| Stomach Health > Maag Gezondheid >  > Stomach Knowledges > onderzoeken

P27kip1, gereguleerd door glycogeen synthase kinase-3β resulteert in HMBA-geïnduceerde differentiatie van menselijke maagkanker cellen

P27 Kip1, gereguleerd door glycogeen synthase kinase-3β, resulteert in HMBA-geïnduceerde differentiatie van humane maagkanker cellen
Abstracte achtergrond
Maagkanker is de tweede meest voorkomende oorzaak van de opwarming van kanker-gerelateerde sterfte . Hoewel dedifferentiatie voorspelt slechte prognose bij maagkanker, het onderliggende moleculaire mechanisme dedifferentiatie, die fundamentele inzichten in tumorontwikkeling en progressie kunnen bieden, moet nog worden opgehelderd. Voorts het moleculaire mechanisme achter de effecten van hexamethyleen bisacetamide (HMBA), een recent ontdekte differentiatie inducerende, vraagt ​​onderzoek en er zijn geen gerapporteerde studies over het effect van HMBA op maagkanker.
Methods
basis van de resultaten van FACS-analyse, de niveaus van eiwitten betrokken bij de celcyclus of apoptose werd bepaald met Western blotting na enkele behandelingen en sequentiële combinaties van HMBA en LiCl. GSK-3β en proton pomp werden onderzocht door western blotting na up-reguleren van Akt expressie door Ad-Akt infectie. Om de effecten van HMBA op proteïne lokalisatie en de activiteiten van GSK-3β, CDK2 en CDK4, kinase assays, immunoprecipitaties en Western blotting onderzoeken werden uitgevoerd. Bovendien werden Northern blotting en RNase protection assays
uitgevoerd om de functionele concentratie van HMBA bepalen. Resultaten
HMBA p27Kip1 verhoogde expressie en geïnduceerde celcyclus geassocieerd met maagzweren epitheliale celdifferentiatie. Bovendien, de behandeling van maag-afgeleide cellen geïnduceerd met HMBA G0 /G1 arrest en up-regulatie van de protonenpomp, een marker van maagkanker differentiatie. Bovendien behandeling met HMBA verhoogde de expressie en activiteit van GSK-3β in de kern, maar niet het cytosol. HMBA verminderde CDK2 activiteit en geïnduceerde p27Kip1 expressie, die kunnen worden gered door de remming van GSK-3β. Bovendien HMBA p27Kip1 verhoogde binding aan CDK2, en dit werd afgeschaft door GSK-3β remming.
Conclusies
De hierin gepresenteerde resultaten suggereren dat GSK-3β functies door controle p27Kip1 samenstel met CDK2, waardoor een cruciale rol spelen in G0 /G1 arrest geassocieerd met HMBA geïnduceerde gastrische epitheliale celdifferentiatie.
Sleutelwoorden
HMBA maagkanker GSK-3β Achtergrond
maagkanker is een van de meest voorkomende kankers in de wereld en vaak resistent tegen chemotherapie en bestraling behandelingen. Daarom is combinatietherapie voorgesteld om de ziekte beter pakken en de kans op ontwikkeling van resistentie [1] te verminderen. Hexamethyleen bisacetamide (HMBA), een hybride polaire verbinding (HPC) oorspronkelijk ontwikkeld als een differentiatie inducerende agens [2-6], oorzaken maag celherkiezing differentiatie [7-9].
In de maag stamcellen in de proliferatieve cel zone van de isthmus gebied van de maagklieren en differentiëren tot verschillende celtypen [10, 11] geven. Zodra de eerste tumorigene gebeurtenis plaatsvindt, verder tumorprogressie afhankelijk van de aard van de initiërende gebeurtenis en het ontwikkelingsstadium van de cel die werd gehouden en aanvullende mutaties die kunnen optreden. Constante toename is een essentieel kenmerk van stamcellen en gastro-intestinale weefsels mutaties waarschijnlijk resulteren in het vergroten van gewijzigde stamcellen, waardoor de kans op aanvullende mutaties en tumorprogressie [12]. Daarom richten maagkanker stamcellen is waarschijnlijk de meest effectieve manier van behandelen van maagkanker is. Ongeveer 50% van de westerse bevolking lijdt metaplasie, een belangrijke stap in de ontwikkeling van kanker [13], aandacht routes die proliferatie en daarmee celdifferentiatie controleren. Onder deze, de TGF-b, Myb, Wnt en Hedgehog routes van bijzonder belang zijn, met een belangrijke rol in de cel-lot specificatie en patroonvorming tijdens de embryonale en volwassen weefsel vernieuwing. De interpretatie van complexe tumor suppressor en het gaspedaal signaalwegen, welk effect differentiatie modulatie van overgangsmaatregelen /voorlopercellen, zal van cruciaal belang voor het optimaliseren van therapieën voor de behandeling van maagkanker zijn.
