PLoS ONE: Maistinės medžiagos diferencijuotai reglamentuoti Nucleobindin-2 /Nesfatin-1 in vitro Kultūringas Skrandžio Ghrelinoma (MGN3-1) ląstelėmis bei in vivo Vyras Mice

Anotacija

Nesfatin-1 išsiskiria, rupiniai reaguoja anorexigenic peptidas užkoduota pirmtako nucleobindin-2 [NUCB2]. Cirkuliacinis nesfatin-1 padidėja po prandially, tačiau mitybos komponentai, moduliuoja NUCB2 /nesfatin-1 likti nežinoma. Mes iškėlė hipotezę, kad angliavandenių, riebalų ir baltymų diferencijuotai reguliuoti audinio konkrečią išraišką nesfatin-1. NUCB2, prohormoniniai convertases ir nesfatin-1 buvo aptikta pelės skrandžio ghrelinoma [MGN3-1] ląsteles. NUCB2 iRNR ir baltymų, taip pat buvo aptikta pelių kepenų ir plonųjų ir storųjų žarnų. MGN3-1 ląstelės buvo gydomi gliukozės, riebiųjų rūgščių arba amino rūgščių. Vyras C57BL /6 pelėms buvo chroniškai šeriami aukštos riebalų kiekis, didelis angliavandenių ir daug baltymų dietos 17 savaičių. Kiekybinė PGR ir nesfatin-1 tyrimus buvo naudojami mRNR ir baltymų koncentracijos nustatyti nesfatin-1. Gliukozė skatino NUCB2 iRNR išraišką MGN3-1 ląsteles. L-Triptofanas taip pat padidėjo NUCB2 iRNR raiška ir ghrelin iRNR išraiška, ir nesfatin-1 sekreciją. Oleino rūgštis slopina NUCB2 iRNR raiška, o ghrelin iRNR raiška ir sekrecija buvo sustiprintas. NUCB2 iRNR raiška buvo statistiškai reikšmingai mažesnis pelių kepenyse šeriamos daug baltymų dieta, palyginti su pelėmis šeriami kitų dietų. Lėtinis suvartojamų aukštos riebalų kiekio dietos sukelia žymiai sumažinti NUCB2 mRNR skrandyje, o daug baltymų ir daug riebalų dieta sukelia panašų slopinimo NUCB2 mRNR storojoje žarnoje. Jokių serumo skirtumai nesfatin-1 koncentracijos buvo rastos pelėms, esant 7 tarifu vykdoma, esant šviesos etapo pradžios. Aukštos angliavandenių dietos šeriami pelėmis parodė žymiai padidėjusi nesfatin-1 lygį esant 1 val serumas nesfatin-1 buvo žymiai mažesnis pelės šeriami daug riebalų, baltymų ar angliavandenių, lyginant su kontroliniuose 7 p.m, tiesiog iki tamsiai etape. Pelės, kad gavo daug riebalų boliuso gerokai padidėjusi nesfatin-1 visų tirtų po zondą laiko momentais /NUCB2, palyginti su kontrolinės pelių ir pelės šeriami kitų dietų. Mūsų rezultatai pirmą kartą parodė, kad nesfatin-1 moduliuojama maistinių medžiagų

nurodomoji dalis:. Mohanas H Ramesh N Mortazavi S "Le A Iwakura H Unniappan S" (2014) Maistinės diferencijuotai reglamentuoti Nucleobindin-2 /Nesfatin-1 in vitro
kultūringas skrandžio Ghrelinoma (MGN3-1) elementų ir , in vivo
pelių patinams. PLoS ONE 9 (12): e115102. Doi: 10,1371 /journal.pone.0115102

redaktorius: Yvette Tache, Kalifornijos universitetas, Los Andželas, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Gegužės 1, 2014 m Priėmė: Lapkričio 18, 2014 m Paskelbta: Lapkritis 15, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Mohanas et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų prieinamumas:. autoriai patvirtina, kad visi duomenys, kuriais grindžiamos išvados visiškai prieinama be apribojimų. Visi atitinkami duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

Finansavimas: Šis tyrimas yra finansuojamas atviros veiklos dotaciją iš Kanados Insitutes Sveikatos tyrimų (CIHR; http:. //www.cihr-irsc. gc.ca/e/193.html) ir įveisimo iš Saskatchewan sveikatos mokslinių tyrimų fondo (http://shrf.ca/). SU yra CIHR Nauja tyrėjas. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį. Finansuotojai neturi vaidmenį mokslinių tyrimų ar rankraštinio rengimo

