Het proces van peritoneale metastasering betreft de diapedesis van intra-abdominale geëxpandeerd maagkanker cellen door de mesotheelcellen celmonolagen; De aanverwante moleculaire mechanismen van dit proces is nog onduidelijk. Heterocellulaire gap-junctional intercellulaire communicatie (GJIC) tussen maagkanker cellen en mesotheelcelsuppletie kan een actieve rol spelen tijdens diapedesis. In deze studie gedetecteerd we de expressie van connexine 43 (Cx43) in primaire maagkanker weefsel, intra-abdominale geëxpandeerd kankercellen, en afgestemd metastatische peritoneale weefsels. We vonden dat de expressie van Cx43 in primaire maagkanker weefsels aanzienlijk was gedaald; de intra-abdominale geëxpandeerd kankercellen en gekoppeld peritoneale metastatische weefsels vertoonden toenemende expressie vergeleken met primaire maagkanker weefsels. BGC-823 en SGC-7901 humane maagkanker cellen werden ontworpen om Cx43 of Cx43T154A Express (een mutant eiwit dat alleen koppels gap junctions, maar geeft geen intercellulaire communicatie) en werden co-gekweekt met humane peritoneale mesotheelcellen (HPMCs). Heterocellulaire GJIC en diapedesis met HPMC monolagen op Matrigel gecoate dekglaasjes werden onderzocht. We vonden dat BGC-823 en SGC-7901 maagkanker cellen die Cx43 gevormd functionele heterocellulaire gap junctions met HPMC monolagen binnen één uur. Een significante toename van diapedesis waargenomen in gemanipuleerde Cx43 tot expressie brengende cellen in vergelijking met Cx43T154A en controlegroep cellen die suggereerde dat de waargenomen opregulatie van diapedesis in Cx43 tot expressie brengende cellen vereist heterocellulaire GJIC. Nader onderzoek wees uit dat de maagkanker cellen transmigrated door de intercellulaire ruimte tussen de mesotheelcellen via een paracellulaire route. Onze resultaten suggereren dat de abnormale expressie van Cx43 een essentiële rol bij peritoneale metastasen en Cx43 gemedieerde heterocellulaire GJIC tussen maagkanker cellen en mesotheelcellen kan een belangrijke regulerende stap tijdens metastase speelt. Ten slotte hebben we geconstateerd dat de diapedesis geëxpandeerd maagkanker cellen door mesothelial barrières is een haalbare route van paracellulaire migratie
Visum:. Tang B, Peng Zh, Yu PW, Yu G, Qian F, Zeng Dz, et al. (2013) afwijkende expressie van Cx43 wordt geassocieerd met de peritoneale metastase van maagkanker en Cx43-Mediated Gap Junction Verbetert Gastric Cancer Cell diapedesis van peritoneale Mesothelium. PLoS ONE 8 (9): e74527. doi: 10.1371 /journal.pone.0074527
Editor: Johanna M Brandner, Universitair Ziekenhuis Hamburg-Eppendorf, Duitsland
Ontvangen: 19 januari 2013; Aanvaard: 6 augustus 2013; Gepubliceerd: 11 september 2013
Copyright: © 2013 Tang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd
Financiering:. Dit werk werd ondersteund door subsidie No. 30801097 en nr 81272366 van de National Natural Science Foundation of China. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript
Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan
Introductie
De incidentie van maagkanker daalt maar blijft een belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd. De belangrijkste kenmerken van maagkanker cellen omvatten het invasieve en metastatische vermogen. Peritoneale metastase is een kritische functie voor progressie van de tumor in gevorderde maagkanker [1]. Tijdens het proces van peritoneale uitzaaiing, maagkanker cellen interageren intercellulair meerdere celtypes en de interactie van de intra-abdominale geëxpandeerd maagkanker cellen en de peritoneale mesotheelcellen van bijzonder belang. Continue humane peritoneale mesotheelcellen cel (HPMC) monolagen fungeren als een barrière tegen peritoneale metastasen, zodra de diapedesis geëxpandeerd maagkanker cellen door mesotheelcellen celmonolagen optreedt, zal de overvloedige bloedtoevoer in de matrix onder de mesothelium een comfortabele omgeving voor gemetastaseerde gastrische bieden kankercellen en hun kolonisatie bevorderen. Daarom diapedesis geëxpandeerd