Om onvolwassen maag-cellen om te differentiëren, die zij nodig hebben om te verblijven in de G1 fase van de celcyclus voor een bepaalde tijdsperiode. De zoogdieren celcyclus wordt geregeld door sequentiële activering en inactivering van een sterk geconserveerde familie van cycline afhankelijke kinasen (CDK's); progressie door middel van begin tot midden-G1 is afhankelijk van CDK4 en eventueel CDK6, terwijl de voortgang door late G1 en de S-fase activering van CDK2 vereist. De activiteiten van CDK kan worden geremd door de binding van CDK remmende eiwitten, met inbegrip van de familie Cip /Kip (p21 waf1, p27 Kip1 en p57 Kip2) en INK4 familie (p15Ink4b, p16Ink4a, p18Ink4c en p19Ink4d ). P27 Kip1 wordt geregeld post-transcriptioneel door proteolytische degradatie. CDK2 bindt aan p27 Kip1 en fosforyleert het op threonine 187 [14] en HMBA geïnduceerde gastrische celdifferentiatie wordt geassocieerd met de up-regulatie van p27 Kip1 [15, 16] en G0 /G1 arrest. Er zijn echter weinig gedetailleerde studies met betrekking tot de moleculaire mechanisme van HMBA en er zijn geen meldingen onderzoeken naar het effect van HMBA op maagkanker geweest.
Als stroomafwaarts doelwit van de fosfatidylinositol-3 kinase /Akt (PI3-kinase /Akt ) route, GSK-3β regelt proliferatie en differentiatie [17-20] cel. Werd bewezen aan dat GSK3ß hypoactive signalering, die functioneert in G1 input van verschillende signalerings- en ontwikkelingstrajecten, optreedt in associatie met diverse humane kanker [21, 22]. GSK-3β is betrokken bij meerdere biologische processen omdat fosforyleert een groot aantal substraten waaronder verschillende differentiatie checkpoints met c-Myc, slak en PI3K [23]. Eerder, remming van de PI3-kinase route bleek HMBA gemedieerde maag celdifferentiatie verbeteren [8]. In deze studie, de rol van GSK-3β maag tijdens celdifferentiatie werd onderzocht met menselijke maagkanker cellijn SGC7901, die een multipotente fenotype vertoont en is een goed gekarakteriseerd model van maag differentiatie. De resultaten suggereren een bijdragende rol voor de GSK-3β in het p27 Kip1 route tijdens de maag celdifferentiatie geïnduceerd door HMBA.
Methods
Cell cultuur Ondernemingen De maagkanker cellijn SGC7901 werd verkregen uit de celbank in de Chinese Academie van Wetenschappen en gekweekt zoals eerder beschreven [24]. SGC7901 cellen werden geïnfecteerd met een adenovirus dat codeert voor de geactiveerde vorm van Akt (Akt-Ad) of adenovirale controlevector coderende β-galactosidase (β-gal) bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 pfu /cel. Na infectie met vectoren gedurende een uur, gevolgd door vervanging van medium en incubatie gedurende nog eens 24 uur werden cellen behandeld in aanwezigheid of afwezigheid van HMBA, en eiwit- en RNA werden geëxtraheerd voor Western blotting en Northern respectievelijk.
Materialen
HMBA, TSA, SB-415286 en LiCl werden gekocht van Sigma Chemical Company, USA. Adenovirusvectoren die coderen β-gal en de gemyristoyleerde actieve vorm van Akt (Akt-Ad) werden gekocht bij Cell BioLabs, USA. De vector codeert de katalytisch actieve mutant van GSK3ß (HA-GSK-3βCA) werd gekocht bij Addgene. Non-targeting controle siRNA en de SmartPool voor het richten van GSK-3β werden gekocht bij Dharmacon, USA. Alle probes werden gelabeld met een biotine Random Prime DNA Labeling Kit (Pierce).
Antilichamen
Rabbit anti-Akt, anti-fosfo-Akt (Ser473) en antiphospho-GSK-3β (Ser9) werden gekocht bij Cell Signaling , VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA. Mouse anti-GSK-3β, muis anti-p27 Kip1, muis anti-Top IIb en muis anti-p21 waf1 werden gekocht bij BD Biosciences, USA. Muis anti-fosfo-GSK-3 (Tyr278 /Tyr216) werd verkregen van Upstate, USA. Konijn anti-gesplitste PARP antilichaam werd gekocht van Abcam, USA. Anti-proton pomp werd gekocht van MBL International (USA). Polyklonale anti-CDK2, anti-CDK4, anti-α-tubuline en anti-caspase-3 werden verkregen van Santa Cruz Biotechnology (USA).