konkuruojančių interesų:.. Autoriai paskelbė, kad konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Nesfatin-1 [NEFA /NUCB2 -encoded sotumo ir riebalų įtaką baltymų 1] yra stiprus anorexigenic peptidas susijęs energijos balanso ir gliukozės homeostazės [1] reglamento [30]. Ji yra 82 aminorūgščių peptidas kilęs iš baltymo pirmtake, nucleobindin-2 (NUCB2) [1]. NUCB2 yra sudarytas iš 396 amino rūgščių, sudarytas iš dviejų EF rankų fragmentais ir DNR rišantis domenas [1], [3]. Potransliacinis tvarkymas prohormoniniai convertases (PC 03/01 ir PC 2) sukelia NUCB2 būti suskaldyti į tris peptidų, nesfatin-1 (1-82 aminorūgščių), nesfatin-2 (85-163 aminorūgščių), ir nesfatin- 3 (166-396 amino rūgštys). NUCB2 /nesfatin-1 aminorūgščių seka yra labai konservatyvumo visuose stuburinių [6], [7], [31]. NUCB2 /nesfatin-1 randamas įvairių pogumburio branduolius, kurie yra susiję energijos apykaita, pavyzdžiui, arkinės branduolį, paraventricular branduolį, supraoptic branduolį, šoninė pagumburio srityje ir zona increta [8], [9]. Insulino gaminti beta ląstelės bendrai Express nesfatin-1 kasos salelių žiurkių ir pelių [2], [4], [11], o tai rodo, kad nesfatin-1 galėtų atlikti svarbų vaidmenį insulino sekrecijos ir gliukozės homeostazės [4], [29]. Ghrelin ir NUCB /nesfatin-1 yra colocalized skrandžio oxyntic gleivinės liaukų graužikams [13], ir žmonės [16]. NUCB2 iRNR raiška išgrynintų skrandžio gleivinės endokrininių ląstelių buvo nustatyta, kad daugiau nei žiurkių [13] smegenis. Pilnas ilgis NUCB2 baltymas pastebėta plonųjų ir storųjų žarnų ir kepenų žiurkių patinams ir ICR pelių [5]. Platus platinimas NUCB2 /nesfatin-1 centrinės ir periferinės audinių kiekis į už nesfatin-1 vaidmenį reguliuojant medžiagų apykaitą.

Kasdien vartojamas nesfatin-1 sukelia ilgesnį sumažinti suvartojamo maisto kiekį ir kūno svorį [1] , Intracerebroventricular administravimas NUCB2 slopina maistą, kūno svorį ir poodinio, mezenterinėse ir antsėklidžio riebalų masę suaugusių žiurkių priklausomai nuo dozės. Be to, NUCB2 nokdaunas žiurkių lašinant Priešprasminis morfolino oligonukleotido (AS-MON), kurį sukelia apetito ir kūno svorio [1] padidėjimą. Vidiniai paraventricular branduolys injekcija nesfatin-1 sumažina kaupiamąjį maistą ne 1 ir 3 val [9]. Pilvaplėvės ertmę, injekcijos nesfatin-1 lėmė maisto suvartojimo mažinimo atsparios leptino, dB /dB
pelių ir aukštos riebalų dietos šeriami pelių [8]. Nesfatin-1 susideda iš 3 struktūrinių fragmentų ir tik viduryje fragmento (Likučiai 24-53; M30) Iš nesfatin-1 dalyvauja gaminant Anorectic atsakymus [15], [28]. Kartu šie rezultatai pateikti aiškius įrodymus, kad parama sotumo poveikis nesfatin-1.

Nesfatin-1 yra miltai reaguoja gliukozės reguliacijos hormonas [12], [13], ir kasos salelių žiurkių išleisti NUCB2 atsakas į gliukozę [14]. Be žmonių tyrimai, gliukozės traktuojami dalykai turėjo didesnes bazinių nesfatin-1 lygį, palyginti su kontrolinės grupės tiriamųjų [10]. Į MIN6 ląstelių, 4 kartus didesnis nei nesfatin-1 lygiu buvo pastebėta, kai ląstelės buvo inkubuojami į aukštą gliukozės (16,7 mm), palyginti su mažo gliukozės (2,0 mM) [4]. Nesfatin-1 sustiprintas gliukozės stimuliuojama insulino išsiskyrimą iš išaugintų MIN6 ląstelių, kurios buvo inkubuojami aukštos gliukozės nei mažo gliukozės priklausomai nuo dozės [4]. Siekiant streptozotocin kasos (STZ) -injected peles su 1 tipo cukriniu diabetu, buvo nustatyta, kad tiek NUCB2 ir preproinsulin iRNR raiška buvo žymiai mažesnis [4]. Priešingai, sustiprintas nesfatin-1 kartu lokalizacija su insulinu rastas salelių beta ląstelių aukštos riebalų dietos sukeltas nutukusių pelių, sergantiems 2 tipo diabetu. Nesfatin-1 yra audinių specifinių poveikį gliukozės įsisavinimo žiurkių adipocitų ir raumenų [30]. Apskritai, nesfatin-1 daro svarbų vaidmenį reguliuojant viso kūno gliukozės ir energijos homeostazę.

Nors nesfatin-1 iškyla kaip svarbus valgio reaguoja peptido [1], [12], [13], [30] , kas sukelia jo sekrecija lieka neaiškus. Kas dieta komponentai sukelti po valgio sekreciją nesfatin-1? Šis klausimas lieka neliesti. Pagrindinis dėmesys šiame tyrime yra nustatyti, kaip skirtingos maistinės medžiagos gali moduliuoti NUCB2 /nesfatin-1 in vitro
kultūringas skrandžio ghrelinoma (MGN3-1) ląsteles nuo pelių ir vivo
vyriškos pelių. Mūsų rezultatai iš mūsų in vitro
tyrimai rodo, kad MGN3-1 ląstelės skirtingai reaguoti į maistinių medžiagų išskiriančių NUCB2 /nesfatin-1 ir ghrelin. Be to, ūminis ar lėtinis suvartojamų maistinių medžiagų daro įtaką NUCB2 iRNR raiška ir NUCB2 /nesfatin-1 išsiskyrimą dietos specialiu būdu.

