Mokslininkai sukuria perduodamą ir integruotą I tipo CRISPR platformą, skirtą redaguoti superklaidas

Aixin YAN vadovaujama tyrimų grupė, Docentas iš Molekulinės ir ląstelių biologijos tyrimų skyriaus, Mokslų fakultetas, bendradarbiaudamas su Garbės klinikiniu profesoriumi Patrick CY WOO iš Mikrobiologijos katedros, Li Ka Šingo medicinos fakultetas, Honkongo universitetas (HKU), pranešė, kad sukurta perduodama ir integruota I tipo CRISPR platforma, galinti efektyviai redaguoti įvairius klinikinius izoliatus Pseudomonas aeruginosa , superbakteris, galintis užkrėsti įvairius audinius ir organus, ir pagrindinis hospitalinių infekcijų šaltinis.

Ši technika gali pagreitinti daugelio vaistams atsparių (MDR) patogenų atsparumo veiksnių nustatymą ir naujų kovos su atsparumu strategijų kūrimą.

Tyrimas atvėrė naują kelią genomiškai redaguoti tas laukines bakterijų rūšis ir izoliatus, pavyzdžiui, tie, kurie turi klinikinę ir aplinkosauginę reikšmę, ir tie, kurie sudaro žmogaus mikrobiomą. Ji taip pat suteikė pagrindą, kaip panaudoti kitas CRISPR-Cas sistemas, plačiai paplitusias prokariotiniuose genomuose, ir išplėsti CRISPR pagrįstus priemonių rinkinius. Tyrimas buvo paskelbtas pirmaujančiame mokslo žurnale Nukleino rūgščių tyrimai .

Fonas

CRISPR-Cas sistema apima adaptyvią imuninę sistemą prokariotuose, kuri nuginkluoja įsibrovusius virusus, skaldydama jų DNR. Dėl savo unikalių galimybių nukreipti ir keisti DNR sekas, CRISPR-Cas buvo naudojamas kaip naujos kartos genomo redagavimo metodas.

Metodas pagrįstas 2 klasės II tipo CRISPR/Cas9 sistema, kuris sukėlė revoliuciją daugybės organizmų genetikoje ir biomedicininiuose tyrimuose ir buvo apdovanotas 2020 m. Nobelio chemijos premija. Tačiau, 2 klasės CRISPR-Cas sistemos sudaro tik ~ 10% CRISPR-Cas sistemų, natūraliai užkoduotų prokariotuose. Jų taikymas redaguoti bakterijų genomus yra gana ribotas.

Nepaprastai, CRISPR-Cas sistemos, priklausančios skirtingoms klasėms ir tipams, nuolat identifikuojamos, ir jie yra gilus rezervuaras CRISPR pagrįstų įrankių rinkinių plėtrai. Įvairiausios ir plačiausiai paplitusios CRISPR-Cas sistemos yra I tipo sistema, kuri sudaro 50% visų nustatytų CRISPR-Cas sistemų ir gali išplėsti CRISPR pagrįstus priemonių rinkinius, turinčius išskirtinių pranašumų, kurių negalima pasiekti naudojant 2 klasės sistemas, pavyzdžiui, didelis specifiškumas, minimalus netikslumas, ir gali ištrinti didelius fragmentus.

Tačiau, I tipo CRISPR-Cas sistema priklauso nuo daugiakomponentinio efektoriaus komplekso, vadinamo kaskadomis, kad trukdytų DNR, kuri nėra lengvai perkeliama į heterologinius šeimininkus, trukdančią plačiai taikyti šį natūraliai gausų CRISPR genomo redagavimui ir terapijai.

Pagrindinės išvados

Anksčiau, komanda nustatė labai aktyvią I tipo F CRISPR-Cas sistemą, kuri yra kliniškai atspari daugeliui vaistų P. aeruginosa padermė PA154197, kuri buvo išskirta iš kraujotakos infekcijos atvejo Karalienės Marijos ligoninėje. Jie apibūdino šią CRISPR-Cas sistemą ir sėkmingai sukūrė genomo redagavimo metodą, taikomą MDR izoliatui, pagrįstą šia vietine I-F tipo CRISPR-Cas sistema. Šis metodas leido greitai nustatyti MDR klinikinio izoliato atsparumo veiksnius ir sukurti naują kovos su atsparumu strategiją ( Ląstelių ataskaitos , 2019 m., 29, 1707-1717).

Norėdami įveikti I tipo komplekso kaskados perkėlimo į heterologinius šeimininkus barjerą, Šiame tyrime, komanda klonavo visą I-F tipą cas operoną į integraciją išmanantį mini-CTX vektorių ir konjugacijos būdu pristatė kasetę į heterologinius šeimininkus, įprastas DNR perdavimo metodas. Mini-CTX vektorius leido integruoti visą kaskadą į konservuotą attB genetinis lokusas heterologinių šeimininkų genome, suteikiant jiems galimybę turėti „vietinę“ I-F tipo CRISPR-Cas sistemą, kuri gali būti stabiliai išreikšta ir veikia.

Komanda parodė, kad perkeltas I-F tipo kaskadas pasižymi žymiai didesniu DNR trukdžių pajėgumu ir didesniu deformacijos stabilumu nei perkeliama Cas9 sistema ir gali būti naudojamas genomo redagavimui efektyviai (> 80%) ir paprastumu, y., vieno etapo transformacijos būdu paverčiant vieną redagavimo plazmidę.

Be to, jie sukūrė pažangią perkeliamą sistemą, apimančią ir labai aktyvią I-F tipo kaskadą, ir rekombinazę, kad būtų skatinamas sistemos taikymas padermėse, kurių homologinės rekombinacijos galimybės silpnos, laukinis P. aeruginosa izoliatai be informacijos apie genomo seką, ir kitose Pseudomonas rūšis.

Galiausiai, įvestus I-F tipo kaskadinius genus galima lengvai pašalinti iš šeimininko genomų per I-F kaskados sukeltą didelių DNR fragmentų ištrynimą, todėl ląstelės -šeimininkės genomo redagavimas be randų. Taip pat buvo parodytas perkeliamos sistemos taikymas genų slopinimui, pabrėžiant tvirtas ir įvairias sukurtos perduodamos I-F tipo CRISPR sistemos taikymo sritis.

Dr Aixin Yan prognozavo, kad šis naujas metodas bus išplėstas ir redaguos ne tik patogenus, bet ir mikrobiomą, kad būtų skatinama žmonių sveikata.

Tikime, kad CRISPR technologija ir terapija ateityje atneš naujų vilčių kovoti su superkogomis . "

Daktaras Aixin YAN, Docentas, Molekulinės ir ląstelių biologijos tyrimų skyrius, Mokslų fakultetas, Honkongo universitetas

• UMass Amherst Ph.D. kandidatas gauna USDA ir NIFA stipendiją maisto alergijos tyrimams
• Geras cholesterolis apsaugo kepenis nuo uždegimų ir traumų,