Subcellulaire eiwitextractie en Western blotting
Kern- en cytosolische fracties werden geëxtraheerd met een NE-pER nucleaire en cytoplasmatische Extraction kit reagentia (Pierce, USA). Cytosolisch eiwit (80 mg) of kerneiwit (20 mg) werd gescheiden op een 10% polyacrylamidegel en overgebracht op PVDF membranen zoals eerder beschreven [25]. Filters werden gedurende één uur bij kamertemperatuur in oplossing blotting. Membranen werden overnacht geïncubeerd bij 4 ° C met primaire antilichamen, gevolgd door blotting met een mierikswortel peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam gedurende één uur, en gevisualiseerd onder toepassing van een ECL detectiesysteem.
Northern blotting en RNase protection assays (RPA)
Totaal RNA werd bereid met behulp van TRIzol reagens (Invitrogen). De monsters werden op 1,2% agarose /formaldehyde gels en overgebracht op nitrocellulose ondersteund. De membranen werden gehybridiseerd met een met biotine gelabelde cDNA gastrische proton pump probe. Na hybridisatie met de GAPDH probe, een laad controle werden membranen gewassen en signalen werden gedetecteerd met een ECL detectiesysteem. RNase beschermingsexperimenten werden uitgevoerd met de RPA III kit van Ambion en RiboQuant multiprobe RNase Protection Assay System werd gebruikt om meerdere specifieke mRNAs gedetecteerd. 32P-gemerkte antisense RNA-probes werden bereid met de Human Apoptose HCC-2 en hCYC-1 Template sets en hybridisaties werden uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant.
Celcyclusanalyse
Maagkanker cellen werden geoogst via trypsine . Cellen werden verzameld, tweemaal met ijskoude PBS gewassen en gefixeerd in ijskoude 70% ethanol. Nadat tweemaal met ijskoud PBS, geresuspendeerd in PBS bevattende 100 U /ml RNase A en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 30 minuten gewassen, werden de cellen gekleurd met PI (20 mg /ml) en geanalyseerd met FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), zoals eerder beschreven [25].
in vitro
kinasebepalingen
De activiteiten van CDK2, CDK4 en GSK-3β werden gemeten zoals eerder beschreven [26, 27]. Kort samengevat, CDK2, CDK4 of GSK-3β werd immunogeprecipiteerd uit cytosolische (100 mg eiwit) of nucleaire (25 mg eiwit) extracten. Kinase-activiteit werd gemeten door incuberen immunogeprecipiteerd CDK2, CDK4 of GSK-3β in 40 ml kinasebuffer met 4 mg recombinant Snail-eiwit (om GSK-3β-geassocieerde kinase activiteit te meten), 5 mg van histon H1 (naar CDK2 geassocieerde kinase meten activiteit) of retinoblastoom eiwit (meten CDK4-geassocieerde kinase activiteit) bij 30 ° C gedurende 30 minuten. De monsters werden verwerkt zoals beschreven in voorgaande verslagen [28].