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimas

Visi tyrimai, naudojant gyvūnus laikomasi Kanados tarybos gyvūnų priežiūros gairių ir buvo patvirtinti gyvūnų tyrimų etikos tarybos Saskačevano universitete (protokolo numerį 2012-0033).

in vitro
studijų

Pelės skrandžio ghrelinoma (MGN3-1) ląstelių [17] buvo auginamos DMEM (Invitrogen, Ontarijas, Kanada; Katalogas.995-040), kuris buvo papildytas 10% vaisiaus jaučio serumo (Invitrogen; Katalogas|84 ) ir 1% penicilino V (100 V /ml) ir streptomicino (100 mikrogramų /ml) (Invitrogen; Katalogas—40-122), esant 37 ° C 10% CO _{2. 80% susiliejimo, MGN3-1 ląstelės buvo pasėtos po 6 × 10 ^{6 ląstelių /gerai 12 šulinėlių plokštelės ir tyrimai buvo atlikti, kai ląstelės buvo 80-90% susiliejantis. Kiekvienas tyrimas buvo pakartotas tris kartus ir iš trijų tyrimų duomenys buvo sujungtos gauti n = 9-12 duobių /procedūrų. Norėdami nustatyti, ar gliukozės turėjo dozės ir laiko priklausomu būdu poveikį, ląstelės inkubuojamos 1 valandą 2 valandas su 5,6, 25, 50, ir 100 mm gliukozės DMEM žiniasklaida. Pilnas auginimo terpė iš MGN3-1 ląstelių reikalauja, kad jie turi būti auga dideliu gliukozės lygiu, kuris yra 25 mm. Atsižvelgiant į atliktų su riebalų rūgščių ir amino rūgščių tyrimus, mes atliekame šiuos tyrimus per DMEM žemoje gliukozės koncentracija (5,6 mm), nes naudojant aukštos gliukozės terpę (25 mm) gali maskuoti atitinkamų maistinių medžiagų poveikį NUCB2 /nesfatin -1 sekrecija ir sintezė. Atsižvelgiant į ilgos grandinės riebalų rūgščių, mes išbandė trijų skirtingų riebiųjų rūgščių, naudojant linoleno rūgšties (Sigma-Aldrich, Ontarijas, Kanada; Prekės # L2376) poveikį, oktano rūgštis (Sigma-Aldrich; Prekės # C2875) ir oleino rūgštis ( "Sigma -Aldrich; Prekės # O1383). Ląstelės buvo inkubuojamos 4 valandas su kiekviena riebalų rūgščių 0, 1, 10, 100 mikromolių. Mes naudojome L-triptofanas (Sigma-Aldrich; Prekės # T8941) išbandyti amino rūgšties NUCB2 sekrecijos ir sintezės poveikį. Ląstelės buvo inkubuojamos 4 valandas, kur L-triptofano 0,7, 1, 10 mM. L-triptofanas yra pateikti valdymo terpe (5.6 mmol gliukozės DMEM) būtų bent dozės 0,7 mm, kuris yra labai svarbus jų augimui būklės.}}

Vivo
studijų

lėtinio maitinti dietų sudėtyje yra įvairaus kiekio specifinės maistingos medžiagos, amžius ir svoris atitikimo (5 savaičių amžiaus, vidutinio kūno svorį: 20 g) Vyrams C57BL /6 pelėms (Charles River laboratorijos, Kvebekas, Kanada) buvo laikomi atskirai 17 savaičių per 12 valandų šviesos: 12 valandų tamsos ciklas (šviesas išjungti 7 val ir apie 7 val), kontroliuojama temperatūra ir drėgnis vivariumas. Pelių buvo suskirstyti į keturias grupes, maitinamų ant kontrolinę (n = 6), aukštos angliavandenių (n = 7), didelis baltymų (n = 7), ir aukštos riebalų (n = 7) dieta su iki soties
prieigos prie vandens ir konkrečios jų mityba. Visos dietos buvo įsigytas iš mokslinių tyrimų Dietos (New Brunswick, NJ). Kalorijų kiekis dietų buvo: kontrolė (Prekės # D12451): 4,73 kcal /gm su 20% energijos, gautos iš baltymų, 35% energijos, gautos iš angliavandenių ir 45% energijos, gautos iš riebalų; aukštos angliavandenių (Prekės # D12450J) turėjo 3,8 kcal /gm su 20% energijos, gautos iš baltymų, 70% energijos gaunama iš angliavandenių ir 10% energijos, gautos iš riebalų; didelis baltymų (Prekės # D08091802) turėjo 3,8 kcal /gm su 60% energijos, gautos iš baltymų, 30% energijos gaunama iš angliavandenių ir 10% energijos, gautos iš riebalų ir daug riebalų (Prekės # D12492) turėjo 5.2 kcal /gm su 20% energija, kuri kyla iš baltymų, 20% energija, kuri kyla iš angliavandenių ir 60% energijos, gautos iš riebalų. Visi pelėms buvo šeriami su kontroline dieta vieną savaitę, prieš pradedant jų specifinius mitybos. Maistą, kūno svorį ir gliukozės kiekį kraujyje rodmenys rašyti 4 val greitai buvo matuojamas kartą per savaitę 17 savaites

