Abstract
In het tijdperk van gerichte therapie, mutatie profilering van kanker is een cruciaal aspect van het maken van therapeutische beslissingen . Kanker karakteriseren op moleculair niveau, het gebruik van formaline-gefixeerd paraffine-ingebed weefsel van belang. We testten de Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 en Ncounter Copy Number Variatie Assay in 89 formaline gefixeerde in paraffine ingebedde maagkanker monsters om te bepalen of ze in archiefmateriaal klinische monsters voor gepersonaliseerde gerichte therapieën van toepassing zijn. We gevalideerd resultaten Sanger sequentiebepaling, real-time kwantitatieve PCR, fluorescentie in situ hybridisatie en immunohistochemie. Vaak ontdekt somatische mutaties opgenomen TP53 Visum:. Kim S, Lee J, Hong me, IG, Kang SY, Ha SY, et al. (2014) High-throughput sequencing en Copy Number Variation Detection Met behulp van formaline gefixeerde ingebed weefsel bij uitgezaaide maagkanker. PLoS ONE 9 (11): e111693. doi: 10.1371 /journal.pone.0111693 Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan Ontvangen: 28 april 2014; Aanvaard: 29 september 2014; Gepubliceerd: 5 november 2014 Copyright: © 2014 Kim et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd Data Availability:. De auteurs bevestigen dat alle gegevens waarop de bevindingen zijn volledig beschikbaar zonder beperking. Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden Financiering:. Deze studie werd ondersteund door een subsidie van de Korea Healthcare Technology R & D Project, Ministerie van Health & Welzijn Zaken, de Republiek Korea (A101130) en een Samsung Biomedical Research Institute subsidie (# SBRI-SP1B20112). Deze studie werd ook ondersteund door een Samsung Medical Center intramurale subsidie, 20 x 20 Project (# GFO1140111). Co-auteurs Seokhwi Kim, Jeeyun Lee, Min Eui Hong, In-Gu Do, So Young Kang, Sang Yun Ha, Seung Tae Kim, Se Hoon Park, Won Ki Kang, Min-Gew Choi, juni Ho Lee, Tae Sung Sohn , Jae Moon Bae, Kim Sung en Kyoung-Mee Kim in dienst zijn van Samsung Medical Center. Co-auteur Duk-Hwan Kim is in dienst van Samsung Biomedical Research Institute. Samsung Biomedical Research Institute en Samsung Medical Center heeft steun verleend in de vorm van salarissen voor auteurs Seokhwi Kim, JL, MEH, IGD, Syk, SYH, STK, SHP, WKK, MGC, JHL, TSS, JMB, Sung Kim, KMK en DHK , maar had geen aanvullende rol in de onderzoeksopzet, gegevensverzameling en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript. De specifieke rol van deze auteurs worden verwoord in de sectie 'auteur bijdragen' Competing belangen. De auteurs hebben de volgende belangen: Deze studie werd gefinancierd in het kader van Samsung Biomedical Research Institute en Samsung Medical Center. Co-auteurs Seokhwi Kim, Jeeyun Lee, Min Eui Hong, In-Gu Do, So Young Kang, Sang Yun Ha, Seung Tae Kim, Se Hoon Park, Won Ki Kang, Min-Gew Choi, juni Ho Lee, Tae Sung Sohn , Jae Moon Bae, Kim Sung en Kyoung-Mee Kim in dienst zijn van Samsung Medical Center. Co-auteur Duk-Hwan Kim is in dienst van Samsung Biomedical Research Institute. Er zijn geen octrooien, producten in ontwikkeling of producten op de markt te verklaren. Dit betekent niet naleving van de auteurs te veranderen om alle PLoS ONE beleid op het delen van gegevens en materialen. Terwijl maagkanker is de vierde meest voorkomende kanker in de wereld, is het de tweede belangrijkste doodsoorzaak. [1] De incidentie significant hoger in Aziatische landen, waaronder Korea, waar het de tweede meest voorkomende kanker. [2] Onlangs, meer gerichte therapieën voor maagkanker ontdekt, die aanvullende opties voor artsen en patiënten [3] - [5] In het tijdperk van doelgerichte therapie, mutatie profilering van de veroorzakende kanker. is cruciaal voor therapeutische beslissingen. Pogingen om mutaties zijn gemaakt met behulp van traditionele Sanger sequencing profiel; het is echter geen optimale werkwijze klinische vanwege de kosten, tijd en