Resultaten
Remming van GSK-3β verzwakt HMBA-geïnduceerde celcyclus en SGC7901 celdifferentiatie
SGC7901 cellen opgebouwd aan de G0 /G1 celcyclus checkpoint en gedifferentieerd in een enterocyten fenotype na behandeling met HMBA [29]. GSK-3β bij aan de remming van celcyclus progressie bij differentiërende cellen [20, 30]. Dus of GSK-3β speelt een rol in HMBA SGC7901 geïnduceerde remming van de celcyclus werd onderzocht. Zoals aangetoond in figuur 1a, behandeling met HMBA geïnduceerde cellen te accumuleren op de G0 /G1 celcyclus. Behandeling met lithiumchloride (LiCI), waarbij GSK-3β remt in een Mg 2+ competitieve wijze [31], het gedeelte van cellen in de S-fase. Behandeling met een combinatie van LiCl en HMBA omgekeerde HMBA-gemedieerde cel G1 arrest. Vergelijkbare resultaten werden verkregen na behandeling met SB-415.286, een krachtige remmer van GSK-3β [32] (aanvullende bestandsinformatie 1). Deze resultaten suggereren dat GSK-3β een rol in HMBA-geïnduceerde G1 arrestatie kunnen spelen. Om te bepalen of HMBA resulteerde in celdood tijdens de 24 uur behandelingsperiode, werd eiwit gewonnen om na te gaan of er sprake was toegenomen PARP-splitsing en /of actieve caspase-3. Zoals getoond in Figuur 1b, was er geen toename van PARP klieving en actief caspase-3 tot 48 uur na behandeling HMBA. Een belangrijke vroege gebeurtenis in de terminale differentiatie van cellen is dat zij uit de celcyclus [6]. Aangezien GSK-3β gedocumenteerd een rol in de celcyclus [33] spelen, werd gepostuleerd dat remming van GSK-3β differentiatie kan remmen. Daarom de effecten van GSK-3β remmers op de inductie van HMBA-gemedieerde protonpomp expressie, een marker van maag differentiatie, onderzocht. SGC7901 cellen werden voorbehandeld met LiCl (figuur 1c en 1d) of SB-415.286 (Figuur 1e en 1f) bij verschillende concentraties gedurende een uur en vervolgens behandeld met HMBA voor 24 uur. LiCl remde HMBA geïnduceerde protonpomp expressie op een dosis-afhankelijke wijze. In overeenstemming met deze resultaten, SB-415286 geblokkeerd protonpomp eiwit en mRNA expressie, die werd veroorzaakt door HMBA. Samengenomen geven deze resultaten aan dat GSK-3β speelt een belangrijke rol in HMBA gemedieerde maag celdifferentiatie. Figuur 1 Remming van GSK-3β verzwakt HMBA-geïnduceerde celcyclus en SGC7901 celdifferentiatie. A SGC7901 cellen werden voorbehandeld met of zonder 10 mM LiCl gedurende 30 min gevolgd door combinatiebehandeling met 10 mM HMBA gedurende 24 uur, gevolgd door bepalen van de DNA-gehalte in flowcytometrie. B SGC7901 cellen werden behandeld met HMBA (10 mM) gedurende 24 uur of 48 uur en werden voor Western-blotanalyse. C &E, SGC7901 cellen werden voorbehandeld met of zonder 10 mM LiCl of 10 μMSB-415.286 gedurende één uur, gevolgd door combinatiebehandeling met 10 mMHMBA gedurende 24 uur. proton pomp status expressie werd bepaald via Western blotanalyse. D & F, totaal RNA werd geëxtraheerd uit cellen en Q-RT-PCR analyse voor protonpomp mRNA expressie werd uitgevoerd. (Gegevens stellen gemiddelde ± SD; * = p < 0,05 versus controle; * = p < 0,05 vs. HMBA alleen.)
Akt regelt maag differentiatie geïnduceerd door HMBA
GSK-3β wordt geïnactiveerd wanneer het. stroomafwaarts van gefosforyleerd Akt [34]. Derhalve zou worden voorspeld dat activering van Akt door PI3-kinase worden geassocieerd met de remming van GSK-3β en vervolgens remming van gastrische celdifferentiatie. Om deze hypothese te testen, werden SGC7901 cellen geïnfecteerd met Ad-Akt of controlevector. Infectie met Ad-Akt verhoogde expressie van gefosforyleerd Akt, Akt en gefosforyleerde GSK-3β eiwit (figuur 2a), in overeenstemming met eerdere resultaten tonen dat GSK-3β fungeert als een substraat van Akt. Zoals getoond in figuur 2b, infectie van SGC7901 cellen met de Ad-Akt adenovirale vector alleen had geen effect op protonpomp en mRNA expressie. Echter, infectie met Ad-Akt vector resulteerde in remming van protonpomp-mRNA-expressie geïnduceerd door HMBA tegenover HMBA en infectie van de controle (β-gal) adenovirus, wat suggereert dat signalering via de PI3-kinase /Akt pathway reguleert maag- cell differentiatie geïnduceerd door behandeling HMBA. Figuur 2 Akt regelt maag differentiatie geïnduceerd door HMBA. A, cytosol en nucleaire eiwitten werden geëxtraheerd uit cellen behandeld zoals aangegeven en gescheiden op SDS-PAGE en geblot met anti-fosfo-Akt, -Akt, fosfo-GSK-3β en GSK-3β, met behulp van anti-α-tubuline en Topo IIβ de controle van de cytosolische en nucleaire fracties respectievelijk. B, proton pomp expressie werd gemeten met behulp van western blotting volgde met overvloed kwantificering. (Gegevens stellen gemiddelde ± SD; * = p < 0,05 versus controle; † = p < 0,05 vs. alleen HMBA.). C, Totaal RNA (40 ug) werd gefractioneerd, overgebracht op nitrocellulose membranen en gehybridiseerd met een gelabelde cDNA protonpomp; blots werden gestript en opnieuw gesondeerd met GAPDH.