ūminės administravimo maistinių medžiagų, amžiaus ir svorio atitikimas (5 savaičių amžiaus, vidutinio kūno svorio.: 20 gramų) Vyriška C57BL /6 Pelės (Charles River laboratorijos, Šv Pastovus, Qu, Kanada) buvo laikomi atskirai 1 savaitė ir 2 dienų 12 h šviesos: 12 val tamsos ciklas (šviesas išjungti 7 val ir 7 val ), temperatūra ir reguliuojamos drėgmės vivariumas. Pelės buvo aklimatizavosi 1 savaitę atvykus ir turėjo iki soties prieigą prie vandens ir reguliariai pelės čiau už 11 dienų. Kadangi mes atlikti ūmaus mitybos tyrimą, mums reikia, kad gyvūnai aklimatizuotis prie per zondą tvarka. Mes aklimatizavosi peles į šią procedūrą gavaging juos su vandeniu iš čiaupo 2 dienas prieš eksperimentinės dieną. Dėl 12 ^{-oji dieną, pelės buvo badavusios 4 valandas ir buvo gavaged su konkrečiu skysčių dieta. Pelėms buvo suskirstyti į 4 grupes: Aukštas baltymų (Isopure Baltymų gėrimas, nulis angliavandenių - "Mango" persikų skonio, gamta Geriausias Clifton Park, Niujorkas, n = 7), Didelis riebalų (Splendido; šalto spaudimo Extra Virgin alyvuogių aliejus; Prezidento pasirinkimas , Kanada, n = 7), Aukštas angliavandenių (D-gliukozė; BioShop; Catlogue # GLU501.500, n = 7), ir vandens (vandentiekio vanduo, n = 7). Remiantis tyrimo dieną, 200 mikrolitrų iš pirmiau minėtų maistinių medžiagų /vandens buvo skiriamas į pelių per zondą. Kraujo gliukozės rodmenys buvo padarytas 0, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90 ir 120 minučių, ir kraujas buvo surinkti 15, 30, 60, ir 120 minučių pagal ELISA analizę ir nustatyti koncentraciją kraujyje NUCB2 /nesfatin -1. Audiniai (skrandžio, plonosios žarnos [dvylikapirštėje žarnoje], storosios žarnos ir kepenų) buvo renkami iš kiekvienos pele Nutraukus tyrimą (giliųjų izofluranas eutanazijos po slankstelių dislokaciją). Siekiant išlaikyti nuoseklumą, laikas ir kiekvieno bandymo trukmė, operacijos ir pavyzdžių rinkinys, buvo išlaikoma pastovi visų tyrimų.}

Iš viso RNR gavyba ir kDNR sintezės

Ląstelės arba audiniai buvo renkami iš kiekvieno tyrimo palyginti NUCB2 iRNR išraiška. Nuo pelių, kurios buvo atliktas lėtinis dietos tyrimą, audinius (skrandžio, plonosios žarnos, storosios žarnos ir kepenų) buvo paruoštos iš karto po eutanazijos. Iš viso RNR buvo išskirta iš MGN3-1 ląstelių ir audinių, naudojant TRIzol RNR išskyrimo reagento (Invitrogen). RNR grynumas buvo patvirtintas optinis tankis (OT) sugerties koeficiento (OT 260 nm /OT 280 nm), naudojant NanoDrop 2000C ( "Thermo, Vantaa, Suomija). Tik mėginiai, kurių absorbcijos santykis didesnis kaip 1,8 buvo naudojami sintezei. Sintezė kDNR buvo atliekami naudojant iScript kDNR sintezės rinkinys, kaip nurodyta gamintojo (BioRed, Kanada).

AT-PGR ir kiekybinius realaus laiko PGR

AT-PGR ir KRL-PGR už NUCB2, ghrelin ir AT-PGR PC 1/3 ir kompiuteris 2 buvo atlikti pagal 1 lentelėje nurodytos sąlygos, naudojant CFX Connect realiojo laiko PGR aptikimo sistema (Bio-rad). Dėl KRL-PGR analizei, iRNR raiška NUCB2 normalizavosi naudojant beta-aktino kaip namų ruošos geno. PGR produktai NUCB2 skrandyje, kepenyse ir storojoje žarnoje ir šių genų (NUCB2, ghrelin, Kompiuteriu 1/3 ir kompiuteris 2) į MGN3-1 ląstelių buvo elektroforezė į 1% agarozės gelyje patikrinti išklotines papildomi. Remiantis ankstesnių tyrimų [4], mes panaudojome beta-aktino kaip vidaus kontrolės normalizuoti NUCB2 mRNR signalą. Kai naudojate bendrą RNR kur iRNR įvertinimas buvo labai tikslūs, kritinės ribinės vertės už beta-aktino neparodė kintamumą. Santykinis NUCB2 iRNR raiška normalizavosi su beta-aktino iš to paties mėginio pagal Livak metodas [31].

imunocitocheminiais and mikroskopija

MGN3-1 ląstelės buvo auginamos tam Labtek kamerinis Pristatymas sistemos (Nalge Nunc International ", Rochester, NY), ir buvo leista auginti iki beveik susiliejimo. Ląstelės buvo išplauti su 1X fosfatas buferinis tirpalas (PBS; 2 × 5 minutes, 25 ° C) ir nustatyta 4% paraformaldehido (PFA) tirpalas 1X PBS 10 minučių 25 ° C temperatūroje, po kurio eina kita plovimo su 1X PBS ( 3 × 5 minučių, 25 ° C). Ilgalaikio ląstelės buvo laidžiomis į 0,3% Triton-X (Bioshop, Burlington, Ontario, Kanada) į 1X PBS tirpalo 5 minučių kambario temperatūroje. Skaidres buvo inkubuojamos su blokuojančiu buferiu, kurių sudėtyje yra 10% ožkų serume 1X PBS 1 valandą kambario temperatūroje. tada ląstelės buvo inkubuojami pirminėje antikūno (2 lentelė), esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Skaidrės buvo plaunami PBS (3 × 5 minutes, 25 ° C) ir inkubuojama su antriniais antikūnais (2 lentelė; Pc1 /3 antikūnų buvo dosni dovana dr Iris Lindberg universiteto Maryland School of Medicine) 4 valandas kambario temperatūra. Galiausiai, skaidres buvo plaunami PBS (3 × 5 minutes, 25 ° C) ir montuojamos Vectashield montavimo terpėje, turinčioje 4 ", 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (Vector Laboratories, Burlington, Ontario, Kanada).