arbeid nodig. Bovendien Sanger sequencing vereist aanzienlijke hoeveelheden DNA; evalueren van kleine hoeveelheden monster gedurende verschillende genen tegelijkertijd niet mogelijk. Introductie van next generation sequencing (NGS) methoden heeft dit probleem door multiplex, high-throughput sequentiebepaling van vele monsters voor meerdere genen gelijktijdig opgelost. [6], [7] Een van de NGS platforms Ion Torrent AmpliSeq Cancer Panel, gebaseerd op niet-optische detectie van waterstofionen in een halfgeleiderinrichting, [8] en kan 2855 oncogene mutaties in 50 het algemeen gemuteerde genen detecteren (Tabel S1). Is superieur aan andere massaspectroscopie gebaseerde sequencing methoden die aan sequentiebepaling resultaten sneller en goedkoper. [8] Het is in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) weefselmonsters met kleine hoeveelheden DNA van toepassing. Omdat het zorgt voor een hoge gevoeligheid bij screening bekende oncogene mutaties, [9], [10] de Ion Torrent AmpliSeq Cancer Panel is de keuze van de 5 grote kanker centra in de Verenigde Staten voor moleculaire diagnostiek in gerichte therapie [11]. Amplificatie van oncogenen is een belangrijk mechanisme voor overexpressie en draagt bij aan tumorontwikkeling. [12] Voorbeelden zijn onder meer versterking van de HER2 Beter toegesneden behandeling van kanker kan de patiënt uitkomst te verbeteren. Patiënt tumormonsters worden om kanker te karakteriseren op moleculair niveau en identificeren van de ziekte subgroepen die verschillende behandelingen moeten krijgen vereist. Het gebruik van FFPE weefsel is belangrijk om dergelijke studies. [16] Hier hebben we getest AmpliSeq en Ncounter aangepaste CNV panelen in FFPE maagkanker monsters om te bepalen of ze in archiefmateriaal klinische monsters van toepassing voor gepersonaliseerde gerichte therapieën zijn. Samples tumorcellen percentage meer dan 75% werden uitgesneden onder microscopie van 4 mm onbesmet secties ten opzichte van een H &E gekleurd glijbaan en genomisch DNA werd geëxtraheerd onder toepassing van een Qiagen DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant van 96 patiënten met gevorderde maagkanker. Na extractie, meten we de concentratie evenals 260/280 en 260/230 nm ratio met spectrofotometer (ND1000, Nanodrop Technologies, ThermoFisher Scientific, MA, USA). Elk monster werd vervolgens gekwantificeerd met qubit fluorometer (Life Technologies, Carlsbad, California). Genomic DNA met > 10 ng gemeten door Qubit fluorometer werd onderworpen aan bibliotheek voorbereiding en zeven monsters niet aan bibliotheken te bouwen en werden van deze studie uitgesloten. Tenslotte werden 89 gevallen uiteindelijk geanalyseerd en opgenomen 31 vrouwelijke en 58 mannelijke patiënten. Tabel 1 toont de klinische en pathologische kenmerken van de patiënten in deze studie. Recidief of metastase ontwikkeld in 11 patiënten met een mediane follow-up periode van 76 maanden (range 5,5-149,3). De studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) bij Samsung Medical Center. Alle klinische onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de principes die in de Verklaring van Helsinki. De schriftelijke informed consent werd opgeheven door de IRB te wijten aan retrospectieve analyse en anonieme gegevens. Monsters werden verzameld in het kader van een routinematige medische procedure en verzameld zijn door de auteurs van deze studie. Monsters van overleden patiënten en levende patiënten werden al-identificeerbaar, met inbegrip van het verwijderen van enige en alle demografische informatie, voorafgaand aan de analyse en geïnformeerde toestemming vorm werd opgeheven door de IRB. We gebruikten de Ion AmpliSeq Cancer Panel v2 (Ion Torrent) frequent somatische mutaties die werden geselecteerd op basis van literatuuronderzoek te detecteren. Onderzoekt 2855 mutaties in 50 het algemeen gemuteerde oncogenen en tumorsuppressorgenen (tabel S1). Eerst, 10 ng DNA uit elke 89 FFPE