Behandeling met HMBA verhoogde de expressie en activiteit van GSK-3β in de kern
Testen of GSK-3β beïnvloed door HMBA behandeling GSK-3β activiteit werd bepaald door de fosforylatie van recombinant slak, een goed gekarakteriseerde substraat van GSK-3β [35, 36]. GSK-3β ligt in de cytosolische en nucleaire compartimenten van cellen, maar overwegend cytoplasma in de G1-fase. Daarom nucleaire en cytoplasmatische eiwitten werden gefractioneerd uit controle en HMBA-behandelde cellen en onderzocht voor GSK-3β activiteit. HMBA behandeling resulteerde in een toename van de activiteit van GSK-3β kern (figuur 3a) en GSK-3β remming verzwakte HMBA gemedieerde G1 arrestatie, hetgeen een rol van GSK-3β in HMBA geïnduceerde celcyclus. Ser9 fosforylering van GSK-3β verlaagt GSK-3β activiteit, terwijl Tyr216 fosforylering verhoogt GSK-3β activiteit [37]. Om de mechanismen die ten grondslag liggen aan toegenomen GSK-3β activiteit veroorzaakt door HMBA behandeling, Ser9-gefosforyleerd en Tyr216-gefosforyleerd GSK-3β eiwit expressie werd bepaald met behulp van western blotting analyseren. HMBA behandeling verhoogde nucleaire expressie niveaus van de totale GSK-3β en Tyr216-gefosforyleerd GSK-3β zonder dat hun expressie in het cytoplasma (figuur 3b). Interessant HMBA behandeling verhoogde Ser9-gefosforyleerde GSK-3β eiwitexpressie in zowel de cytosolische en nucleaire fracties. Vergelijkbare resultaten werden verkregen na behandeling met andere HPC's, SAHA en EMBA (Extra-bestand 2). Bovendien, HPC verhoogde de activiteit van GSK-3β in de kern zoals aangetoond door in vitro
kinasetesten (aanvullende bestandsinformatie 3). Deze resultaten suggereren dat HPC vergroot nucleaire GSK-3β activiteit ongeacht fosforylering op Ser9. Figuur 3 Behandeling met HMBA verhoogde de expressie en activiteit van GSK-3β in de kern. A SGC7901 cellen werden behandeld met (+) of zonder (-) 10 mMHMBA gedurende 24 uur en aan het einde van de behandeling geoogst. Cytosol en nucleaire fracties werden bereid en GSK-3β activiteit werd getest door de in vitro kinase assay gebruikt Snail-eiwit als substraat. Gefosforyleerd Snail eiwitsignalen werden densitometrisch gekwantificeerd en uitgedrukt als veelvoudverandering opzichte van onbehandelde controlegroepen. B SGC7901 cellen werden behandeld met 10 mM HMBA voor verschillende tijdstippen. Cytosolische en nucleaire eiwit fracties werden geëxtraheerd en Western blotting werd uitgevoerd met antilichamen tegen GSK-3β, fosfo-GSK-3β (Ser9), fosfo-GSK-3α /β (Tyr278 /Tyr216), α-tubuline of Topo IIβ.
remming van GSK-3β overschrijft HMBA-geïnduceerde CDK2 remming
Progression door de G1 is afhankelijk van CDK2 en CDK4 [38, 39]. Bepalen of GSK-3β regulatie van HMBA gemedieerde G1 celcyclus plaatsvindt via CDK2 en CDK4 remming SGC7901 cellen werden voorbehandeld met LiCl (figuur 4a) of SB-415.286 (Figuur 4b) en vervolgens onderworpen aan combinatiebehandeling met HMBA gedurende 24 uur voor immunoprecipitatie assays op de cellysaten met behulp van anti-CDK2 of anti-CDK4-antilichamen respectievelijk werden uitgevoerd. Bovendien, CDK2 en CDK4-activiteit werd bepaald met een in vitro kinase assay
. Behandeling met HMBA alleen remde CDK2 activiteit (boven, linker paneel) maar steeg CDK4-activiteit (boven, rechts paneel); remming van GSK-3β middels LiCl of SB-415286 aanzienlijk verzwakt HMBA inhibitie van CDK2 activiteit (onder). Behandeling met HMBA verhoogde de expressie en activiteit van GSK-3β in de kern. Samengenomen suggereren deze resultaten dat GSK-3β bijdraagt ​​tot HMBA gemedieerde G1 celcyclus door remming van CDK2. Figuur 4 Remming van GSK-3β overschrijft HMBA geïnduceerde CDK2 remming. SGC7901 cellen werden voorbehandeld met (+) of zonder (-) 10 mM LiCl (A) of 10 uM SB-415.286 (B) gedurende 30 min, gevolgd door combinatiebehandeling met 10 mM HMBA gedurende 24 uur. Eiwitextracten werden aan immunoprecipitatie met anti-CDK2 of anti-CDK4-antilichamen. Resulterende immuuncomplexen werden geanalyseerd op CDK2 activiteit met histon H1 als substraat (bovenste paneel) of CDK4 activiteit met Rb als substraat (onderste paneel). Gefosforyleerd histon H1 of Rb eiwit signalen werden densitometrisch gekwantificeerd en uitgedrukt als fold-wijziging ten opzichte van onbehandelde controle groepen.