maagkanker cellen door de mesotheelcellen cel monolaag is een essentiële stap bij peritoneale metastasen. De interactie tussen de cellen wordt vergezeld door intercellulaire communicatie (IC), die voornamelijk wordt gemedieerd door cel-cel gap junctions [2]. Gap junctions gevormd door plasmamembraan connexines, die elk uit zes connexines (CXS) [3]. Tot op heden zijn 20 verschillende connexine isovormen geïdentificeerd bij de mens. Cx43 is een algemene isovorm tot expressie gebracht in de meeste epitheliale weefsels. Eerdere studies [4-6] aangegeven dat Cx43 expressie daalde in het ontstaan van tumoren en werd daarom geclassificeerd als een tumor suppressor. Er is echter een groeiende hoeveelheid bewijsmateriaal dat connexines betrokken kan zijn bij de intravasation en extravasatie van kankercellen en een positieve rol spelen in het proces van metastase [7,8]. Of de Cx43 gemedieerde gap junction een belangrijke rol bij diapedesis maagkanker cellen door de peritoneale mesotheelcellen barrière speelt blijft onduidelijk. Om de hypothese te pakken onderzochten we de expressie van Cx43 in primaire maagkanker weefsels, geëxpandeerd maagkanker cellen, en peritoneale metastatische weefsels. We construeerden een Cx43 expressie vector en een Cx43T154A website mutatie vector. Vervolgens gebruikten we twee menselijke maagkanker cellijnen (BGC-823 en SGC-7901) die deficiënt GJIC en veroorzaakt geen connexines tot expressie [9]. Omdat mesotheelcellen overvloedig tot expressie Cx43, we gemanipuleerde maagkanker cellen ofwel wildtype Cx43 of plaatsspecifieke mutant tot expressie te bepalen of het vermogen van diapedesis maagkanker cellen via mesothelium onder beide of een van deze voorwaarden zou veranderen. In deze studie tonen we aan dat Cx43 expressie upregulates tumorcel diapedesis via een GJIC-afhankelijk mechanisme
Materialen en methoden
2.1. Reagentia en antilichamen
Anti-connexine 43 polyklonaal antilichaam (Zymed, San Diego, CA, USA), Matrigel (Becton-Dickenson, Bedford, MA, USA), 1, 1'-diocta-decyl-3, 3, 3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine percholate (Dil; Molecular probes, Eugene, OR, USA), calceïne-AM (DOJINDO, Kumamoto, Japan) en FITC-geconjugeerde falloïdine werden gekocht bij Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
2,2 : weefselmonsters en cytologisch onderzoek
Alle deelnemers gaven schriftelijk toestemming (van hun voogden waar nodig). Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki en de bijbehorende amendementen en werd goedgekeurd door de ethische commissie van Zuidwest-ziekenhuis, het Derde Militaire Medische Universiteit. De onderzoekspopulatie bestond uit 42 patiënten die werden geclassificeerd als stadium IV volgens de zevende editie van UICC TNM classificatie Kwaadaardige tumoren. Clinicopathologische variabelen zijn weergegeven in Tabel 1. Alle patiënten in deze studie ondergingen palliatieve of kijkoperatie. Primaire tumor en metastatische peritoneale weefsels werden verzameld voor het einde van de operatie en geëxpandeerd maagkanker cellen werden geoogst door centrifugatie van ascites of peritoneale lavage vloeistof (als ascites niet bestond). De kernhoudende cellaag werd uitgesmeerd op een glasplaatje en gekleurd met hematoxyline en eosine (HE). Twee ervaren cytopathologen voerde de cytologisch evaluaties. CEA werd gebruikt als een biomarker te helpen identificeren adenocarcinoomcellen van immunofluorescentie met positieve kleuring. Cases werden uitgesloten van de studie als de bevindingen van beide cytopathologen waren niet in overeenstemming
groep
Nummer
procent (%)
Sex male2764.0 female1536.0Age (jaren) <.; 501.740,4 ≥502559.6Tumor locatie Antral2150.0 Body1228.6 Fundic911.4Pathological soort Nou differentiated24.7 Matig differentiated49.5 Slecht differentiated3685.8Bormann typen I00 II12.4 III1228.5 IV2969.1Ascites Yes1535.7 No2764.3Surgical aanpak palliatieve gastrectomy2457.1 verkennend + biopsy1842.9Table 1. Klinische en pathologische kenmerken van de 42 gevallen van patiënten met maagkanker
