fecskendeztünk farokvénájába BALB /c egerekben. Két héttel az injekció beadása után, variancia kisérő és nyaki nyirokcsomók metasztázis volt megfigyelhető mindkét csoportban, amint azt értékelését fluoreszcens nyomjelző (Figure 4.3a-F). GFP-pozitív sejteket találtak a kisegítő és lágyéki nyirokcsomó mindkét csoportban (ábra 4.3a, B, D, E). Azonban GFP-pozitív sejteket csak megjelent a tüdőben az egerek a BGC csoportban (ábra 4.3C, F).}

az 5. héten, amellett, hogy kiterjedt invázió a nyirokcsomók, a szervi infiltráció is megfigyelt. Több nyirokcsomó invázió volt megfigyelhető a TBGC csoportban, mint a BGC kontroll csoport minden egyes időpontban (4.1 ábra, videó S1). Ezek a nyirokcsomók elhatározták, hogy a pán-CK pozitív (ábra S2.1). Azt is megfigyelték, különböző TBGC és BGC eloszlása ​​a szervekben. TBGCs korlátozódtak a gyomor- szöveteket, mivel BGCs telepedett le a tüdő és a belek (ábra 4.2A-H). Az 5. héten, bél metasztázis először figyelték meg a 3/4 egereket injektált TBGCs, míg csupán 25% egerek látható bél áttétek következő BGC injekció (ábra S2.3). Katalógusa

Mivel a tumor fejlődött, átlagos számát bél TBGC áttétek növekedett (5,6 ± 3,911 vs katalógusa 3,5 ± 1,914 BGCs 8. héten 6,33 ± 1,52 vs katalógusa 5,6 ± 1,342 10. héten) (ábra S4.2) . Érdekes, 3 5-egerek TBGC csoport megmutatta megaszkopikus neoplazmák a gastrum 10 hét után, amely nem volt megfigyelhető a BGC csoport. Megaszkopikus tüdőáttétes találtak 3 4 BGC egerek 8. héten azonban nem látható TBGC tüdőáttétes figyelték meg a 10. héten (ábra 4.2A-H). Mikroszkópos vizsgálat feltárta a beszivárgása TBGCs a nyaki és a hónalji nyirokcsomók már 1 hét után injekció farokvénába való beadása, mivel BGCs szükséges több időt (3 hét), hogy adja meg ezeket nyirokcsomókat (4.1 ábra). Öt héttel a sejtek befecskendezése után, tüdő infiltráció volt megfigyelhető a BGC csoport. Azonban nem TBGCs mutattunk szervek 10-ig héttel az injekció beadása után (ábra 4.2b, F, ábra S2.3). Katalógusa

Az immunhisztokémiai jelezte fokozatos növekedése az E-cadherin a nyirokcsomókban a TBGC csoport , míg az E-cadherin kismértékben csökkent a BGC csoport ( p katalógusa < 0,01) (ábra 4.4A-P). Különbségek voltak szignifikánsak 8 és 10 hét múlva, amikor az E-cadherin sokkal magasabb volt a TBGC csoportban, mint a BGC csoport (4.5 ábra). A kifejezés a β-catenin is nőtt az időben a TBGC csoport, amely tetőzött 8 hétig, majd enyhén csökkent (4.5 ábra). Az eredmények azt is mutatják, megnövekedett β-catenin expresszió a TBGC csoport 5, 8, és 10 hét ( p
< 0,01) (4.5 ábra).

6. TBGCs bizonyítottan kis tumor kialakulását, de a magas nyirokcsomó-metasztázist Kapacitás mi Szubkután tumorigenezisben Model

