PLOS NËMMEN: Quantification vun Chitinase mRNA Niveauen a Mënscherechter an Mouse Stoffer vum Real-Time Hinnen alleguer: Art-Spezifësch Expression vun dono Mammalian Chitinase am Mo. Tissues

Wat VerfÜgung

Chitinase hydrolyzes chitin, deen ass en N VerfÜgung -acetyl-d-glucosamine Polymer datt zu engem Netzwierk vu Organismen präsent ass, dorënner Insekten, Parasiten a liewen. Obwuel Mamendéieren all endogenous chitin sëlwer nët, Mënschen a Mais auszedrécken zwee aktiv chitinases, chitotriosidase (Chit1) an dono mammalian chitinase (AMCase). Well den Niveau vum Ausdrock vun dësen chitinases zu vill demagogesch Konditiounen fräi ass, dorënner Gaucher Krankheet a Maus Modeller vun Asthma, kënnen souwuel chitinases wichteg Roll an der pathophysiologies vun dësen an aner Krankheete spillen. Mir etabléierten kuerzem eng grouss Hinnen alleguer System enger eenzeger Standard DNA benotzt an huet datt AMCase mRNA bei extrem héich Niveauen an Maus Mo. Stoffer Wierderbuch steet. An dëser Etude, applizéiert mir dës Methodologie fir d'quantification vun chitinase mRNAs mënschlechen Stoffer a fonnt, datt souwuel chitinase mRNAs waren am normale Mënsch Stoffer dicht ausgedréckt. Chit1 mRNA war an der mënschlecher haett héich ausgedréckt, hierkommen AMCase mRNA net am normale Mënsch Mo. Stoffer overexpressed war. Den Niveau vun deene mRNAs zu Mënsch Stoffer sech vill méi niddereg wéi den Niveau vun housekeeping Genen. Well d'AMCase Ausdrock Niveauen tëschent dem Mënsch a Maus Mo. Stoffer ganz anescht waren, entwéckelt mir eng grouss Hinnen alleguer System d'mRNA Niveau tëscht Mënsch a Maus Stoffer mat engem Mënsch-Maus Hybrid Standard DNA ze vergläichen. Eis Analyse gewisen, datt Chit1 mRNA bei ähnlechen Niveauen am normale Mënsch a Maus haett ausgedréckt gëtt. Am Géigesaz, huet de AMCase Ausdrock Niveau mënschlechen Mo vill méi niddereg wéi dat Ausdrock Niveau vun Maus Mo. observéiert. Dës mRNA Differenzen tëscht Mënsch a Maus Mo. Stoffer sech bidden Differenzen an der chitinolytic Aktivitéiten an Niveau vun FAQ Ausdrock. Soumat ass de Ausdrock Niveau vun der AMCase am Mo. Arten-spezifesch VerfÜgung

Fro:. Ohno M, Togashi Y, Tsuda K, Okawa K, Kamaya M, Sakaguchi M, et al. (2013) Quantification vun Chitinase mRNA Niveauen a Mënscherechter an Mouse Stoffer vum Real-Time Hinnen alleguer: Art-Spezifësch Expression vun dono Mammalian Chitinase am Mo. Stoffer. PLoS NËMMEN 8 (6): e67399. Doi: 10.1371 /journal.pone.0067399 VerfÜgung

Redakter: Emiko Mizoguchi, Massachusetts Generalsekretär Klinik, Vereenegt Staate vun Amerika VerfÜgung

Arnaque: Januar 5, 2013; Akzeptéiert: 15 Mee, 2013; Publizéiert: 27. Juni 2013 VerfÜgung

Copyright: © 2013 Ohno et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung

Funding:. Dës Aarbecht war vun der Project Research Grant vun der Fuerschung Institut vu Wëssenschaft an Technologie, Kogakuin Uni ënnerstëtzt. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung

Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

Chitin, deen ass e Polymer vun N VerfÜgung -acetyl-d-glucosamine, ass déi zweet Équipe räich polysaccharide an Natur [1]. Et ass en integralen Bestanddeel vun der exoskeletons vun crustaceans an Insekten, déi microfilarial sheaths vun parasitic nematodes an fungal Zell Maueren [1], [2]. VerfÜgung

Chitinases sinn Enzymen datt d'chitin Polymer erbléckt. Obwuel Mamendéieren produzéiere net chitin, Mënschen an Mais hun zwee Genen déi aktiv chitinases, chitotriosidase (Chit1) an dono mammalian chitinase (AMCase) [2], [3] gerannt. Chit1 war den éischte mammalian chitinase sidd an gekloonten gin [4], [5]. AMCase, déi d'zweet Équipe aktiv chitinase zu Mamendéieren ass, gouf als eng indemnité Aktivitéit fir Chit1 identifizéiert a fir seng optimal Aktivitéit an dono Konditiounen genannt [6]. VerfÜgung