Ląstelės buvo peržiūrėti naudojant Nikon Eclipse Ti apverstą fluorescencijos mikroskopu (Nikon, Mississauga, Ontarijas, Kanada) ir vaizdai buvo užfiksuoti naudojant "Nikon" DS-Qi1 MC kamerą ( "Nikon"). Vaizdai buvo analizuojami naudojant NIS-Elements fundamentiniai tyrimai programinę įrangą ( "Nikon"), ant Dell HP Workstation. Parodyti vaizdai, kurie yra atstovaujamosios ląstelės tamsintas už ghrelin, NUCB2, PC 1/3 ir PC2. Aukštos rezoliucijos vaizdo ląstelės buvo žiūrima, analizuojama ir vaizdus užfiksuoti naudojant Leica TCS SP5 mikroskopas.

Vakarų dėmė analizė, imunohistocheminis ir Fluorescencinis mikroskopija

patvirtinantis nucleobindin-2 buvimą (NUCB2) žarnyne ir kepenyse, trys, 3 mėnesių amžiaus C57BL /6 pelių patinams buvo naudojami. Trumpai, kepenys, ir mažąsias ir didžiąsias žarnas buvo surinkti, ir atskirti Vakarų analizės arba imunohistocheminiu. Audinių Vakarų dėmė homogenizuoti, T-PER audinių baltymų išskyrimo reagento (Thermo Scientific,N.510), po baltymo koncentracija ryžto Bradfordo metodu. Bandiniai buvo parengta 1X Laemmli buferio kuriame yra 0,2% 2-merkaptoetanolio (Bio-Rad,¡-0737 ir -0710), o vėliau buvo virtas 95 ° C temperatūroje 5 min po purtant. Visas mėginys tūris (20 pl) kiekvienoje yra 50 mikrogramų baltymo arba sintetinis žiurkė nesfatin-1 (ABGENT, 1μg /mikrol; anksčiau buvo naudotas 4, 29) buvo pakrautas ant geliu, ir paleisti į Mini Protean TGX 8-16 % gradiento gelio (Bio-Rad,Lj-1104). Po atskyrimo, baltymai buvo perkelti į 0,2 mkm BioTrace nitroceliuliozinio membranos (Pall Gyvosios gamtos mokslai,.377-000) ir tada membrana buvo blokuojami 1X RapidBlock tirpalo (AMRESCO, # M325). NUCB2 baltymų aptikimo atlikta naudojant triušio prieš nesfatin-1 (katalogo numeris H-003-22; 1:500 praskiedimo; Phoenix farmacija, Kalifornija) ir GAPDH baltymas buvo aptiktas naudojant triušio antiserumu nukreipta prieš pelės GAPDH (AbDSerotec, # AHP1628 ) atskiesti 1:1000. Kaip antrinio antikūno, ožkų kovos su triušio IgG (H + L) HRP konjugato (Bio-Rad,ª-6515) praskiesto 1:3000 buvo naudojamas. Baltymų vizualizacija membrana buvo inkubuojami 5 min Aiškumas Vakarų ECL substrato (Bio-Rad,ª-5061) ir nufotografuota naudojant ChemiDoc MP vaizdo gavimo sistema (Bio-Rad,ª-8280) su cheminės liuminescencijos aptikti. Membrana išpardavimas tarp baltymų aptikimo buvo atliekami naudojant Atkurti PLIUS Vakarų dėmė išpardavimas buferis ( "Thermo Scientific",ǐ30). Tiksliosios plius baltymų dviejų Xtra standartai (Bio-Rad,¡-0377) buvo naudojami kaip molekulinės masės žymekliais.

Imunohistocheminiais tyrimais, audiniai surinkti buvo nustatytas 4% formaldehido 24 valandas esant 4 ° C temperatūroje. Fiksavimo buvo pakeistas su etanoliu (trijų 70% etanolio), po kurių kiekvieno 10 minučių inkubacijos 4 ° C temperatūroje. tada audiniai buvo saugomi 70% etanolio, esant 4 ° C ir buvo tvarkomi ir suskirstyta į Prairie diagnostikos paslaugas Inc. "(PDS Inc., Vakarų kolegijos Veterinarija, University of Saskatchewan). Parafino skyriai 4 mkm storio buvo parengta imunodažymu. Šios sekcijos buvo deparaffinized su ksileno (inkubuoto du kartus per 100% ksileno; 5 minutes, 25 ° C) ir rehidrataciją diferencijuotai etanolio serijos (inkubuoto du kartus per 100% etanolio, ir vieną kartą per 95% etanolio, 70% etanolio, 50% etanolis; 2 minučių kiekvieną, 25 ° C). tada dalys buvo inkubuotos su 3% vandenilio peroksido distiliuotu vandeniu, kad blokuoti endogeninio peroksidazės aktyvumo (30 minučių kambario temperatūroje). tada skyriai buvo blokuotos serumo neturinti baltymų blokas reagento (DAKO Corporation, California) 10 minučių prieš juos į inkubatorių su pirminių antikūnų. tada šie dalys buvo inkubuotos su triušio anti-nesfatin-1 (katalogo numeris H-003-22; 1:500 atskiedimą; Phoenix medikamentai, California) už 24 valandas kambario temperatūroje. Visi skaidres vėliau buvo tris kartus plaunamos 1x PBS ir inkubuojami su ožka prieš triušio Texas Red IgG (Red-Nesfatin-1; Katalogo numeris TI-1000; 1:100 skiedimą; Vector Laboratories, Kalifornija) antriniais antikūnais 1 valandą kambario temperatūra. Visi pirminiai ir antriniai antikūnai, praskiesto antikūnų skiediklio reagento (DakoCytomation, Mississauga, Ontarijas). Skaidres tris kartus buvo plaunamos su 1x PBS ir septynis kartus su distiliuotu vandeniu. Galiausiai, skaidres buvo sumontuoti su Vectashield laikmenoje, kurios sudėtyje yra branduolinės dažų DAPI (mėlynos Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornija). Skyriai buvo peržiūrėtas pagal "Nikon" Eclipse "Ti-El apversto fluorescencijos mikroskopu (Nikon Kanada, Mississauga, Kanada). Vaizdai buvo užfiksuoti naudojant "Nikon" DS-QI1 MC atvėsintą vienspalvę kamerą, prijungtą prie "Dell" HP Workstation kompiuterio ir NVS elementų fundamentiniai tyrimai vizualizavimo programinės įrangos ( "Nikon Kanada, Mississauga, Kanada). Vienintelis atstovas vaizdai plonojo ir storojo žarnyno dažymą už NUCB2 /nesfatin-1 su DAPI rodomi rezultatų skyriuje.