tumormonsters ondergingen een buis, multiplex PCR amplificatie met de Ion AmpliSeqCancer Primer Pool en Ion AmpliSeqKit reagentia (Life Technologies). Behandeling van de resulterende amplicons met Fupa reagens gedeeltelijk verteerd en primers gefosforyleerd de amplicons. De gefosforyleerde amplicons werden geligeerd Ion Adapters en gezuiverd. Voor barcode bibliotheek voorbereiding, we vervangen barcode adapters uit de Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit voor de niet-streepjescode adapter mix in de Ion AmpliSeq Library Kit geleverd. Het geligeerde DNA onderging nick-vertaling en versterking van de koppeling tussen de adapters en amplicons te voltooien en om voldoende materiaal voor downstream template voorbereiding te genereren. Twee rondes van Agencourt AMPure XP reagens binden op 0,6 en 1,2 bead-to-sample volume verhoudingen verwijderd ingang DNA en niet opgenomen primers van de amplicons. De uiteindelijke bibliotheek moleculen waren 125~300 bp in grootte. We vervolgens overgedragen aan de bibliotheken om de Ion OneTouch-systeem voor geautomatiseerde template voorbereiding. Sequencing werd uitgevoerd op de Ion PGM sequencer volgens de instructies van de fabrikant. We gebruikten IonTorrent Software voor automatische data-analyse. Om de gevoeligheid en specificiteit van de kanker panel Ion AmpliSeq meten, exoom sequencing resultaten van 4 maagkanker monsters met bekende mutatie-status werden gebruikt [17]. Ncounter Copy Number Variation codesets Voor detectie van CNV, Ncounter Copy Number Variation codesets werden gebruikt met 300 ng gezuiverd genomische DNA geëxtraheerd 2-3 delen van 4-urn dikke FFPE vertegenwoordiger tumor blokken met behulp van QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland). DNA werd gefragmenteerd via AluI digestie en gedenatureerd bij 95 ° C. Gefragmenteerde DNA werd gehybridiseerd met de codeset van 86 genen in de Ncounter Cancer CN Assay Kit (NanoString Technologies) gedurende 18 uur bij 65 ° C en behandeld volgens de instructies van de fabrikant. De Ncounter Digital Analyzer geteld en in tabelvorm de signalen van de reporter sondes en gemiddelde aantal nummers van > 3 werden geroepen en bevestigd door IHC, FISH of real-time PCR IHC voor HER2, EGFR (HER1) en CCNE1. voor validatie van CNV resultaten van Ncounter voerden we IHC HER2 in alle gevallen, en EGFR en CCNE1 in bepaalde gevallen. Na deparaffinisatie en rehydratatie werden 4 mm secties op silaan gecoate glaasjes immunostained voor HER2. De HercepTest (Dako, Glostrup, Denemarken) gebruikt volgens de richtlijnen van de fabrikant, zoals eerder beschreven. [18] Voor de EGFR gebruikten we anti-NCL-L-EGFR-384 muis monoklonaal primaire antilichaam (1:100 verdunning; Novocastra /Vision Biosystems, Newcastle, UK) en voor CCNE1 we gebruikte anti-CCNE1 /cycline E1 antilichaam (kloon HE12; 1:200 verdunning; Thermo Fisher Scientific, MA). De geautomatiseerde slide-verwerkingssysteem Ventana BenchMark XT werd gebruikt volgens het protocol van de fabrikant. Een deskundige patholoog (KMK) evalueerde de resultaten FISH voor HER2 FISH werd uitgevoerd met behulp van dual-color DNA-specifieke probes van PathVision ™ (Abbott /Vysis:. LSI HER2 SpectrumOrange ™ en CEP 17 SpectrumGreen ™) zoals eerder beschreven gevallen, met gelijksoortige HER2 overexpressie. [19] We telden de hybridisatiesignalen in 20 kernen per steekproef onder een fluorescentiemicroscoop (Zeiss Axioskop) met behulp van filter sets aanbevolen door Vysis (DAPI /Spectrum Orange dubbele bandpass, DAPI /Spectrum Green dual bandpass). Alle overlappende kernen werden uitgesloten en alleen kernen met verschillende nucleaire grens geëvalueerd. HER2 We gebruikten DNA verkregen uit FFPE maagcarcinoom tumor weefsels. Het reactiemengsel bevatte 2 ul genomisch DNA-matrijs, 10 ul PCR Taqman universele modelmengsel (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA) en 0,2 uM van elke primer. Voor een nauwkeurige opsporing