Béid Enzymen Collectioun Haaptrei homology zu bakteriell chitinases a gehéieren zu Famill 18 vun glycosyl hydrolases, déi och chitinase-wëll Proteinen datt zu chitinases strukturell Zesummenhang si gehéieren awer opgepasst chitinolytic Aktivitéit [2], [3]. D'murine AMCase weist Haaptrei homology zu Chit1, mat eng Identitéit vun 52% an engem System vun 60% [6]. Der nët vun der mënschlecher Chit1 Gentherapie ass op chromosome 1q32 [7] fonnt, hierkommen, déi mënschlech AMCase Gentherapie op chromosome 1p13 [6] etabléiert ass. Béid Genen sinn zesummegesat aus 12 exons an gerannt verschidde splice isoforms [6] - [9]. D'Haaptrei homology an d'Conservatioun vun der intron-Exon Grenze tëscht Chit1 an AMCase Genen hindeit datt dës Genen vun enger Verdueblung vun engem Liewe Gentherapie ausgebrach [3], [6]. VerfÜgung

rezenten Etuden Associatiounen gewisen hunn tëscht den Ausdrock vun der mammalian chitinases an demagogesch Konditiounen. Zum Beispill, [9] de Niveau vun Chit1 sinn an de Plasma vun Patienten mat Gaucher Krankheet, déi bronchoalveolar lavage Valoriséierung vun Fëmmerten an Patienten mat chronescher obstructive deser Krankheet (COPD) an der cerebrospinal Valoriséierung vun Patienten mat Alzheimer nik - [12] . AMCase Ausdrock an Aktivitéit sinn och während allergescher airway Äntwerte vun Maus Modeller vun Asthma [13] upregulated. Polymeric chitin induces AMCase Ausdrock an de Rekrutement vun immun Zellen déi mat Allergie an Asthma verbonne ginn [14]. Zousätzlech, e puer genetesch Varianten vun AMCase si mat bronchial Asthma an Mënschen [15] assoziéiert, [16]. Dës Resultater proposéiere staark, dass d'chitinolytic Enzymen wichteg Roll an der Katastrophenhëllef Krankheet spillen. Allerdéngs bleiwen hir pathophysiological Funktiounen ganz wéineg verstan. VerfÜgung

Quantification vun Chit1 an AMCase mRNA Niveau ass e wichtege Schrëtt a Richtung de Versteesdemech vun der zu VIVO VerfÜgung Regulatioun vun chitinases zu Mamendéieren. Mir etabléierten kuerzem eng grouss Hinnen alleguer System enger eenzeger Standard DNA benotzt fir ofgedonkelt an den Ausdrock Niveau vun der chitinase an Referenzmaterial Genen op d'selwecht Skala [17] vergläichen. An eiser leschter Pabeier, awer mir dass AMCase eng grouss ët an der Maus Mo ass an ass um Niveau ausgedréckt, datt fir déi vun pepsinogen C ähnlecher ginn [17]. VerfÜgung

Hei, applizéiert mer eis Methodik an der quantification vun mRNA Niveau vun der mammalian chitinases am normale Mënsch Stoffer, déi fir Versteesdemech hir agebousst Rollen an diseased Stoffer eng Viraussetzung ass. Ausserdeem, gegrënnt mir eng quantification System d'mRNA Niveaue vu multiple Genen tëscht enger Zuel vu Mënsch an Maus Stoffer mat engem Mënsch-Maus Hybrid Standard DNA ze vergläichen. Eis Etude quantitativ weist dass Chit1 mRNA bei ähnlech héich Niveauen am normale Mënsch a Maus Longen ausgedréckt gëtt. Am Géigesaz, ass AMCase Kannerbetreiung an Maus overexpressed awer net mënschlech Moo. VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

Grënnung a Validatioun vun engem Real-Zäit Hinnen alleguer System fir Detektioun vun Chitinases zu Mënscherechter Stoffer VerfÜgung

mir etabléierten virdrun eng real-Zäit Hinnen alleguer System dass vun Bestëmmung vun der mRNA Niveau vun den zwou mammalian chitinases zu Maus Stoffer a vun vergläichen dësen Niveauen mat deene vun Referenzmaterial Genen benotzt déi selwecht Skala kapabel ass [17]. An dëser Etude, wollte mir der Gentherapie Ausdrock Niveau vun der Chit1 an AMCase Genen ganze normale Mënsch Stoffer (Dorënner 1A) ze vergläichen. Wéi an Maus Stoffer [17], déi mer de housekeeping Genen glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) an β-actin als Referenz Genen well se constitutively bei héijen Niveauen am meeschte Zellen ausgedréckt ginn [18]. Ausserdeem hutt mir pepsinogen C als Referenz Gentherapie am Mo. (och als progastricsin bekannt), well de Niveau vun AMCase mRNA an der Maus Mo. zu der mRNA Niveau vun pepsinogen C ähnlecher war, deen e grousse Bestanddeel vun der gastric mucosa soumat [ ,,,0],19]. Benotzt dëse dräi Referenzmaterial Genen, évaluéiert mir der Gentherapie Ausdrock Niveau vun Chit1 an AMCase am normale Mënsch Stoffer (Dorënner 1A). VerfÜgung

Mir entworf puer baut vun primers fir grouss Hinnen alleguer a bewäert hir suitability baséiert op, ob se Schatzkummer engem eenzege vermëschen Temperatur (TM) an engem eenzege Band op engem 10% polyacrylamide gelies [17]. Als zu Dorënner S1A-E gewisen, Collectioun der dissociation Kéiren vun de fënnef cDNAs nëmmen een Héichpunkt all. Gelies electrophoresis kloer gewisen eenzel Gruppen um erwaart Gréisste fir Chit1 (55 BP), AMCase (62 BP), GAPDH (57 BP), β-actin (57 BP) an pepsinogen C (61 BP) (Dorënner S1F). Sou, confirméiert mir dat déi richteg Hinnen alleguer Produiten aus de Mënsch Otemschwieregkeeten cDNA Mëschung Implikatioune goufen. VerfÜgung