CSV Download CSV
2.3. Immunohistochemie
Paraffine weefselmonsters van primaire tumoren en metastatische peritoneale weefsels werden serieel coupes en HE kleuring bevestigde het bestaan van maagkanker. Opeenvolgende coupes werden ontdaan van paraffine, gedehydrateerd en onderworpen aan antigeenterugtrekking achtereenvolgens. De secties werden geïncubeerd met een konijn polyklonaal anti-Cx43 antilichaam gedurende 24 uur bij 4 ° C. Bindingsplaatsen werden gevisualiseerd met 3, 3'-diamino-benzidine (DAB) in een 5-minuten reactie. De secties werden tegengekleurd met hematoxyline van Mayer, uitgedroogd, gewist en gemonteerd. Weglating van het primaire antilichaam werd gebruikt als negatieve controle. Immunohistochemische kleuring werd geëvalueerd door toekenning van een score op basis van de omvang en intensiteit van immunoreactiviteit. Kleuring mate werd semiquantitatively geëvalueerd in het cytoplasma en het membraan als negatief (0, < 5% cellen gekleurd), positief 1 + (6-25% cellen gekleurd), positief 2 + (26-50% cellen gekleurd) of positieve 3 + ( > 50% cellen gekleurd). De kleuringsintensiteit werd gescoord als 0 (geen kleuring), 1 (zwakke kleuring, geelbruin), 2 (matig kleuring, geelbruin) of 3 (sterke kleuring, bruin). . Immunokleuring resultaten werden gescoord als de som van de omvang en de intensiteit van de immunologische, overweegt een score ≥3 positieve en een score < 3 negatieve
2.4: Immunofluorescentie
Cx43 expressie in intra-abdominale geëxpandeerd maagkanker cellen werd gemeten met immunofluorescentie. Tweeënveertig gevallen werden geïncludeerd in onze studie. De cellen uitgesmeerd op dekglaasjes werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde en gewassen met PBS dat 0,5% BSA (spoelbuffer). De cellen werden vervolgens gedurende 24 uur bij 4 ° C met een anti-Cx43 antilichaam (1: 150). De dekglaasjes werden gewassen en geïncubeerd met FITC-geconjugeerd geit anti-konijn secundair antilichaam. De kernen werden gekleurd met 10 ug /ml DAPI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). De dekglaasjes werden afgebeeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop (Siemens, Duitsland). De besturing (primaire antilichamen werden vervangen door PBS) waren negatief voor alle experimenten (gegevens niet getoond)
2,5. Celkweek en Stabiele expressie van Cx43 en Cx43 mutanten
nonmalignant geïmmortaliseerde humane mesotheelcellen , Met-5A, werden verkregen van ATCC. Deze cellen werden gehandhaafd en gekweekt in Medium 199 met 1,5 g /L natriumbicarbonaat, 10% foetaal runderserum, 3,3 nM epidermale groeifactor (EGF), 400 nM hydrocortison, 870 nM zinkvrije runderinsuline, 20 mM HEPES en 3,87 ug /L selenigzuur (H2SeO3).
de menselijke adenocarcinoom cellijnen BGC-823 en SGC-7901 werden verkregen uit het Shanghai Institute celbank, de Chinese Academie van Wetenschappen. Cx43- en Cx43T154A expressie vectoren werden geconstrueerd met behulp van lentivirale infectie. PTA2-Cx43, dat een Cx43-coderende sequentie humaan opgenomen, werd in ons laboratorium. De mutatie ter Cx43T154A vectorconstructie werd uitgevoerd onder toepassing van overlap-extensie PCR, waarbij een eiwit dat functioneert als een gap junction zonder IC gecodeerd zoals eerder beschreven [10]. Het cDNA van Cx43 en Cx43T154A werd in de Lenti-GFP vector en getransfecteerd in 293T de verpakkingscellijn. Lentivirale supernatant werd na 48 uur, gefiltreerd door een 0,45 urn-filter en gebruikt voor het infecteren BGC-823 en SGC-7901 cellen. Het medium werd vervangen met RPMI1640 24 uur na infectie, en de cellen werden routinematig gekweekt. Meer dan 90% van de tumorcellen tot expressie Cx43 of Cx43T154A na drie ronden van virale infectie; het succes geïnfecteerde cellen werden verzameld door flowcytometrie
2.6. Eiwit extractie en Western blotanalyse