Nesfatin-1 /NUCB2 lygiai serume ir žiniasklaidos

Jei ištirti maistinių medžiagų priklausomas pokyčiai NUCB2 /nesfatin-1 sekrecijos iš MGN3-1 ląstelių, žiniasklaidos buvo surinkta po tam tikrų inkubacinio laikotarpio. Siekiant užkirsti kelią ląstelių nuolaužų, mėginiai buvo centrifuguojamas (13000 rpm 10 minučių, esant 4 ° C), o viršutiniame 700 pL buvo laikomi -20 ° C temperatūroje, kol nesfatin-1 matavimo. Matavimo cirkuliuojančių NUCB2 /nesfatin-1, kraujas buvo surinkta 7 tarifu (netrukus po to, kai šviesos fazė prasideda), 1 val (viduryje šviesos fazės) ir 7 p.m (prieš į tamsų etapo pradžios). Kraujo mėginiai buvo leidžiama sukrešėti, ant ledo, ir serumo buvo atskirtas centrifuguojant (7000 apsisukimų per minutę 9-ąją minutę, esant 4 ° C) ir laikomi -20 ° C, kol vyko analizei. NUCB2 /Nesfatin-1 sekrecijos lygis žiniasklaidoje buvo matuojamas naudojant Nesfatin-1 (1-82) (žiurkė) IFA komplektas (katalogo numeris EK-003-22 Phoenix farmacija Inc, Kalifornija). Taikomos analizės jautrumo riba buvo 1,2 ng /ml intervale nesfatin-1, su aptinkamo intervale nuo 0.1-1000 ng /mL. Iš imunoreaktyviųjų medžiagos kiekis buvo nustatomas naudojant netiesinės regresijos kreivės-Fit, kuri buvo naudojama kiekybiškai ir palyginti NUCB2 /nesfatin-1 sekrecijos koncentraciją serume ir žiniasklaidos pavyzdžius.

NUCB2 /Nesfatin- 1 kiekis serume ir žiniasklaidos viso ghrelin lygių žiniasklaidos

ištirti maistinių medžiagų priklausomus pasikeitimus NUCB2 /nesfatin-1 ir viso ghrelin sekrecija iš MGN3-1 ląstelių, žiniasklaidos buvo surinkta po tam tikrų inkubacinio laikotarpio. Siekiant užkirsti kelią ląstelių nuolaužų, mėginiai buvo centrifuguojamas (13000 rpm 10 minučių, esant 4 ° C), o viršutiniame 700 pL buvo laikomi -20 ° C temperatūroje, kol NUCB2 /Nesfatin-1 ir bendro ghrelin matavimo. Kraujo mėginiai buvo leidžiama sukrešėti, ant ledo, ir serumo buvo atskirtas centrifuguojant (7000 apsisukimų per minutę 9-ąją minutę, esant 4 ° C) ir laikomi -20 ° C, kol vyko analizei. NUCB2 /Nesfatin-1 sekrecijos lygis serume ir žiniasklaida buvo matuojamas naudojant Nesfatin-1 (1-82) (žiurkė) IFA komplektas (katalogo numeris EK-003-22 Phoenix farmacija Inc, Kalifornija). Taikomos analizės jautrumo riba buvo 1,2 ng /ml intervale nesfatin-1, su aptinkamo intervale nuo 0.1-1000 ng /mL. Be to, bendra ghrelin sekrecijos lygis žiniasklaidoje buvo matuojamas naudojant ghrelin (žiurkėms, pelėms) PAV komplektas (Katalogo numeris EK-031-31 Phoenix farmacija Inc ", Kalifornija). Taikomos analizės jautrumo riba buvo 1,16 ng /ml intervale viso ghrelin, su aptinkamo intervale nuo 0-100 ng /mL. Iš imunoreaktyviųjų medžiagos kiekis buvo nustatomas naudojant netiesinės regresijos kreivės-Fit, kuri buvo naudojama kiekybiškai ir palyginti NUCB2 /nesfatin-1 sekrecijos koncentraciją serume ir žiniasklaidos pavyzdžius.