GSK-3β reguleert nucleaire p27Kip1protein uitdrukking Belgique Om de mechanismen onderliggende HMBA gemedieerde G1 arrestatie en CDK2 remming verder te onderzoeken, celcyclus-regulerende mRNA-expressie werd geanalyseerd met RPA assays. Behandeling met HMBA verhoogde P27 Kip1 mRNA expressie, maar daalde p53, p57, P15 (figuur 5A rechts), cycline A en cycline D1 mRNA expressie (figuur 5A links). Echter, behandeling met LiCl toegenomen p21 waf1 mRNA maar beïnvloedde de expressie van andere genen. Vergelijkbare resultaten werden verkregen wanneer de cellen werden behandeld met SB-415286 (aanvullende bestandsinformatie 4). Deze resultaten suggereren dat GSK-3β regulatie van HMBA gemedieerde celcyclus de transcriptionele regulatie van de celcyclus genen met zich meebrengt. Figuur 5 mRNA expressie van genen met betrekking tot celcyclus. Een RNase protection assays werden uitgevoerd met RNA uit SGC7901 cellen behandeld met ofwel 10 mM HMBA, 20 mM LiCl, of een combinatie van HMBA en LiCl gedurende 24 uur gehybridiseerd met meerdere probes voor celcyclus afhankelijke kinaseremmers (A; hCC- 2) of cyclinen (B; hCYC-1). B SGC7901 cellen werden voorbehandeld met (+) of zonder (-) 10 mM LiCl (rechts) of 10 uM SB-415.286 (links) gedurende 30 min, gevolgd door combinatiebehandeling met 10 mM HMBA gedurende 24 uur. Gehele cel proteïne extracten werden gescheiden op SDS-PAGE, overgebracht naar PVDF-membranen, en immunoblotting met antilichamen tegen p27Kip1, p21waf1, CDK2 of β-actine. Belgique Om de mechanismen die ten grondslag liggen aan GSK-3β-geassocieerde celcyclus verder te analyseren, de expressie van p21 waf1 en p27 Kip1 SGC7901 eiwitten in cellen behandeld met HMBA in aanwezigheid of afwezigheid van LiCl of SB-415286 werd onderzocht. Toevoeging van LiCl (figuur 5B rechts) of SB-415286 (Figuur 5B links) verzwakte de inductie van p27 Kip1 maar niet p21 waf1 eiwit expressie, wat suggereert dat p27 Kip1 participeert in de celcyclus overgangen geregeld door GSK-3β. Wanneer p27 Kip1 accumuleert in de kern het bindt aan CDK2, remmen de activiteit, en uiteindelijk induceert celcyclus. Voorts HMBA (10 mM) verhoogde p27 Kip1 eiwitexpressie in het cytosol en de kern van 0 tot 24 uur na behandeling (figuur 6a). HMBA (0-5 mM) verhoogde p27 Kip1 expressie na 24 uur in cytosolische fracties en na 48 uur HMBA (5-10 mM) verhoogde p27 Kip1 expressie in nucleaire fracties (figuur 6b). Toevoeging van LiCl (figuur 6c) of SB-415286 (figuur 6d) geblokkeerd HMBA-toegenomen p27 Kip1 nucleaire expressie zonder dat p27 Kip1 expressie in het cytoplasma, wat suggereert specifieke regulering van de nucleaire p27 Kip1 expressie door GSK-3β. Om de rol van GSK-3β in de regulering van de nucleaire p27 Kip1 expressie verder aan te tonen werden cellen getransfecteerd met siRNA gericht tegen GSK-3β (figuur 6e). -RNAi-gemedieerde onderdrukking van GSK-3β werd bevestigd door immunoblotting en verzwakt nucleaire p27 Kip1 inductie door HMBA zonder dat cytosolische p27 Kip1 inductie. Om de rol van GSK-3β in de regulering van de nucleaire p27 bevestigen Kip1 expressie SGC7901 cellen werden getransfecteerd met een vector die codeert voor de geactiveerde vorm van GSK-3β (GSK-3β-CA) of een lege controlevector. Cytosol en nucleaire eiwitten werden geëxtraheerd en western blotting werd uitgevoerd om p27 Kip1 expressie te bepalen. Transfectie van SGC7901 cellen met de GSK-3βCA plasmide resulteerde in een verhoogde p27 Kip1 in de nucleaire fractie (figuur 6F) zonder dat dit invloed p27 Kip1 niveaus in het cytoplasma. Overexpressie van de actieve vorm van GSK-3β werd bevestigd met behulp van western blotting en in vitro