Mir nächst e Liewesniveau Skelett DNA fir real-Zäit Hinnen alleguer vun ligating der fënnef Zil- Fragmenter vun engem eent-zu-eent Verhältnis gebaut (Well 1B an Dorënner S2). D'1,396-Nukleotid-laang Standard Skelett DNA aus fënnef cDNA Fragmenter déi Hinnen alleguer Zil- Regioun an 60-143 Base vun der Reliefsailen Regiounen Daach an enthale BGL VerfÜgung II, Sal VerfÜgung ech, Xho VerfÜgung ech an net VerfÜgung ech Restriktioun Siten (Dorënner 1B an Dorënner S2). VerfÜgung

d'quantification souwuel d'chitinases an der Referenz mRNAs berout op Norm Kéiren. Mir ginn de Standard Kéiren der real-Zäit Hinnen alleguer quantification Strategien ze vergläichen an diskutéieren. All Norm rop generéiert gouf mat 10-fantastesch Serien dilutions vun der mënschlecher Standard DNA an der fënnef verschiddene primer Puer (Dorënner S3A-E, rout zougemaach Kreeser). Andeem Dir kënnt de Standard Skelett DNA wouvun der fënnef Mënsch cDNA Brochstécker, gläiche Quantitéiten un all fënnef Genen an all dilution benotzen zougewisen ginn der Norm Kéiren (Dorënner S3A-E, rout zougemaach Kreeser). VerfÜgung

ze bauen Fir Test der Gläichheet vun de Kéieren, war e bekannte Konzentratioun vun der mënschlecher ganze coding cDNA Kick an duerno als eng onbekannt Echantillonen analyséiert. Dëst assay war gesuergt, fir z'iwwerpréiwen, datt all getest dilution am erwaart Quantitéit duerchgesat. Als zu Dorënner S3A-E gewisen, blo zougemaach rhombuses, goufen gläich Quantitéite fir all getest dilution observéiert; dës sech benotzt der Norm rop ze bauen. VerfÜgung

D'quantification vun niddereg-Iwwerfloss gët a räich gët eis erlaabt d'Sensibilitéit an Zouverlässegkeet vun real-Zäit Hinnen alleguer, wat beweist, datt eis real-Zäit Hinnen alleguer Method bitt eng grouss ze validéieren dynamesch Gamme vun quantification, héich Richtegkeet, an héich Empfindlechkeet (Dorënner S3A-E). Sou, eis real-Zäit Hinnen alleguer Method gëtt verléisslech Wäerter fir déi zwee Mënsch chitinase Genen an den dräi mënschlech Referenz Genen op der Skala. VerfÜgung

Expression vun Chit1 an AMCase am normale Mënsch Stoffer VerfÜgung

Fir Etude déi zu VIVO VerfÜgung Regulatioun vun den Ausdrock vun der mënschlecher Chit1 an AMCase Genen, war total RNS aus verschiddenen normale Mënsch Stoffer mat enger mei real-Zäit Hinnen alleguer assay mat der speziell heifir Standard DNA (Dorënner 1) analyséieren. Déi doraus resultéierend Wäerter waren an y Achs (Dorënner 2 an Dorënner 3) pro 10 NG vun insgesamt RNS als Molekülle ausgedréckt. VerfÜgung

Béid Chit1 an AMCase mRNAs waren am normale Mënsch Stoffer (Dorënner 2A an 2B) dicht ausgedréckt. Déi héchsten Niveau vun Chit1 mRNA waren am mënschleche haett, gefollegt vun Mëlz, An et Liewer an thymus (Dorënner 2A) fonnt. Déi héchsten Niveau vun AMCase mRNA waren an haett, duerno An et Gehir, Liewer, es of a Häerz (Dorënner 2B) fonnt. Obwuel AMCase mRNA bei extrem héich Niveauen an der Maus Mo. ausgedréckt huet [17], war seng Ausdrock Niveau vun de Mënscherechter Mo vill méi déif wéi déi an haett, An et Gehir, An et Liewer, es of a Häerz (Dorënner 2B). An anere Stoffer, souwuel de Chit1 an AMCase mRNAs sech um niddereg ausgedréckt, mee einfach Magnéitfeld Niveau uewendriwwer Hannergrond (Dorënner 2A an Dorënner 2B). VerfÜgung

Am Verglach mat AMCase mRNA Niveauen, war um relativ héichen Niveau Chit1 mRNA ausgedréckt zu Mëlz an an et Liewer. Am Géigesaz, ausgedréckt An et Gehir, Aarbecht a Liewer an enger héijer Zomm vun AMCase mRNA wéi Chit1 mRNA (Dorënner 2). VerfÜgung

Analys vun der Expression Niveauen vun Chit1, AMCase, GAPDH, β-actin an Pepsinogen C mRNAs zu normale Mënsch Lung an Mo. Stoffer VerfÜgung