van GN wijzigingen, analyseerden we drie verschillende regio's van de KRAS We maten copy number gain met het volgende profiel: 2 min bij 50 ° C, denaturatie bij 95 ° C 10 min, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 sec en 60 ° C gedurende 1 min. We bepaalden de relatieve kwantificatie met behulp van de 7900 HT snelle real-time PCR-systeem in viervoud. Een RNaseP assay kit (Applied Biosystems) werd gebruikt als controle. Na amplificatie voerden wij de experimentresultaten die drempelwaarde cyclus waarden voor het aantal kopieën en vindplaats assay in de CopyCaller Software (Applied Biosystems) voor post-PCR data-analyse zoals eerder beschreven. [22] We krijgen het CN gain status en het aantal KRAS- Exclusiecriteria alle synoniem verandert na een geautomatiseerd mutatie bellen algoritme werd gebruikt om vermeende mutaties te detecteren. Terugkerende oproepen in meer dan 10 van de 89 monsters werden als vals positieve en werden uitgesloten. We gebruikten cutoff waarden van meer dan 6% variant frequentie en meer dan X100 dekking ware mutatie verandert in overeenstemming met eerdere studies en onze eigen ervaring detecteren. [9], [10] We uitgefilterd single-nucleotide polymorphisms na handmatige controle van elk polymorfisme in de Catalogus van somatische mutaties in Cancer (COSMIC, http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic) ( Figuur 1). Voor bekende genen gemuteerd in de maag carcinomen ( TP53 Resultaten Resultaten van de Ion AmpliSeq kanker paneel de concentraties van DNA, de concentratie vouwen, gemiddelde dekking van de monsters, totaal aantal bases, > Q20 bases, leest, betekent lees lengte, in kaart gebracht leest, on-target rate (%), gemiddelde diepte en de uniformiteit van de resultaten worden beschreven in Tabel S2. In totaal kregen we 8178 variant gesprekken van 89 monsters, onder wie 3554 gesprekken waren niet-synoniem veranderingen. Na het uitfilteren van terugkerende gesprekken, < 6% van de variant-allel frequentie, < 100X dekking en die in intron regio, werden 65 gesprekken variant gekozen. Daarnaast hebben we beoordeeld de geautomatiseerde gesprekken in bekende mutaties zoals BRAF In vier maagkanker met bekende mutatiefrequentie bepaald door exoom sequencing en bevestigd door Sanger sequentiebepaling, identificeerden we somatische mutaties in TP53 Amplification door Ncounter en validatie door IHC, FISH of real-time PCR Amplificaties van HER2 In real-time PCR voor de KRAS Voor BMO Discussie Door het gebruik van Ion AmpliSeq v2 vonden we dat 39 van de 89 geavanceerde maagdarmkanker monsters bevatten somatische mutaties, waaruit blijkt dat dit platform is gemakkelijk toepasbaar in archiefmateriaal FFPE weefselmonsters. TP53 Mutatie frequenties in de COSMIC databank onthullen substantiële gelijkenissen met de gegevens die we verkregen uit deze studie:. TP53 -Semiconductor gebaseerde sequencing heeft fundamentele verschillen in sensing en signaaltransductie in vergelijking met massaspectrometrie gebaseerde sequentiebepaling. In plaats van optische methoden nucleotide veranderingen te detecteren, de halfgeleider gebaseerde techniek detecteert pH veranderingen door afgifte van protonen (H +) bij nucleotiden integreren in de groeiende DNA-streng. [8] Daarom is er een aanzienlijke vermindering van de kosten en de tijd die nodig is voor gegevensverwerking vergelijking met andere NGS platforms. Het verstrekken van snelle en accurate informatie over de mutaties die tegen lage kosten is cruciaal voor patiënten met zeer agressieve vormen van kanker, met inbegrip van maagkanker. In deze studie hebben we handmatig de geautomatiseerde gesprekken in bekende mutaties beoordeeld na het toepassen van cutoff waarden van de frequentie en dekking, vervolgens het toevoegen van twee gesprekken met een lage variant dekking. Hoewel hun dekking waarden niet onze eerste criteria bereikten hun frequenties overtrof onze eerste instelling (6%) en de kwaliteit van de