De gemanipuleerde Cx43- en Cx43T154A expressie BGC-823 en SGC-7901 maagkanker cellen werden gelyseerd . Eiwit (50 ug) van elk celtype werd gescheiden op een 12% SDS-polyacrylamidegel en overgebracht naar nitrocellulose membranen. Nitrocellulose membranen werden geblokkeerd met 5% magere melkpoeder en vervolgens werden geprobed voor Cx43 eiwit onder toepassing van een polyklonaal anti-Cx43 antilichaam (1: 500). Immunoblots werden gehybridiseerd met de geschikte mierikswortel peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) bij een 1: 10.000 verdunning. De eiwitten werden gevisualiseerd met behulp van een SuperSignal West Pico Chemiluminescent substraat (Pierce Chemical Co.) en immunoblots werden blootgesteld aan Amersham Hyperfilm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) gedurende 30 s
2,7. Tumorcel /Mesothelial celadhesietest
Mesotheelcellen werden gekweekt tot monolaag confluentie op glazen dekglaasjes in 24-well platen. De gemanipuleerde Cx43- en Cx43T154A expressie maagkanker cellen werden gelabeld met 10 ug /ml Dil oplossing gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Dil is een veelgebruikte fluorescentieprobe die een oranje-rode fluorescentie in membranen toont en is gebruikt in onze studie maagkanker cellen te labelen. Deze gelabelde cellen werden vervolgens toegevoegd aan de mesotheelcellen celmonolagen en gedurende 1 uur bij 37 ° C. Hechtende cellen werden verwijderd door wassen en de cellen die aan de mesotheelcellen celmonolagen hadden gehecht werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde. De cultuur dia's werden gemonteerd in Mowiol (Calbiochem) en onderzocht met behulp van fluorescentiemicroscopie (Leica MPS 60)
2.8. Tumor Cell /Mesothelial Cell GJIC assay
De gemanipuleerde Cx43- en Cx43T154A expressie BGC-823 en SGC-7901 maagkanker cellen werden gelabeld gedurende 15 minuten bij 37 ° C met 2 ml Opti-MEM bevattende 10 ug /ml calceïne-AM en 10 ug /ml Dil. Calceïne-AM is een fluorescente substraat wordt gesplitst in levensvatbare cellen om een membraan ondoorlatend vorm die door middel van functionele gap junctions maar geen andere plasmamembraan kanalen kunnen passen. Mesotheelcellen celmonolagen werden voorbehandeld gedurende 4 uur met 150 pm carbenoxolon (CBX) om homotypische GJIC blokkeren en werden vervolgens behandeld gedurende 15 minuten met 10 ug /ml calceïne-AM (Molecular Probes) in een Opti-MEM oplossing. De goed bereid gemerkte maagkanker cellen werden toegevoegd aan de met-5A monolagen op de Matrigel en de heterotypische GJIC tussen de maagkanker cellen en de mesotheelcellen werd gedetecteerd. Fluorescentieherstel in gebleekte cellen zullen alleen optreden als kleurstof gaat door de gap junctions aangrenzende ongebleekte maagkanker cellen. Individuele mesotheelcellen naast maagkanker cellen werden gebleekt gedurende ongeveer 30 s onder toepassing van een Zeiss laser scanning confocale microscoop en een argon-laser bij 33% vermogen voor elke experimentele conditie. Single mesotheelcelsuppletie dat GJIC niet kunnen aantonen werden gekozen om blenching ondergaan als controles. Onbehandelde cellen werden gebruikt als achtergrond modificerende cellen. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de gebleekte /ongebleekte cellen werd gemeten in de tijd met behulp van Scion imaging software, en de fluorescentie recovery rate werd ook (Kt = (Ib-Ib0) berekende /Iu × 100%, Kt: fluorescentie recovery rate op tijdstip t; ib: de fluorescentie-intensiteit in de gebleekte cel op tijdstip t; Ib0: de fluorescentie-intensiteit in de gebleekte cel op tijdstip t = 0; Iu. fluorescentie-intensiteit in het aangrenzende ongebleekte cel op tijdstip t) [11]
2.9: transmesothelial migratie assay