kinasebepalingen behulp Snail-eiwit als substraat (figuur 6G). Tezamen geven deze resultaten aan dat de GSK-3β participeert in de regulatie van de celcyclus door de specifieke regulering van de nucleaire p27 Kip1 eiwitexpressie. Figuur 6 Nuclear p27 Kip1 expressie gemoduleerd door GSK-3β. A & B SGC7901 cellen werden behandeld met HMBA (10 mM) gedurende een tijdsverloop (A) of met verschillende concentraties gedurende 24 uur. Cytosolische en nucleaire eiwit fracties werden geëxtraheerd en Western blotting werd uitgevoerd met antilichamen tegen p27Kip1, α-tubuline of Topo IIβ. K& D, SGC7901 cellen werden voorbehandeld met (+) of zonder (-) 20 mM LiCl (C) of 10 uM SB-415.286 (D) gedurende 30 min, gevolgd door combinatiebehandeling met 10 mM HMBA gedurende 24 uur. Cytosol en nucleaire eiwitten werden geëxtraheerd voor analyse van p27Kip1 eiwitexpressie. E, SGC7901 cellen werden getransfecteerd met siRNA gericht op GSK-3β of controle siRNA. Vierentwintig uur na transfectie werden cellen behandeld met HMBA gedurende nog 24 uur. Cytosol en nucleaire eiwitten werden geëxtraheerd voor analyse van p27Kip1 eiwitexpressie. Knockdown van GSK-3β expressie werd bevestigd door Western blotting met behulp van anti-GSK-3β antilichaam. F, SGC7901 cellen werden geïnfecteerd met Ad-HA-GSK-3βS9A of Ad-β-gal met een MOI van 10 pfu /cel. Na 48 uur incubatie, cytosol en nucleaire eiwitten werden geëxtraheerd en Western blotting uitgevoerd met behulp van anti-p27Kip1, anti-HA en anti-GSK-3-antilichamen, respectievelijk met behulp van anti-α-tubuline of Topo IIβ als ladingcontrole. GSK-3β activiteiten werden bepaald door in vitro kinase assay gebruikt Snail-eiwit als substraat (onderste paneel). p27Kip1 signalen werden densitometrisch gekwantificeerd en uitgedrukt als fold-wijziging ten opzichte van a-tubuline of TopIIβ.
GSK-3β regelt p27Kip1binding om CDK2
HMBA toegenomen p27 Kip1 eiwitexpressie geremd CDK2 activiteit en een verhoogde activiteit van CDK4 (Figuur 4). Uittreksels uit controle of HMBA-behandelde cellen werden immunogeprecipiteerd te onderzoeken p27 Kip1 binding aan CDK2 en CDK4. Zoals aangetoond in Figuur 7a, HMBA behandeling verhoogde het niveau van p27 Kip1 in de complexen aan immunoprecipitatie met anti-CDK2 maar niet complexen aan immunoprecipitatie met anti-CDK4. Re-sonderen van de filters met anti-CDK2 en anti-CDK4 antilichamen bevestigd dat de immunoprecipitaten van de bedienings- en HMBA-behandelde cellen hetzelfde niveau van CDK2 en CDK4 bevatte. Daarom HMBA blijkt een selectieve toename van p27 Kip1 binding aan CDK2 veroorzaken. Om te analyseren of de remming van GSK-3β invloed op de associatie van p27 Kip1 met CDK2, SGC7901 cellen werden voorbehandeld met LiCl of SB-415286 en onderworpen aan combinatiebehandeling met HMBA gedurende 24 uur; hele-celextracten werden immunogeprecipiteerd. Behandeling met GSK-3β remmers, LiCl (figuur 7b) of SB-415286 (Figuur 7c) geblokkeerd p27 Kip1 binding aan CDK2. Deze resultaten suggereren dat GSK-3β essentieel is voor HMBA geïnduceerde verhoogde p27 Kip1 binding aan CDK2. Om de rol van GSK-3β in de regulatie van p27 Kip1 associatie met CDK2 bevestigen, werden SGC7901 cellen getransfecteerd met een vector die codeert voor de geactiveerde