gegevens was goed. Dit benadrukt het belang van een handmatige controle na geautomatiseerde screening. Onlangs gepubliceerde resultaten met behulp van AmpliSeq de analyse platform benadrukken ook vergoeding van screening data met handmatige controle [9], [10]. De gepersonaliseerde gerichte therapie voor gevorderde kankers baseert zich vooral op het concept van "oncogen verslaving," in waarbij meerdere genetische afwijkingen verslaafd zijn aan één of enkele genen voor tumorcel onderhoud en overleving. [28] Een open-label, internationale, fase 3, gerandomiseerde gecontroleerde ToGA (trastuzumab voor maagkanker) onderzoek gaf aan dat trastuzumab in combinatie met chemotherapie is een nieuwe standaard optie voor patiënten met HER2-positieve gevorderde maag of gastro-oesofageale junction kanker. [29] Een preklinische studie toonde aan dat een subset van maagkanker met EGFR golfreizen of BMO Kortom, we met succes uitgevoerd halfgeleiders gebaseerde sequencing en Ncounter CNV analyses in FFPE weefselmonsters van 89 maag adenocarcinomen. High-throughput sequencing en CNV screening in archiefmateriaal klinische monsters zorgt voor een snellere, meer accurate en kosteneffectieve opsporing van hotspot mutaties en CNV in de genen. In het tijdperk van de gepersonaliseerde geneeskunde genomische, we zijn van plan om deze tools te gebruiken voor het screenen op maagkanker patiënten die kunnen profiteren van gerichte therapieën.
(28,17%), APC
(10,1%), PIK3CA
(5,6%), KRAS
(4.5 %), SMO
(3,4%), STK11
(3,4%), CDKN2A
(3,4%) en SMAD4
(3,4%) . Amplificaties van HER2
, CCNE1
, MYC
, KRAS Kopen en EGFR
genen werden waargenomen bij 8 (8,9%) , 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) en 1 (1,1%) gevallen, respectievelijk. In de gevallen amplificatie, fluorescentie in situ hybridisatie HER2
geverifieerd genamplificatie en immunohistochemie voor HER2, EGFR en CCNE1 bevestigde de overexpressie van eiwitten in tumorcellen. Tot slot hebben we met succes uitgevoerd halfgeleiders gebaseerde sequencing en Ncounter copy number variation analyses in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde maagkanker monsters. High-throughput screening in archiefmateriaal klinische monsters zorgt voor een snellere, meer accurate en kosteneffectieve opsporing van hotspot mutaties of versterking in genen
Introductie
, BMO
, FGFR2 Kopen en KRAS
genen in maagkanker. [13], [14] In de detectie van kopijnummervariaties (CNV) klinische monsters, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en /of immunohistochemie (IHC) is op grote schaal gebruikt. Echter, hoge kosten en kleine steekproeven van biopsie materialen beperken de toepassing van deze methoden, en er is nog steeds behoefte aan verdere high-throughput technologie met een goede bereikbaarheid, hoge gevoeligheid en lage kosten. Ncounter CNV codesets (NanoString technologieën, Life Sciences, Seattle, WA) bieden superieure nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid voor studies van alle maten en produceren een betere, snellere resultaten met aanzienlijk minder inspanning dan met real-time kwantitatieve polymerase chain reaction (qPCR) of CNV arrays [ ,,,0],15].
Materialen en methoden
Ion AmpliSeq kanker panel v2
gen werd beschouwd versterkt wanneer de FISH signaal verhouding van HER2 /CEP17
groter dan of gelijk is aan 2,0 [20].
Real-time PCR voor KRAS en was BMO versterking
gen: een gebied in intron 1 (TaqMan Copy Number Assay Hs06943812_cn), een gebied in intron 2 (Hs002534878_cn), en een gebied in exon 6 (Hs02739788_cn). . Voor MET
gen, gebruikten we de primers zoals eerder beschreven [21]
exemplaren gebaseerd op de overeenstemming van de resultaten in ten minste twee van de drie probes.
Analysemethoden
, APC
, PIK3CA
, STK11
, CDKN2A
, KRAS
, HRAS
, BRAF Kopen en CTNNB1
), een handmatige controle van automatische oproepsystemen resultaten werd uitgevoerd om schadelijke mutaties te vangen met een licht laag- variant frequentie.