De transmesothelial migratie test werd uitgevoerd, zoals eerder [12] beschreven. Kort samengevat, 1 x 10 5 Met-5A mesotheelcellen werden gezaaid in 12-mm dekglaasjes die werden gecoat met Matrigel (Becton-Dickenson, USA). Monolagen bereikt samenvloeiing zoals bepaald met behulp van licht microscopie. Dekglaasjes werden overgebracht naar een plaat met 24 putjes en werden gedurende 48 uur in EGM. Maagkanker cellen werden gescheiden door lege vector groep, Cx43 expressie groep, Cx43T154A expressie-groep en CBX voorbehandelde groep (Cx43 expressie maagkanker cellen werden voorbehandeld gedurende 4 uur met 150 pm carbenoxolon (CBX) te blokkeren homotypische GJIC) en voorzien van Dil . Ongeveer 1 x 10 5 cellen werden toegevoegd aan celmonolagen mesotheelcellen in een verhouding van 1:10 (tumorcel: mesotheelcellen cel). De cellen werden samen gekweekt gedurende verschillende tijden (1, 4 of 7 h) voorafgaand aan waarneming of fixatie en immunokleuring leven. Geblindeerde onderzoekers gekwantificeerd diapedesis LSM gebruikt, zoals eerder [7] beschreven. Kort werden co-kweken gefixeerd en gekleurd voor F-actine. Diapedesis werd gekwantificeerd als het aantal tumorcellen die in contact met de mesotheel waren en geclassificeerd in drie stadia aan de hand van hun positie ten opzichte van de mesothelium: 1) afgerond - tumorcellen met een sferische vorm op het apicale oppervlak van de mesothelium; 2) migreren - tumorcellen hadden via de mesotheelcellen celmonolagen in mesotheelcellen cel contacten gepenetreerd met een gedeelte van het cellichaam boven mesothelium en een gedeelte van het cellichaam spreads van de Matrigel onder de mesotheelcellen cel F-actine stressvezels; en 3) onder - de gehele tumorcel lichaam is onder het vlak van de mesotheelcellen celstress vezels. Migreren en daaronder cellen werden geclassificeerd als verhuizende. Ongeveer 100 mesothelium-hechtende cellen werden geregistreerd en geteld per dekglaasje en alle experimenten werden driemaal herhaald met drievoud dekglaasjes 2,10. Statistische analyse Alle statistische analyse werd uitgevoerd met het SPSS software ( versie 13.0). Waarschijnlijkheid van P < 0,05 werden als statistisch significant Resultaten 3,1. Cx43 expressie in primaire tumoren en gematched metastatische weefsels peritoneale Tweeënveertig normaal epitheel (100%) tot expressie Cx43 met typische membraneuze en cytoplasmatische kleuring (Figuur 1A). Elf van de 42 primaire tumoren (26,2%) waren positief voor Cx43, die aanzienlijk gedaald vergeleken met aangrenzend normaal epitheel (p < 0,05). Cx43 expressie was heterogeen in verschillende weefselmonsters: in goed gedifferentieerd maagkanker weefsels, Cx43 expressie toonde een grote gemengde (cytoplasma en membraneuze) kleuring (Figuur 1B); matig gedifferentieerde maagkanker weefsels slechts cytoplasmatische Cx43 expressie (figuur 1C); en Cx43 werd nauwelijks tot uitdrukking in slecht gedifferentieerde maagkanker weefsels (figuur 1D). Daarentegen werd Cx43 expressie significant verhoogd in 29 van de 42 peritoneale metastatische weefsels (69,0%) en vertoonde karakteristieke cytoplasmatische en membraankleuring (p < 0,05). (Figuur 1E) (tabel 2) 3.2: Cx43 expressie in intra-abdominale geëxpandeerd maagkanker cellen De meeste intra-abdominale geëxpandeerd maagkanker cellen bestaan als meercellige sferoïden (Figuur 1F). Cx43 positieve immunologische kleuring werd waargenomen in 35 van de 42 gevallen van intra-abdominale geëxpandeerd kankercellen met gemengde cytoplasmatische en membraankleuring en de positieve bedraagt 83,3% (figuur 1 G, H en I). maagkanker cellen werden om functionele Cx43, Cx43T154A en een lege lentivirale vector uitdrukken als een controle voor de effecten van Cx43 expressie op het onderzoeken biologische gedrag van deze cellen. Cx43 expressie afwezig was in de lege vector groep, maar de andere twee groepen werden gedetecteerd gemanipuleerde te geven via Cx43 of Cx43T154A (figuur 2A) 3,4. Hechtingseigenschappen van maagkanker cellen aan mesotheliale het effect van Cx43 op de hechting van maagkanker cellen aan de mesotheelcellen werd eveneens onderzocht. Gemanipuleerde maagkanker cellen die ofwel wildtype of Cx43 Cx43T154A vertoonden een significante toename van hechting aan cellen mesotheelcellen vergeleken met lege vector (P < 0,05). Geen significante verschillen in adhesiecapaciteit waargenomen tussen Cx43- en Cx43T154A-expressie groepen (P > 0,05), wat suggereert dat Cx43 bevordert maagkanker celadhesie, die onafhankelijk van GJIC (figuur 2B) 3,5: Ontwikkeld. Cx43 tot expressie BGC-823 en SGC-7901 cellen vormen