Well vill Studien op der pathophysiology vun mammalian chitinases gewiescht benotzt haett an Mo. standing [6], [8], [9], [13], [14], [20 ] - [23], am Verglach mir den Ausdrock Niveau vun der chitinases an der Referenz Genen vun dësen zwou Mënsch Stoffer. Déi grouss Donnéeë sinn an Dorënner 3. norméierend der Chit1 Niveau ze 1.0, d'Bekannten Ausdrock Niveau vun AMCase, GADPH, an β-actin mRNAs zu Mënsch Otemschwieregkeeten goufen 0,8, 39 an 343, respektiv (Dorënner 3A) gewisen. D'GAPDH an β-actin Genen sinn bekannt housekeeping Genen a sinn constitutively bei héijen Niveauen am meeschte Stoffer ausgedréckt [18]. Eis Resultater weisen, datt Chit1 an AMCase mRNAs sinn op ähnlechen Niveauen am normale Mënsch Otemschwieregkeeten ausgedréckt, obwuel d'Chit1 Ausdrock Niveau méi niddreg wéi déi vun den zwee housekeeping Genen war (vergläichen Net-Logbuch Komplott mat Logbuch Komplott an Dorënner 3).

norméierend der Chit1 Niveau ze 1.0, goufen d'famill Ausdrock Niveau vun der AMCase, GAPDH, β-actin an pepsinogen C am normale Mënsch Mo. Otemschwieregkeeten 1,5, 323, 1.736 an 3.962, respektiv (Dorënner 3B). Hei, d'Expressioun Niveaue vu béiden Chit1 an AMCase sech vill méi niddreg wéi déi vun GAPDH an β-actin. Obwuel pepsinogen C mRNA héich an de Mënsch Mo. Echantillon ausgedréckt huet, war AMCase mRNA ähnlecher zu Chit1. Dës Resultater weisen, datt d'Chit1 an AMCase Ausdrock Niveau vun de Mënscherechter Stoffer relativ niddreg sinn iwwerpréift an datt d'AMCase Ausdrock Niveau vun de Mo. Ënnerscheed bedeitend tëscht Mënsch a Maus. VerfÜgung

Grënnung a Validatioun vun engem Quantification System fir Mënscherechter an Mouse Chitinase mRNAs engem Mënscherechter-Maus Hybrid DNA Ausschöpfung VerfÜgung

Mir nächst gesicht der Ausdrock Niveau vun den zwou chitinases tëscht Mënsch a Mais op der Skala ze vergläichen mat engem real-Zäit Hinnen alleguer System (Dorënner 4A). Mir gebaut also e Mënsch-Maus Hybrid Standard DNA fir real-Zäit Hinnen alleguer vun de Mënscherechter an Maus Standard Skelett DNAs ligating (Dorënner 4B). Déi doraus resultéierend 2,305-Nukleotid-laang Skelett aus DNA ten cDNA Fragmenter déi Hinnen alleguer Zil- Regioun an 9-143 Base vun der Reliefsailen Regioune vum Mënsch a Maus Genen (kuckt Detailer zu Dorënner S4) iwwerzunn. VerfÜgung

D'validations vun der Norm rop an d'grouss Hinnen alleguer System real-Zäit goufen zu Dorënner S5, Dorënner S6 an S7 Dorënner wéi dës gesuergt. Serial dilutions vun der mënschlecher-Maus Hybrid Standard DNA sech benotzt e Liewesniveau rop ze bauen. All Norm Kéier war mat 10-fantastesch Serien dilutions vun der Norm DNA an der fënnef verschiddene primer Puer (Dorënner S5A-E, rout zougemaach Kreeser) entsteet. Andeems se mat der Norm Skelett DNA wouvun der fënnef cDNA Fragmenter, kënnen gläichberechtegt Quantitéiten un all vun de fënnef mënschleche Genen zougewisen ginn andeems Mënsch-spezifesch primer Puer vun all dilution dat benotzt gouf de Standard Kéiren (Dorënner S5A-E, zougemaach roude Kreesser ze bauen ). Den Zerfall, kënnen gläichberechtegt Quantitéiten un all vun de fënnef murine Genen (Dorënner S6A-E, mauve zougemaach triangles) gehéiert ginn. VerfÜgung

d'Gläichheet vun de Kéieren ze testen, e bekannte Konzentratioun vum ganze coding cDNA war Kick an duerno als eng onbekannt Echantillonen analyséiert. Gläich Quantitéite vun der mënschlecher ganze coding cDNAs fir all getest dilution observéiert goufen; dës Quantitéite waren dann benotzt der Norm rop (Dorënner S5A-E, blo zougemaach rhombuses) ze bauen. Den Zerfall, goufen gläich Quantitéite vun der Maus ganze coding cDNAs och observéiert (Dorënner S6A-E, gréng Passë). D'quantification vun niddereg-Iwwerfloss gët a räich gët erlaabt eis d'Sensibilitéit an Zouverlässegkeet vun real-Zäit Hinnen alleguer ze confirméieren, wat beweist, datt eis real-Zäit Hinnen alleguer Method enger grousser dynamesch Gamme vun quantification offréiert, héich Richtegkeet, an héich Empfindlechkeet (Dorënner S5A- E an Dorënner 6A-E). VerfÜgung