Statistinė analizė

analizė kiekybinių KRL-PGR ir ELISA duomenų buvo atliekamas naudojant ANOVA po Tukey anketa kelių palyginimo bandymas. GraphPad PRISM 5 versija (GraphPad Programinė įranga registravo, San Diegas, CA, JAV) buvo naudojamas statistinės analizės ir grafikus. Reikšmė buvo priskirtas, kai p < 0,05. Duomenys pateikti kaip vidurkis ± SEM.

Rezultatai

NUCB2, PC 1/3 ir PC 2 mRNR yra išreikštas MGN3-1 ląsteles ir NUCB2 iRNR yra išreikšta skrandžio, kepenų, mažas žarnos ir storosios žarnos vyrų pelės

identifikuojamos išraišką NUCB2 (202 bp), prohormoniniai convertase 1/3 (400 bp) ir prohormoniniai convertase 2 (406 bp) mRNR iš MGN3-1 ląstelių (pav. 1A). NUCB2 (202 bp) mRNR išraiška taip pat buvo aptikta skrandžio, kepenų, plonųjų žarnų ir storosios žarnos vyrų C57 /BL6 pelių (pav. 1B). Absoliučios lygiai NUCB2 iRNR išraiškos skrandyje buvo didesnis nei NUCB2 iRNR išraiškos kepenyse, plonųjų žarnų ir storosios žarnos (1C pav.).

MGN3-1 ląstelės yra imunoteigiamų už ghrelin, NUCB2 /Nesfatin-1 , Kompiuteriu 1/3 ir kompiuteris 2

Fluorescencinis mikroskopas rodomas MGN3-1 ląsteles tamsintas su anti-nesfatin-1 antikūnas (Texas-raudona; 2B pav.) ir anti-ghrelin antikūnų (FITC-žalia; pav. 2A) parodė aiškią bendrą lokalizacija (Geltona; pav. 2c) nesfatin-1 ir ghrelin reaktyvumas. Tačiau, kai ghrelin teigiamos ląstelės buvo ne imunoreaktyvi už nesfatin-1 (pav. 2C). MGN3-1 ląstelės parodė PC 1/3 reaktyvumas (Texas Red; pav. 2d) ir PC 2 reaktyvumas (Texas Red pav 2e.). DAPI (Mėlyna) tamsintas visų ląstelių, įskaitant tų ląstelių nėra teigiamas baltymų mokėsi branduolį. Kontrolės skaidres nudažytos vien tik antriniais antikūnais (2F pav.) Neturėjo reaktyvumas. Confocal vaizdo parodė MGN3-1 ląsteles tamsintas su anti-nesfatin-1 antikūnas (Teksasas Raudona;. 3A pav) (. FITC žalia; 3B pav) ir anti-ghrelin antikūnų parodė aiškią bendrą lokalizacija (Geltona;. 3C pav) iš nesfatin-1 ir ghrelin reaktyvumas. Neigiama kontrolė yra tamsintas su vien tik antrinių antikūnų (3D pav.).

NUCB2 baltymų ekspresija storojoje žarnoje, plonosiose žarnose ir kepenyse nuo pelių patinams

NUCB2 baltymas yra išreiškiamas storojoje žarnoje, plonosiose žarnose ir kepenyse iš pelių patinams, rodančių atskirą juostą NUCB2 atitinka maždaug 50 kDa. Žiurkė nesfatin-1 peptidas naudojamas kaip teigiama kontrolė yra parodyta kaip atskira juosta atitinka maždaug 10 kDa (pav 4A;. Kairiuoju vaizdas). Tačiau jokių juostų, rodantys visiškai tvarkomi nesfatin-1 buvo matomas 10 kDa audinyje mėginių (pav 4A,. Kairiuoju vaizdą). Mes taip pat nustatė, juostų maždaug 47 kDa po 50 kDa juostos plonosiose žarnose ir kepenyse, bet ne storojoje žarnoje (4A pav;. Kairėje esantis vaizdas). Ryškus juosta GAPDH naudojamas kaip kontrolinis namų palaikymo geno yra stebimas 37 kDa parodyta visuose audiniuose (pav 4A;. Dešinėje vaizdo). NUCB2 /nesfatin-1 reaktyvumas yra rasti gleivinės ląstelių plonosiose žarnose (pav 4B;. Liko vaizdą) ir storosios žarnos (pav 4B;. Dešinėje vaizdas).

Efektai gliukozės ir L-triptofanu ant NUCB2 iRNR raiška ir NUCB2 /nesfatin-1 sekrecijos iš MGN3-1 ląstelių

ląstelės inkubuojamos 100 mm gliukozės DMEM turėjo didesnį NUCB2 iRNR raiška nei ląstelių inkubuojami 5,6, 25 ir 50 mm DMEM gliukozės koncentraciją; 1 veikia po inkubacijos (5A pav.). Po 2 valandų po inkubacijos ląstelės inkubuojamos 100 mm DMEM buvo žymiai didesnis NUCB2 iRNR išraiškos nei ląstelių inkubuojami 5,6 ir 50 mm gliukozės DMEM (. 5C pav). 1 valandos (pav. 5B) ir 2 valandas (5D pav.), Nebuvo jokių reikšmingų skirtumų NUCB2 /nesfatin-1 sekrecijos. NUCB2 mRNR išraiška buvo žymiai didesnis ląstelių inkubuojamos 10 mM L-triptofanas (pav. 5E), palyginti su ląstelių inkubuojami 0,07 ir 1,0 mM L-triptofanas. NUCB2 /nesfatin-1 sekrecijos iš ląstelių inkubuojami 1.0 ir 10,0 mM L-triptofanas buvo gerokai didesnis nei ląstelių inkubuojami 0.7 mm, L-triptofanu (pav. 5F).