functionele gap junction kanalen met mesotheelcellen celmonolagen Wij samen gekweekt ontworpen Cx43- en Cx43T154A expressie maagkanker cellen met mesotheelcellen celmonolagen om het vermogen van Cx43 onderzocht tot expressie brengen cellen om gap junctions te vormen en vast te stellen GJIC met mesotheelcellen. De resultaten tonen aan dat maagkanker cellen in ofwel de lege vector groep of de groep Cx43T154A niet GJIC leggen met aangrenzende peritoneale mesotheelcellen na bleken laser, terwijl het Cx43 tot expressie groep kunnen GJIC succesvol leggen met peritoneale mesotheelcellen was. De intracellulaire fluorescentie-intensiteit werd waargenomen voordat bleken, op het moment van bleken en ofwel 1 min, 2 min, 3 min en 4 min na het bleken. De resultaten tonen aan dat, in Cx43 tot expressie groep, de intracellulaire fluorescentie-intensiteit van de gebleekte mesotheelcellen cel snel af na het bleken. Fluorescentie-intensiteit dan geleidelijk hersteld door passage verven doorgangsgat junctions met aangrenzende ongebleekte maagkanker cellen en de gemiddelde fluorescentie recovery rate was 35,6 ± 0,9% en 39,4 ± 0,8% bij 4 min na blenching in BGC-823 en SGC-7901 cellen, respectievelijk, die was significant hoger dan die in Cx43T154A en lege vetor groep (p < 0,05). (Figuur 3, tabel 3) 3.6. Morfologische evaluatie van tumorcel diapedesis Wij vestigden een in vitro 3.7. Cx43-gemedieerde GJIC verbeterde maagkanker cellen diapedesis We samen gekweekt Cx43-, Cx43T154A expressie gasric kanker cellen en CBX voorbehandeld Cx43 tot expressie brengende cellen met mesotheelcellen voor 1, 4 en 7 uur hun diapedesis efficiëntie [1,2] vergelijken. Deze cellen werden gescoord met behulp van de beschreven criteria voor de migratie. Het percentage migreren Cx43T154A en CBX voorbehandelde cellen waren niet significant verschillend lege vector groep cellen na 7 uur co-kweek (p > 0,05), maar de diapedesis efficiëntie van Cx43 tot expressie groep cellen was significant hoger dan andere drie groepen (p <0,05) (Figuur 5). Deze resultaten suggereren dat de aanwezigheid van de Cx43 eiwit in de tumor cel alleen niet verantwoordelijk voor de waargenomen toename van diapedesis, maar heterocellulaire GJIC tussen tumorcellen en mesotheelcellen is nodig om de efficiëntie van diapedesis maagkanker cellen vergroten. Deze resultaten suggereren dat Cx43 vergemakkelijkt GJIC-afhankelijke tumorcel diapedesis. Gap kruispunten en connexine subeenheden neerwaarts gereguleerd in verschillende vormen van kanker [4,13,1,4]. Uit recente rapporten blijkt dat de expressie connexines 'niet altijd op verminderde niveaus tijdens de progressie van de tumor wordt gehandhaafd; Omgekeerd kunnen zij tijdens de latere stadia van carcinogenese aanwezig zijn, waardoor de migratie capaciteit van invasieve cellen [2,15-11,7]. Deze hernieuwde opkomst van connexines wordt duidelijk waargenomen tijdens de progressie van de menselijke borstkanker, waarbij Cx26- en Cx43 negatieve primaire tumoren ontwikkeld Cx26- en Cx43-positieve uitzaaiingen in de lymfeklieren [18,1,9]. Soortgelijke resultaten zijn ook verkregen in muizenhuid carcinogenese; Cx26 expressie wordt verminderd tijdens de vroege stadia van carcinogenese maar kan worden dat metastatische lymfeknopen [20]. Deze studies impliceren dat connexines verschillende rollen spelen tijdens het proces van carcinogenese. Onze studie was de eerste om de expressie van Cx43 tijdens de verschillende stadia van maagkanker progressie (primair maagkanker weefsel, intra-abdominale geëxpandeerd maagkanker cellen en gekoppeld peritoneale metastatische weefsels) onderzocht. De resultaten tonen een significante afname van Cx43 expressie in primaire maagkanker weefsels in vergelijking met de aangrenzende normale gastrische weefsels (p < 0,05). Daarentegen werd Cx43 expressie in intra-abdominale geëxpandeerd maagkanker cellen en metastatische weefsels peritoneale aanzienlijk toegenomen. Deze resultaten suggereren dat Cx43 speelt waarschijnlijk een belangrijke rol bij peritoneale metastasen. Om