Ausserdeem, déi véier Versen (zwou Standard Kéieren an zwee dilution Kéiren vun de bekannte Konzentratioune vun de Mënscherechter an Maus ganze coding cDNAs, bzw.) overlapped (Dorënner S7A-E). Sou, eis real-Zäit stellt Hinnen alleguer Method verléisslech relativ Wäerter fir déi véier chitinase Genen an der sechs Referenzmaterial Genen (Dorënner 4B). VerfÜgung

Se Chit1 an AMCase mRNA Niveauen tëschent Normal Mënscherechter an Mouse Stoffer VerfÜgung

Mir ginn de Mënscherechter Total RNS Master Panel II an der Mouse Total RNS Master Panel (Clontech Laboratoiren) als Ursprong vun insgesamt RNS fir dës Etude. Et gi véier Stoffer (haett, Liewer, Mëlz an Niere) dass tëscht der Mënschheet an Maus Brieder an Zesummenhang mat Asthma an Gaucher Krankheet overlapped. Well et zu der chitinase Ausdrock am Mo. Stoffer groussaarteg Ënnerscheeder waren, hu mir eis och op den Niveau vun Ausdrock vun dësen chitinases an aner digestive Organer, bloc, Mo, kleng a grouss intestines tëscht Mënsch a Maus. Mir laachen an den Ausdrock Niveauen an dëse Stoffer Verglach mat de Mënsch-Maus Hybrid Standard DNA (Dorënner 4B); déi grouss Daten ginn an Dorënner 5. VerfÜgung

Mir dës Distanz an der héchster Ausdrock Niveau vun Chit1 mRNA zu Maus (awer net mënschlech) Mo duerch mënschlech haett Stoffer duerno fonnt. Insgesamt war Chit 1 mRNA bei héichen Niveau vun de Mënscherechter Stoffer ausdrécke wéi an der Maus Stoffer ausser Mo. (Dorënner 5A). Den héchste Ausdrock Niveau vun AMCase mRNA war an Maus Mo, gefollegt vun Maus bloc. Am anere Mënsch a Maus Stoffer, goufen d'AMCase mRNA Niveauen niddereg mënschlechen Stoffer (Dorënner 5B). Béid Chit1 an AMCase mRNA Niveauen am klengen a grousse intestines sech Héich zu souwuel mënschlech a Maus Stoffer (Dorënner 5), déi mat virdrun Donnéeën kritt vun Northern konsequent waren blotting [6], [21]. VerfÜgung

Mir fonnt dass AMCase mRNA bei nidderegen Niveau am normale Mënsch Mo. ausgedréckt huet, mä war an Maus Mo. Stoffer (Dorënner 5B) héich ausgedréckt. Sou, mir Verglach och den Ausdrock Niveau vun der chitinases an der Referenz Genen der cDNAs benotzt datt aus der haett an Mo. Stoffer virbereet goufen. VerfÜgung

norméierend de Mënsch Chit1 Niveau vun der Otemschwieregkeeten bis 1.0, d'Bekannten Ausdrock Niveauen vun der Maus Chit1, goufen Mënsch AMCase a Maus AMCase mRNAs 0.3, 0.3 an 7, respektiv (Dorënner 6A). Murine AMCase war an der Maus haett héich ausgedréckt. Den Niveau vun Chit1 mRNA vun der mënschlecher haett war iwwer 3-fantastesch méi héich wéi déi vun Maus haett. D'Chit1 an AMCase mRNA Niveauen sech vill méi niddereg wéi den Ausdrock Niveau vun der GAPDH an β-actin Genen (Dorënner 6A). VerfÜgung

norméierend der mënschlecher Chit1 Niveau am Mo. to1.0, d'Bekannten Ausdrock Niveau vun der Maus Chit1, de Mënsch AMCase an der Maus AMCase mRNAs goufen 10, 0,7 an 1.978 respektiv (Dorënner 6B). Pepsinogen C ass eng grouss digestive Aktivitéit an de Moo. Den Ausdrock Niveau vun AMCase zu Mais war vill méi héich wéi déi vun GAPDH an β-actin a war vergläichbar mat den Niveau vun pepsinogen C hierkommen, déi mënschlech Mo. engem Héich Niveau vun AMCase mRNA Ausdrock Schatzkummer. Der relativer Ausdrock Niveau vun mRNA am Mënsch a Maus Mo. sech 1.0 an 2.826, respektiv. VerfÜgung

An fir ob der mRNA Niveau Differenzen tëscht Maus ze kontrolléieren a mënschlech op d'FAQ Niveau spigelt sech, mir enzymatic Aktivitéit nächst analyséiert vun dësen chitinases am Mo. Stoffer. Mir analyséieren éischt AMCase Aktivitéit an mouse a mënschlech Mo. Stoffer. D'Maus AMCase weist eng duebel pH beschtméiglecher mat engem grousse beschtméiglecher ronderëm pH 2 an engem Lycée beschtméiglecher ronderëm pH 5 [6] hierkommen Mënsch AMCase weist breet optimal pH um pH 2~pH 5 [16], [24]. Sou, mir chitinolytic Aktivitéit um pH 2.0 an pH 5.0 mat de syntheteschen Realitéiten vun 4-methylumbelliferyl β-D-N, N'-diacetylchitobiose (4MU-chitobiose) gemooss [6], [21]. Mir fonnt sécherlech chitinolytic Aktivitéit an Maus Mo. Extrait um pH 2.0 a staark Aktivitéit um pH 5.0. Am Géigesaz, war zu där vu Mënsch op pH 2.0 an Niddereg Aktivitéit war observéiert um pH 5.0 (Dorënner 7A, lénks). VerfÜgung