vorm van GSK-3β of Ad-β-gal. Whole-cell eiwit werd geëxtraheerd en immunogeprecipiteerd. Zoals in figuur 7d, SGC7901 transfectie van cellen met de GSK-3β-CA vector resulteerde in een verhoogd niveau van p27 Kip1 in de complexen aan immunoprecipitatie met anti-CDK2 vergeleken met transfectie van het controle plasmide. Dit suggereert dat GSK-3β is niet alleen noodzakelijk voor HMBA gemedieerde p27 Kip1 binding aan CDK2, maar ook voldoende om de associatie van p27 te verhogen Kip1 met CDK2 in SGC7901 cellen. Figuur 7 GSK-3β regulering van p27 Kip 1 associatie met CDK2. A SGC7901 cellen werden behandeld met (+) of zonder (-) 10 mM HMBA gedurende 24 uur. Eiwitextracten werden aan immunoprecipitatie met anti-CDK2 of anti-CDK4-antilichamen. Normale konijn IgG werd gebruikt als controle. De CDK2-of-CDK4-geassocieerde p27Kip1 in de verkregen immuuncomplexen werd geanalyseerd door Western blotting met behulp van anti-p27Kip1 antilichaam met anti-CDK2 of -CDK4 antilichaam loading controle. B & C, SGC7901 cellen werden voorbehandeld met (+) of zonder (-) 10 mM LiCl (B) of 10 uM SB-415.286 (C) gedurende 30 min, gevolgd door combinatiebehandeling met 10 mM HMBA gedurende 24 uur. Eiwitextracten werden immunogeprecipiteerd met een anti-CDK2-antilichaam. CDK2 de bijbehorende p27Kip1 in de verkregen immuuncomplexen werd Soortgelijke A. D, SGC7901 cellen werden geïnfecteerd met Ad-HA-GSK-3βCA of vectorcontrole (Ad-β-gal) bij een MOI van 10 pfu /cel geanalyseerd. Na 48 uur incubatie werd volledige cellen eiwit geëxtraheerd en immunogeprecipiteerd met anti-CDK2-antilichaam (bovenste paneel). p27Kip1 werd geanalyseerd door Western blotting Soortgelijke A. Overexpressie van HA-gelabeld GSK-3CA werd bevestigd door Western blotting met behulp van anti-GSK-3β antilichaam (onderste paneel). GSK-3β activiteit werd bepaald met een in vitro kinase assay gebruikt
Snail-eiwit als substraat (onderste paneel).
Discussie
PI3-kinase /Akt /GSK-3β signaalroute is betrokken bij de regulatie van celgroei, differentiatie en apoptose van diverse celtypen [46]. In de onderhavige studie, remming van GSK-3β via complementaire aanpak (dwz chemische remming en constitutief actieve Akt overexpressie) verzwakt protonpomp expressie, een maat van maag-achtige differentiatie in de maag van tumor afgeleide SGC7901 cellijn.
cel proliferatie en differentiatie worden traditioneel gezien als wederzijdse processen met celcyclus terugtrekking vereist voor terminale differentiatie [40] en P27 Kip1 een belangrijke rol [41, 42]. Genetische deletie van p27, maar niet p21 is aangetoond dat de maag celdifferentiatie beïnvloeden, terwijl gedwongen p27 Kip1 expressie leidt tot differentiatie, wat suggereert dat p27 Kip1 is belangrijker dan p21 waf1 in de regulatie van de maag cel differentiatie. In overeenstemming met deze bevindingen, remming van GSK-3β verzwakte-HMBA gemedieerde maag celdifferentiatie en remming van GSK-3β geblokkeerde HMBA-gemedieerde nucleaire p27 Kip1 expressie, terwijl overexpressie van de actieve vorm van GSK-3β verhoogde nucleaire p27 Kip1 expressie, wat suggereert een belangrijke rol in de regulatie van de maag celdifferentiatie door de regulering van de nucleaire p27 Kip1 expressie.
  • zweer artikel
    •   
  • Gastric structuur
    •   
  • Verzorging van de Maag
    •   
  • onderzoeken

    • onderzoeken

    onderzoeken

    Other Languages

    Maag Gezondheid © https://www.stomachillness.com/nl