te onderzoeken of Cx43 expressie een effect heeft op peritoneale metastasen, werd getransfecteerd in Cx43 BGC-823 en SGC-7901 maagkanker cellen, en Cx43T154A ter mutatie werd geconstrueerd om de rol van de spleetovergangen communicatie bezig peritoneale metastasen bepalen. Hechting en diapedesis van tumorcellen voor de mesotheelcellen celmonolagen twee kritische stappen voor de vorming van peritoneale metastasen. Een De diapedesis van maagkanker cellen door mesotheelcellen celmonolagen in vitro Cx43- en Cx43T154A tot expressie gastrische cellen werden toegevoegd aan celmonolagen en co-nacht gekweekt (niet langer dan 12 uur mesotheliaal ) verder bevestigen de rol van GJIC in de transmigratie van maagkanker cellen door de peritoneale mesotheelcellen celmonolagen. Maagkanker cel diapedesis werd onderzocht met behulp van laser scanning confocale microscopie. Onze resultaten lieten zien dat Cx43 tot expressie maagkanker cellen vertoonden doeltreffender migratie door de mesotheelcellen celmonolagen dan Cx43T154A en lege vector groep cellen, terwijl de diapedesis efficiëntie van tumorcellen in laatste twee groepen was niet significant verschillend, wat suggereert dat de heterocellulaire GJIC tussen tumor en mesotheelcellen moet diapedesis verbeteren. De sleutelrol van GJIC in het diapedesis maagkanker cellen door de mesotheelcellen cellagen begrijpen, gekeken naar eerdere studies die de mechanismen betrokken bij de diapedesis van tumorcellen door middel endotheelcel lagen toegelicht. Deze studies hebben aangetoond dat tumorcellen signalen sturen naar het endotheel, zoals inositol trifosfaat (IP3) via gap junctions om intracellulair calcium te reguleren. Verhoogde niveaus van intracellulaire calcium transient fosforyleren de myosine lichte keten om endotheliale permeabiliteit te verhogen. Endotheelcellen kan ook signalen naar tumorcellen verzenden via gap junctions cellulaire motiliteit eiwitten, zoals Rho GTPases, proteïnekinase C en fosfoinositide 3-kinase [24-22,7] upregulate. Deze resultaten kunnen helpen om het mechanisme van hoe GJIC speelt een centrale rol tijdens diapedesis van maagkanker cellen op te helderen. Rekening houdend met de resultaten van dit onderzoek en de recente bevindingen, stellen wij voor dat Cx43-gemedieerde gap junctions speelt een actief in de peritoneale uitzaaiing maagkanker cellen. Onze resultaten ondersteunen de hypothese dat gap-junctions heterocellulaire koppelingen tussen maagkanker cellen en de mesothelium regelt de transmigratie van maagkanker cellen naar de peritoneale mesotheelcellen celmonolagen. transmigratie maagkanker cellen 'door de mesothelial barrière plaatsgevonden via paracellulaire migratie.
connexine 43
Primaire maagkanker (gevallen) (%)
Aangrenzend normaal weefsel (gevallen) (%)
uitgezaaide peritoneale weefsel (gevallen) (%)
Negatief (score < 3) 31 (73,8%) 0 (0 ) 13 (31,0%) positief (score≥3) 11 (26,2%) * 42 (100%) 29 (69,0%) † Tabel 2. Immunohistochemie resultaten voor connexine 43 expressie in primaire maagkanker weefsels grenzend normale gastrische weefsels en peritoneale . metastatische weefsels (N = 42) pagina Home opzichte van aangrenzend normaal weefsel, de expressie van connexine 43 verminderde significant (p < 0,05); † Vergeleken met primaire maagkanker weefsel, de expressie van connexine 43 in metastatische peritoneaal weefsel significant verhoogd (p < 0,05). CSV Download CSV
3,3 : expressie van exogeen Cx43 in BGC-823 en SGC-7901 maagkanker cellen
groep Victoire gemiddelde fluorescentie recovery rate (%, x
± s ) (t=4min)
BGC-823Cx4335.6±0.9*BGC-823Cx43T154A12.1±0.6BGC-823v13.4±0.7SGC-7901Cx4339.4±0.8†SGC-7901Cx43T154A15.3±0.4SGC-7901v14.7±0.6Table 3. Vergelijking van de gemiddelde fluorescentie herstel tarieven na bleken in BGC-823 en SGC-7901 maagkanker cellen (fluorescentie-intensiteit, x
± s) van CSV Download CSV