poveikis linoleno rūgšties, oktano rūgšties ir oleino rūgšties NUCB2 iRNR išraiškos ir NUCB2 /nesfatin-1 sekrecijos iš MGN3-1 ląstelių

Mes radome NUCB2 iRNR raiška gerokai sumažėjo ląstelių gydomiems 1, 10 ir 100 mkm oleino rūgšties (6E pav.) palyginti su kontroliniu. Jokių NUCB2 mRNR pokyčių nenustatyta ląstelių, gydytų linoleno (6A pav.) Ir oktano rūgšties (6C pav.). Be to, NUCB2 /nesfatin-1 sekrecijos buvo nepakitęs ląstelių, gydytų skirtingų dozių linoleno rūgšties (6B pav.), Oktano rūgšties (6D pav.), Ir oleino rūgšties (6F pav.).

poveikis L-triptofanas, linoleno rūgšties, oktano rūgštis ir oleino rūgštis nepriklausomai ghrelin iRNR išraiškos ir viso ghrelin sekrecija iš MGN3-1 ląstelių

nėra ghrelin mRNR (S1A paveikslas), o visos ghrelin sekrecijos pokyčiai (S1B pav ) buvo rasta, kai ląstelės buvo gydomi skirtingų dozių gliukozės po 1 valandą inkubacijos. Ghrelin iRNR raiška buvo statistiškai reikšmingai didesnis ląstelių inkubuojami 1 mM L-triptofano (pav. 7a), lyginant su ląstelių inkubuojami 0,07 ir 10 mM L-triptofanas. Iš esmės nesiskiria viso ghrelin sekrecijos iš ląstelių, gydytų skirtingomis dozėmis L-triptofanas (7B pav.). Neradome į ghrelin iRNR išraiškos (7c pav.) Kaita, tačiau bendras ghrelin sekrecijos lygis buvo aukštas iš ląstelių inkubuojami 100 mkm linoleno rūgšties (pav. 7d), lyginant su kontrolės, 1 iki 10 mkm dozes. Nerastas nei į ghrelin mRNR (. 7E pav) ir visos ghrelin sekrecijos (7F pav.) pasikeitimus, kai ląstelės buvo gydomi įvairių dozių oktano rūgšties. Tuo tarpu, ghrelin iRNR (7H pav.), O bendras ghrelin sekrecija (7I pav.) Buvo reikšmingai didesnis ląstelių gydytų 100 mkm oleino rūgšties, lyginant su kontrole, 1 ir 10 mkm oleino rūgštimi.

Lėtinis poveikis maistinių medžiagų dėl NUCB2 iRNR išraiška ir serumo NUCB2 /nesfatin-1 pelių

kūno svorio, maistą ir gliukozės kiekis kraujyje aprašymą pelių šeriami įvairių dietų rodomi S2 paveiksle. Pelės maitinami aukšto riebalų kiekio dietos turėjo labai mažai išraiška NUCB2 mRNR skrandžio, palyginti su tais paduodamas dėl kontrolės, baltymais ar didelio angliavandenių dietos (8a pav.). Nebuvo didelio skirtumo į NUCB2 mRNR ekspresijos plonojoje žarnoje tarp pelių šeriami Kontrolei daug baltymų, aukštos angliavandenių arba labai riebaus dietos (8b pav.). Pelės paduodamas ant aukšto baltymų ir aukštos riebalų dietos yra palyginti mažas išraiška NUCB2 mRNR storojoje žarnoje nei pelių lesinamų kontrolės arba aukštos angliavandenių dietos (8c pav.). Pelės maitinami aukštos baltymų dietos turėjo didelę mažą raišką NUCB2 mRNR kepenyse nei pelių šeriami kitų dietų (pav. 8d). Tuo 7 tarifu, nebuvo serume skirtumai nesfatin-1 /NUCB2 lygiai pelėmis šeriami įvairias dietas (pav. 9a). Tuo 1 p.m, didelis angliavandenių dietos šeriami pelių buvo žymiai aukštesnio serumą nesfatin-1 /NUCB2 apyvartoje (pav. 9b). Serumas nesfatin-1 /NUCB2 buvo žymiai mažesnis pelės šeriami aukštos angliavandenių, daug baltymų arba labai riebaus, palyginti su kontroline dieta šeriami pelėms 7 val (9C pav.).

maistinių medžiagų Ūmios poveikis NUCB2 iRNR išraiškos , gliukozės kiekis kraujyje ir kraujo serume NUCB2 /nesfatin-1 pelių

nebuvo jokių reikšmingų pokyčių NUCB2 mRNR ekspresijos skrandyje (10a pav.), plonosiose žarnose (10B pav.), storosios žarnos (pav . 10C) ir kepenų (10D pav.) tarp pelių, maitinamų ant aukšto baltymų, aukštos angliavandenių, aukštos riebalų arba vandens.

• PLoS ONE: Koks Kapsulės endoskopų tinka reguliuojamo savaeigius Kapsulės endoskopu? Eksperimentinis tyrimas, naudojant kiaulės skrandžio Modelis klinikiniam (Video)
• PLoS ONE: Skrandis Temperatūros Įrašai Atskleisti Slauga elgesį ir perėjimo į kieto maisto vartojimas yra nenujunkyti žinduolis, uosto ruoniukas (Phoca vitulina)