D'Norm Chit1 enzymatic assay 4-methylumbelliferyl keng Aktivitéit fonnt β- standing benotzt gouf DN, N ', N' '- triacetylchitotriose (4MU-chitotriose) op pH 5.2 [6], [10], [21], [25]. Fir d'Wierkung vun AMCase op Chit1 Aktivitéit suivéieren, analyséieren mir de chitinase Aktivitéit mat 4MU-chitotriose um pH 2.0. Relativ staark chitinase Aktivitéit géint 4MU-chitotriose war um pH vun der Maus Mo. Extrait fonnt 2.0 (Dorënner 7A riets), an mir och schwaach chitinase Aktivitéit um pH 5.2 (Dorënner 7A riets) fonnt. Zanter AMCase enger zweeter beschtméiglecher bei ronn pH 5 huet, uginn dësen Resultater, datt déi meescht vun chitinolytic Aktivitéit um pH 5.2 kënnen ze AMCase anstatt Chit1 an datt Maus AMCase wéinst kéint 4MU-chitotriose wéi Realitéiten um pH 2.0 hydrolyze. Geholl zesummen, schéinen der Majoritéit vun chitinase Aktivitéit an der Maus Mo aus AMCase Aktivitéit. Am Mënsch Mo. Extrait mir och ganz schwaach awer festgestallt Niveau vun chitinolytic Aktivitéit um pH 2.0 an pH 5.2 (Dorënner 7A, riets, manner Rot) observéiert. Chitinase Aktivitéit um pH 5.2 war ähnlech, dass um pH 2.0, déi besot Chit1 Ausdrock vun mënschlecher Moo. VerfÜgung

Endlech, mir analyséieren de Niveau vun FAQ Ausdrock vun Western blotting antibodies géint AMCase benotzt. D'Anti-AMCase antibodies sech generéiert géint d'virdrun gemellt Maus peptide [14] a mënschlech Kolleg. Anti-Maus AMCase antibody unerkannt engem sécherlech eenzel FAQ Band zu Extrait aus Maus Mo awer net aus Mënsch (Dorënner 7B, lénks). Den Zerfall anti-Mënsch AMCase antibody unerkannt och eng eenzeg Band an der Maus Extrait (Dorënner 7B, riets). An der mënschlecher Extrait goufen et wäiss Bande vun méi héich molekulare Gewiicht, datt déi béid Mënsch a Maus antibodies (Dorënner 7B) unerkannt huet. Well et entweder kee groussen chitinase Aktivitéit um pH war 2.0 oder 5.0 iwwerwaacht pH vun 4MU-chitobiose zu Mënsch Mo. Extrait benotzt, konnt dëse Bande net zu de Mënscherechter AMCase Zesummenhang ginn. Demno, goufen chitinolytic Aktivitéiten an der famill FAQ Ausdrock Niveau tëscht Maus a mënschlech Mo. Stoffer konsequent mat eis Daten um mRNA Niveau kritt. VerfÜgung

Diskussioun VerfÜgung

virdrun Studien op der zu VIVO
Regulatioun vun Chit1 an AMCase zu Mënsch a Maus goufen higeriicht benotzt nërdlechen blotting, semi-grouss Hinnen alleguer an real-Zäit Hinnen alleguer [6], [8], [9], [13], [14], [22] , [23]. Obwuel dës Methoden puer Virdeeler iwwer d'Ënnersiche vun der Gentherapie Ausdrock Musteren hunn, dunn hunn se de Niveau vun de verschiddene Gentherapie gët op d'selwecht Skala ze vergläichen. An der aktueller Etude, applizéiert mer eis Methodik [17] den Ausdrock Niveau vun deene chitinases mënschlechen Stoffer ze ermëttelen. Ausserdeem, d'Expressioun Niveau vun chitinases zu Mënsch a Maus Stoffer ze diskutéieren, entwéckelt mir eng quantification System engem eenzege Mënsch a Maus Hybrid Standard DNA benotzt. Mir weisen tissue- an Arten-spezifesch Ausdrock vun den zwou mammalian aktiv chitinases, Chit1 an AMCase. Eis Datesupporten allgemeng virdrun Studien Rapport vum Boot et al [6], [21]. Mä, ass eis Analys genuch sensibel mRNA ze entdecken a stellt eng ëmfaassend Ëmfro vun der Gentherapie Ausdrock Musteren vun der chitinases zu Mënsch a Maus Stoffer op der Skala. VerfÜgung