systeem het imago van de transmesothelial migratie van maagkanker cellen om het mechanisme en de route van diapedesis onderzoeken. Deze test bootst aspecten van de vaatwand en vooraf gebruikt voor leukocyt diapedesis [11] te analyseren. Dil-gelabelde tumorcellen werden gescoord op basis van hun morfologie en ligging ten opzichte van de mesothelium. Definieerden we drie verschillende fasen migratie via confocale microscopie: afgerond (Figuur 4A); migreren (Figuur 4E); en daaronder (Figuur 4I). Tumorcellen bovenop de mesothelium vóór diapedesis vertoonde een ronde of ovular vorm en die vorm werd uit de apicale (Figuur 4B) om de basale oppervlak (Figuur 4C, D) gehandhaafd. Migrerende tumorcellen passeren tussen aangrenzende mesotheelcellen veranderde vorm van ovular een lange spil met intracellulaire F-actine samengesteld tot actine filament bundels (figuur 4F, G, H). De tumorcellen die diapedesis voltooid bevonden zich volledig onder de mesothelium. De celvorm geleidelijk veranderd van de lange as tot de rondere vorm en de intracellulaire F-actine filamenten geleidelijk uitgebreid en werd een dun aangebracht tussen filamenten (figuur 4J, K, L). Onze studie toonde aan dat diapedesis maagkanker cellen 'plaatsgevonden via een paracellulaire route
Discussie
in vitro celadhesie-assay bleek dat Cx43- en Cx43T154A-expressie BGC-823 en SGC-7901 cellen vertoonden efficiënter hechting aan de mesotheelcellen celmonolagen dan lege vector cellen en dat de hechting efficiëntie van expressie Cx43T154A tumorcellen was vergelijkbaar met Cx43 tot expressie brengende cellen. Deze resultaten suggereren dat Cx43 bevordert de hechting van maagkanker cellen aan mesotheelcellen, die onafhankelijk van de gap junction communicatie. Met verwijzing naar zijn vergelijkbaar mechanisme had onze vorige studie aangetoond dat Cx43 kan interageren met celadhesie geassocieerde eiwitten, zoals E-cadherine, die deelnemen aan het proces van hechting [21], die een positieve rol van Cx43 expressie kan voorstellen vergroten celadhesie.
werd verder onderzocht in onze experimenten. De studie toonde aan dat de diapedesis van Cx43 tot expressie brengende cellen significant maag werd verbeterd vergeleken met Cx43T154A tot expressie brengende cellen, wat suggereert dat Cx43 expressie beïnvloed cellulaire motiliteit die in overeenstemming met verscheidene eerdere verslagen was [2, 14, 22 en 23]. Echter, het moet nog worden opgehelderd of Cx43 expressie werd geassocieerd met intercellulaire communicatie. Vervolgens hebben we onderzocht of GJIC speelt een centrale rol in diapedesis. Eerst onderzochten we de GJIC tussen maagkanker cellen en peritoneale mesotheelcellen. De resultaten toonden aan dat Cx43 tot expressie brengende cellen vastgesteld maagkanker effectieve heterotypische GJIC met peritoneale mesotheelcellen; echter Cx43T154A tot expressie brengende cellen niet GJIC vaststellen, zoals werd overwogen alvorens [10].
Nieuwe studie kan dodelijke infecties bij baby's helpen voorkomen
Nieuwe tool registreert en volgt de groei van het microbioom
Huishoudelijke ontsmettingsmiddelen kunnen bijdragen aan het risico op obesitas bij kinderen
Studie koppelt consumptie van gefermenteerde groenten aan lage COVID-19-sterfte
Studie suggereert verband tussen gebruik van probiotica en "hersennevel"
Onderzoek met een tweeling toont aan dat COVID-19-symptomen een genetische bijdrage hebben
Nieuwe superactiverende macrofaagreceptor zou hyperontsteking bij ernstige COVID-19 kunnen verklaren
Immuniteit is een merkwaardig iets. Hoewel essentieel bij het beschermen van het lichaam tegen binnendringende pathogenen en vreemde antigenen, het kan zich ook tegen het lichaam keren en destructieve
Vaginale bacteriën gekoppeld aan vroeggeboorte
Een nieuwe studie gepubliceerd in het tijdschrift Grenzen in de microbiologie in april 2020 meldt dat vrouwen die vroeg bevallen meer kans hebben op een grotere verscheidenheid aan bacteriën in hun
Kunststoffen die nu vaak worden aangetroffen in menselijke ontlasting
Jaarlijks komt er bijna acht miljard ton plastic in de oceanen terecht. Deze enorme hoeveelheid plastic spoelt aan of valt uiteen in kleine stukjes van minder dan 5 millimeter in diameter en worden mi