, KRAS Kopen en PIK3CA
en kon twee variant gesprekken, die werden uitgesloten tijdens de filtering op te slaan processen. Negenendertig van de 89 monsters (43,8%) vertoonden ten minste één mutatie (figuur 1). Twee gevallen toonde 22 en 5 mutaties respectievelijk. De laatste geval koesterde MLH1
somatische mutatie [missense mutatie in exon 20: c.1147A > G (p.M383 V)] en MLH1
promoter hypermethylering met MLH1 eiwit verliezen door IHC met behulp van de eerder beschreven methoden, [23] suggereert hypermutated tumor. Hoewel de mutaties in het eerste geval voorbij variant frequentie bereik gesneden offs, die mutaties werden niet bevestigd door Sanger sequentiebepaling suggereert vals positief in dit geval vanwege de slechte kwaliteit van het DNA. Dus, was dit geval uit de uiteindelijke analyse van de resultaten. Vaak ontdekt somatische mutaties opgenomen TP53
(24 gevallen, 27,0%), APC
(9 gevallen, 10,1%), PIK3CA
(5 gevallen, 5,6%), %), KRAS
(3 gevallen, 3,4%), SMO
(4 gevallen, 4,5%), STK11
(3 gevallen, 3,4%), CDKN2A
(3 gevallen 3,4%) en SMAD4
(3 gevallen 3,4%) zoals getoond in tabel 2. Tabel 2 samengevat ook de aminozuurveranderingen in frequent gemuteerde genen. Identificeerden we 19 patiënten (21,3%) met twee of meer unieke en gelijktijdige somatische mutaties.
, ErbB4 Kopen en CTNNB1 hotels met geen vals-positieve gesprekken in andere genen (Tabel S3).
, CCNE1
, MYC
, KRAS Kopen en EGFR
genen werden waargenomen bij 8 (8,9%), 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) en 1 (1,1%) gevallen, respectievelijk (Tabel 3). We hadden geen versterking van BMO
, FGFR2
, CDK4 Kopen en CDK6 waarnemen in één van de gevallen. In gevallen amplificatie IHC HER2, EGFR en CCNE1 toonden overexpressie van eiwitten in de tumorcellen (Figuur 2A, B en C). In één geval met HER2 2+ door HercepTest, FISH toonden heterogene versterking van HER2
genen (Figuur 2D).
, één geval met amplificatie toonden toegenomen aantallen kopieën (36, 37 en 49); in gevallen die negatief zijn voor waren KRAS
versterking, was er geen toename van de kopie-aantallen (0,9-2,4, betekenen 1.4).
gen, vinden we geen positieve geval vanwege hun zeldzaamheid [21]. Daarom gebruikten we extra tien (vijf elk versterkt en niet-versterkte) monsters maagkanker en BMO
versterkt maagkanker cellijnen (MKN45 en SNU5) met bekende kopie nummers en mRNA bedragen. CNVs gedetecteerd door Ncounter correleerde goed met kopie-aantallen gedetecteerd door real-time PCR (Tabel S4) en mRNA-niveaus van BMO
gen (correlatietoets Pearson's; r = 0,874, p = 0,001). (Figuur S2)
werd het vaakst gevonden mutatie, gevolgd door APC
, PIK3CA Kopen en KRAS
. Bovendien, onze aangepaste CNV panel met succes gedetecteerd CN stijgingen van de HER2
, CCNE1
, MYC
, EGFR Kopen en KRAS
genen, die we door IHC en real-time PCR bevestigd
(32%), PIK3CA
(10%), KRAS
(6%), APC
(6%), CTNNB1
(5%), CDKN2A
(5%), FBXW7
(5%), SMO
(4%), ERBB2
(2%) en STK11
(2%). Recente exoom sequencing studies maagdarmkanker vertoonden enigszins hogere frequenties van TP53
(36% en 73%) en PIK3CA
(14% en 20%) mutaties vergeleken met onze resultaten. [24], [25] Hoewel onze mutatiefrequentie lager waren in vergelijking met sequencing resultaten exome, was er een significante toename vergeleken met onze eerdere gegevens van massaspectrometrie gebaseerde OncoMap v4. [26] Zowel AmpliSeq en OncoMap detecteren mutaties in hotspot gebieden die bevindingen minder frequente mutatie in bepaalde oncogenen en tumorsuppressorgenen leggen. Figuur S1 vergelijkt AmpliSeq v2 en OncoMap v4 in aantoonbare mutatie-profielen. Vorige OncoMap tests 237 maag adenocarcinomen bleek dat PIK3CA
mutaties waren vaak in een vergevorderd stadium van de ziekte (5,1% in fase IV; 6,4% in fase II /III, 2,4% in fase IB). [26] In deze studie zagen we drie PIK3CA
mutaties bij patiënten met stadium III en twee in fase II ziekte, het ondersteunen van hun biologische rol in de progressie van de tumor. We hebben ook waargenomen HER2
( ERBB2
) c.2524G > A (V842I) mutatie in een geval van maagkanker. In preklinische studies, cellijnen die het op V842I-mutatie waren resistent voor trastuzumab, maar waren gevoelig voor onomkeerbare HER2 inhibitor, neratinib [27].