One deitlech Charakteristik vun der Expressioun vun der mammalian chitinases ass der conserved Ausdrock vun Chit1 tëscht haett Stoffer Mënsch a Maus. Mir hu fonnt, datt Chit1 um relativ héijen Niveau vun de Mënscherechter an Maus haett Stoffer ausgedréckt huet, dass mat all aner bal ähnlecher huet, wat beweist, datt d'Ausdrock Niveau vun der Chit1 mRNA conserved ass. An de Longen, chitin-haltege pathogens, wéi liewen an kleng Geldstécker [25] schützt géint Chit1 kann als Deel vun de Provider Ofwier System Akt dat. Der Conservatioun vun Chit1 Gentherapie Ausdrock vun de Mënschen a Mais proposéiert d'Fro gestallt Wichtegkeet vun Chit1 am haett. VerfÜgung

den Ausdrock vun chitinases am Mo ass vu besonneschem Interessi. AMCase mRNA ass bei extrem héich Niveauen an der Maus Mo. Wierderbuch awer net zu de Mënscherechter Mo. (Dorënner 6B). De Verglach vun dësen Ausdrock Niveauen gewisen, datt d'AMCase mRNA Niveau vun der mënschlecher Mo. iwwert 1 /2,800 vu datt an der Maus Kolleg huet. Mir confirméiert, datt de Begrëff Niveau vun pepsinogen C mRNA an den zwee housekeeping Genen huet ganz héich an de Mënsch a Maus Mo. Stoffer (Dorënner 6B). Soumat ass d'Verréngerung Ausdrock Niveau vun AMCase mRNA vun der mënschlecher Mo net wéinst RNS ofgeschnidden während der cDNA Virbereedung. Doriwwer eraus, hunn mir dass Maus Mo grouss Quantitéit vun AMCase ausgedréckt, wobäi de Mënsch Amtskolleg net gemaach (well 7). Dës Resultater weisen, datt den Ausdrock Niveau vun der AMCase am Mo. Stoffer Ënnerscheed bedeitend tëscht Mënsch a Mais. VerfÜgung

De Mo ass eng wichteg Uergel déi fundamental Roll vun der Verdauung vu Liewensmëttel a Schutz géint schiedlechen Organismen spillt. Salz- Seier ass an de Mo secreted, dono Konditioune schafen (pH = ~2) ubruecht fir d'Verdauung vun Proteinen vun pepsin [19], [26]. Murine AMCase weist déiwer Stabilitéit Seier an ass déi aktiv bei ronn pH 2 [6]. D'Maus Mo. produzéiert eng enorm Quantitéit vun AMCase mRNA [17] a seng Iwwersetzung Produit (Dorënner 7). Demno, kann AMCase als digestive Aktivitéit Funktioun datt chitin-haltege Liewensmëttel an der Maus Mo. Theorem. VerfÜgung

Am Géigesaz, den Ausdrock Niveau vun AMCase mRNA a seng Produit ware relativ héich an de Mënsch Mo. (Dorënner 5, Figur 6 a Gestalt 7). Dëst ass net onerwaart well modern Mënschen iessen do net e groussen Undeel vun chitin-haltege Liewensmëttel. Dës Resultater hindeit, datt AMCase net eng Roll an der Ofwier géint chitin-schiedlechen Organismen an d'mënschlech Mo spillen kann. Vill Mo. Krankheeten sinn mat Wonn vun exogenous Organismen assoziéiert. Der Gravitéit vun gastritis-verbonne Aids wéi Helicobacter pylori VerfÜgung mat der Aktivitéit vun endogenous Enzymen vergläichen kann [23]. Et bleift also eng Fro vun Debatt ob den niddregen Niveau vun AMCase vun der mënschlecher Mo an der Äntwert op gastric Entwécklungsstéierungen bedeelegt. VerfÜgung

A héije Niveau vun chitinolytic Aktivitéiten goufen an dovu vun Maus Mo an Daarm fonnt [6] . Well et zu den Niveau vun chitinase Ausdrock am Mo. tëscht Mënsch a Maus groussaarteg Differenzen sinn, iwwerpréift mir den Niveau vun Ausdrock vun dësen chitinases an aner digestive Organer, dorënner bloc a kleng a grouss intestines. Eis Resultater weisen, datt souwuel Chit1 an AMCase mRNA Niveauen am klengen a grousse intestines zu souwuel mënschlech a Maus Stoffer Ganz héich waren, obschons Maus bloc an Mo. héich Niveaue vu béiden chitinases mRNAs produzéiert (Dorënner 5). Dës Resultater hindeit, datt mammalian chitinase Proteinen an der Maus intestines wahrscheinlech aus der ieweschter Deeler vun der gastrointestinal TRACT ofgeleet ginn, wéi bloc an Mo, déi mat der Umellung Notioun vum Boot et al konsequent ass [6], [21].

den Ausdrock Niveau vun der Chit1 Gentherapie zu haett Stoffer gëtt tëscht Mënschen a Mais conserved. Am Géigesaz, ass den Ausdrock Niveau vun der AMCase am Mo. Stoffer Arten-spezifesch. D'Resultater hindeit, datt d'Regelung vun den Ausdrock vun Chiti1 mRNA am haett während Evolutioun agekacht gouf, ënnersicht d'Verréngerung Ausdrock vun AMCase vun der mënschlecher Mo. kéint d'Resultat vun der Gentherapie silencing ginn. D'Ënnersiche vun der Regelung vun der Expressioun vun dësen mammalian chitinases konnt Abléck an der pathophysiological Rollen vun dësen Enzymen ginn. Eng detailléiert characterization vun de Promoteur Regioune vun der Chit1 an AMCase Genen an d'Identifikatioun vun den Well VerfÜgung - an Ziel VerfÜgung -acting Facteure gëtt fir d'Verständnis vun der selektiv Gentherapie Ausdrock vun deene verlaangt ginn chitinases zu Mënschen a Mais. VerfÜgung