Mivel a tumorsejtek nagyobb valószínűséggel képez neoplazmák, amikor szubkután implantált, (GFP +) TBGCs és az BGCs ültettünk injektálunk 5 × 10 ^{5 életképes tumorsejtek a bőr alatti szövetekben mindkét oldalán a mellkas. Nascent tumorok a BGC csoport detektáltuk már 3 nappal post-implantációs, és minden egér a BGC csoport fejlődtek ki tumorok a helyszínek implantáció után 1 hetes inkubálás (ábra 5.1A). Szembetűnő, hogy a beültetett TBGCs nem hozott kimutathatatlan daganatok, amíg 8 hét (5.1 ábra, videó S2). Fokozódó a TBGC adag 5-10 × 10 6 beültetett sejtek csak kialakulásához vezetett a kis daganat csomók és a lomha dúsítás tumor térfogat mellett lappangási idő után. Ezen túlmenően, egereknél a BGC csoport súlyos állapotba került, nyilvánvalóan azért, mert a megnövekedett tumor teher (az adatokat nem mutatjuk be).}

A teljes-test boncolás minden egyes időintervallumban mutatják, hogy TBGCs helyett látható primer tumorok, beszivárgott a szomszédos és disztális nyirokcsomók, míg BGC generált tumoros korlátozódott ép fibrotikus kapszulákat az injekció beadásának helyén (video S2). A regionális globális nyirokcsomók metasztázisok a TBGC csoport találtak már 2 héttel a beültetés után, mivel a regionális nyirokcsomók metasztázisok detektáltuk 4 hétig a BGC csoportban (5.2 ábra). Kaplan-Meier analízis azt mutatja, hogy a TBGCs bizonyította kialakulásának nagyobb a kockázata a nyirokcsomó-metasztázis mint BGCs (5.2 ábra). Katalógusa

A kiterjedt bél áttétek is nyilvánvaló, mind egerek TBGC csoport 8. héten és ezt követően (ábra S4.1 ábra S4.4). Az átlagos száma bél csomók volt 5,50 ± 1,73 a 8. héten, és 7,33 ± 1,79 10. hétre Ezzel szemben csak 1 egér a BGC csoport megmutatta 3 bél beszivárgása a 9. héten (ábra S4.1). Katalógusa

GFP nyomkövetés jelzi a helyi daganatképződésnek BGC csoportban az injekció helyén, anélkül nyirokcsomó beszivárgását. Ezzel szemben, a TBGCs megjelent a hónalji nyirokcsomók, de a zöld fluoreszcencia nem volt kimutatható a szövetekben az injekció beadásának helyén (5.3 ábra). A 6. héten, TBGCs-GFP halmozódott fel a végbél és a mesenterialis nyirokcsomók. Azonban csak 1 egér pozitív mezenteriális nyirokcsomó-metasztázist detektáltunk, a BGC csoport. pán-CK immunhisztokémiai festéssel jelzi, hogy TBGCs áttéteket regionális (korai) és disztális nyirokcsomók (késői), míg BGCs csak áttéteket regionális nyirokcsomók (késői) a kísérleti időszakban (ábra S4.5). TBGCs is áttéteket a belek egy héten, amikor nem volt található a BGC csoport.

HE festés azt bizonyítja, hogy az abnormális sejtek megjelent a regionális nyirokcsomók a korai szakaszban a TBGC csoport és késői szakaszaiban BGC csoport (ábra S4.6). Az immunhisztokémiai fehérje expressziós analízis 2 héttel mutatja downregulációját E-cadherin és β-catenin és fokozott vimentinre kifejezést TGBC-nyirokcsomókban képest BGC-daganat. Ezek az eredmények tovább erősítette Western-blot analízis a szövetminták, amely nem érzékeli az E-cadherin in TGBC-LN-ek; Eközben N-cadherin is élesen downregulált a TGBC-LN (ábra S3.3-3.4). katalógusa

Az immunhisztokémiai jelzi fokozatos növekedése az E-cadherin a nyirokcsomókban a TBGC csoport az idő előrehaladtával, mivel a kifejezés az E-cadherin kismértékben csökkent a BGC csoport ( p katalógusa < 0,01) (5.4 ábra).

• PLoS One: Prohibitin Expression deregulációja gyomorrákban nem társult a 3 'le nem fordított terület 1630 C > T polimorfizmusa és kópiaszám variáció
• PLoS One: aktiválása mesenchymalis őssejtek makrofágok Prompts Emberi gyomorkarcinóma Növekedés NF-kB útvonal