amplificatie en overexpressie reageren op cetuximab of BMO receptor tyrosine kinase-remmers. [30] Bovendien amplificaties van celcyclus mediator CCNE1
suggereren de mogelijke therapeutische remming van cycline-afhankelijke kinasen in maagkanker. [31] Screening geamplificeerde genen voor gerichte therapie met high-throughput technologie is zeer belangrijk. Traditionele methoden zoals vis en de vele vergelijkende genomische hybridisatie last van lage resolutie van genomische regio's, hoge kosten en zijn labora- en tijdrovend. [32] In deze eerste studie Ncounter CNV analyses, vonden we dat deze technologie in FFPE monsters klinische toepassing en zijn resultaten bevestigd met IHC, FISH en real-time PCR. Hoewel we niet alle genen die in de aangepaste primers heeft gevalideerd, validatie resultaten in een aantal geselecteerde genen waren opmerkelijk.
Ondersteunende informatie
Figuur S1.
Vergelijking van de dekking van Ion AmpliSeq v2 kanker panel versus Oncomap v4
doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s001
(TIF)
Figuur S2.
Percelen van correlatie tussen de BMO
CNVs gedetecteerd door Ncounter en mRNA-niveaus van BMO
-gen door real-time PCR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s002
(TIF)
Tabel S1.
De Gene List voor de Ion Torrent AmpliSeq Cancer Panel
doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s003
(XLS)
tabel S2.
De concentraties van DNA, de concentratie vouwen, gemiddelde dekking van de monsters, totaal aantal bases, > Q20 bases, leest, betekent lees lengte, in kaart gebracht leest, on-target rate (%), gemiddelde diepte en uniformiteit.
doi: 10.1371 /journal.pone.0111693.s004
(XLS)
tabel S3.
Somatische mutaties in TP53
, ErbB4 Kopen en CTNNB1
doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s005
(XLS)
Tabel S4.
CNVs gedetecteerd door Ncounter correleerde goed met kopie-aantallen gedetecteerd door real-time PCR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s006
(XLSX)
Darm- en orale microbiomen voorspellen de ernst van COVID-19
Strategische voorbereiding van de pediatrische gezondheidszorg voor de tweede golf van de COVID-19-pandemie
Dat Pepto je maagzweer waarschijnlijk niet zal helpen
Leidt hypertensie altijd tot ernstige COVID-19?
Nieuwe strategie kan de darm-hersencommunicatie versterken
Het risico op slokdarmkanker kan worden verminderd door esomeprazol en een lage dosis aspirine
Darmbacteriën gekoppeld aan metabole veranderingen en autisme in nieuwe studie
Onderzoekers van het California Institute of Technology hebben een belangrijke ontdekking gedaan die kan verklaren hoe darmbacteriën kunnen bijdragen aan autisme-achtig gedrag. Het team ontdekte dat
Voedsel beïnvloedt selectief darmmicroben, vindt onderzoek
Voedsel zou een rol kunnen spelen bij de vorming van de microbiële flora in de menselijke darm. Dit is keer op keer aangetoond in verschillende onderzoeken en onderzoeken. Nu hebben onderzoekers van d
Maagzuur begrijpen
Maagzuur, het brandende gevoel dat optreedt in de borst of de keel, is meestal een tijdelijk probleem - misschien heb je gekruid eten gegeten - maar voor sommige mensen, het kan chronisch zijn. Maagzu