Den Ausdrock vun Chit1 an AMCase mRNAs ass ënner verschiddenen agebousst Konditiounen entschlof. D 'grouss System hei beschriwwe ginn, wäerte mir de chitinase mRNA Niveauen ganze Mënsch a Maus Stoffer déi real-Zäit Hinnen alleguer ze vergläichen kënnen. Dës Analyse soll de Versteesdemech vun der biologescher Funktioun vun dëse chitinases, virun allem an der pathophysiologic Studien vum Mënsch Krankheet benotzt murine Modeller Hëllef. Eis Methodik Nowäis fir d'quantification vun der mRNAs vu multiple Genen tëscht Mënsch a Maus uplanzen d'selwecht Skala benotzt. A praktesch Benotzung vun dëser Komparativ Kräiz-Arten Gentherapie Ausdrock Donnéeën ass de Verglach vun erhéigen mat Maus an Zell Kultur Modeller. VerfÜgung

spontan a Methode VerfÜgung

RNS an cDNA Virbereedunge VerfÜgung

d'Mënscherechter Total RNS Master Panel II an der Mouse Total RNS Master Panel (Clontech Laboratoiren) waren benotzt d'Verdeelung vun gët an verschidden Stoffer ze iwwerpréifen. Mënsch klenger Daarm Total RNS war vun Clontech Laboratoiren kaaft. Ausserdeem war RNS aus bloc a kleng a grouss intestines vun 3-Mount-alen Mann Mais isoléiert. C57BL /6J Mais (KLOR Japan) goufen um RIKEN Brain Science Institut Déieren Facility flegelhaft. All Déier Experiment an Iwwerteneestëmmung mat den institutionelle Richtlinnen gesuergt. De Protokoll ass duerch de Comité op d'Ethik vun Déieren Experimenter vun der RIKEN Brain Science Institut (Ministär Nr H19-2B013) abruecht. All Agrëff war mat diethyl ETHER als Anästhesietechniken gesuergt, an all Efforten gemaach goufen Leed ze minimiséieren. Stoffer fir mRNA Virbereedung sech duerch Drs gëtt. Miyazaki an Nukina um RIKEN Brain Science Institut. Hëllef TRIzol Reagent (Invitrogen) laut den Hiersteller d'Instruktioune Total RNS war vun bloc a kleng a grouss intestines virbereet. Mir analyséieren 21 verschiddene Mënsch Stoffer an aacht erwuessener Maus Stoffer. Fir Spuer Montanten vun contaminating Frankräich DNA, total RNS Echantillon waren no de Recommandatiounen d'Produktioun mat RQ1 RNase-gratis DNase (Promega) behandelt ewechzehuelen. Jiddereng vun den insgesamt RNS Echantillon war haut zu ëmgedréint Transkriptiouns mat ënnerschiddleche hexamers wéi d'primers, wéi virdrun gemellt [17]. VerfÜgung

Real-Zäit Hinnen alleguer VerfÜgung

D'Opstelle an Confirmatioun vun der real-Zäit Hinnen alleguer System fir Mënscherechter Stoffer goufen als beschriwwen standing [17]; déi eenzeg Ausnam ass de Gebrauch vun de Mënscherechter primers. D'Nukleotid Message vun der primers datt fir d'real-Zäit Hinnen alleguer fir déi mënschlech System ausgewielt goufen si an Table S1 gewisen. All Prouf war zu triplicate Implikatioune verstärkt, an all Experimenter gouf op d'mannst zwee Mol widderholl. VerfÜgung

Bau vun de Mënscherechter Standard DNA an Virbereedunge Five Mënscherechter cDNAs Daach vum ganze Coding Regioun VerfÜgung

De Bau vun der Standard Skelett DNA fir de Mënsch Genen an d'Virbereedung vun de fënnef Mënsch cDNAs datt de ganze coding Regioun gedeckt goufen am Fong ëmschriwwen standing [17]; déi eenzeg Ausnam ass de Gebrauch vun de Mënscherechter primers. De Stiermer an ëmgedréint primers sinn an Table S2 opgezielt. D'Hinnen alleguer Produiten goufe mat de passenden Restriktioun Enzymen verdaut a benotzt T4 DNA ligase Jonglenster. D'Jonglenster Fragmenter sech mat der Forward primer 5'-CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATG-3 Kick "an de Géigendeel primer 5'-CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3 'an gekloonten nees pGEM-T Easy Vecteure (Promega). D'Fra Message vun der cDNAs sinn zu Dorënner S2 gewisen.

• PLOS NËMMEN: Mo. Temperatur Records definitiven Pfleegeheemer Erweiderung an Iwwergank zu Zolitt Food Konsum zu enger Unweaned Mamendéieren, d'Harbour Seal adoptéieren (Phoca vitulina)
• PLOS NËMMEN: Serum Apolipoproteins C-ech an C-III Sidd reduzéiert am Mo. Cancer kennen: Bilan aus MALDI-Opgrond Peptidome a Jonker-Opgrond Séminairen Assays