PLOS ONE: alta expressão de choque térmico Protein 90 está associado a tumor agressividade e mau prognóstico em pacientes com câncer gástrico avançado

Abstract

A proteína de choque térmico 90 (HSP90) é abundante e altamente associado com mau prognóstico em muitas doenças malignas. No entanto, o papel de HSP90 no cancro gástrico não foi completamente elucidado. O objetivo deste estudo é investigar a relação de expressão HSP90 com os parâmetros clínico e prognóstico no câncer gástrico avançado, e estimar a alteração da expressão HSP90 após a quimioterapia neoadjuvante. HSP90 e metalopeptidase de matriz 9 (MMP-9) a expressão do antigénio foi avaliada por imuno-histoquímica em 322 amostras de carcinoma gástrico avançado. As relações entre HSP90 e os parâmetros clínico e prognóstico foram analisadas. A resposta do nível de HSP90 foi avaliado no efeito quimioterapêutico em 54 pacientes receberam 1-2 ciclos de quimioterapia neoadjuvante. A expressão positiva de HSP90 se verificou ser 69,6% em 322 amostras de carcinoma gástrico avançado. a expressão da proteína HSP90 foi significativamente associada com a invasão de profundidade ( P Art < 0,001), metástases em linfonodos ( P Art < 0,001) e estágio da doença ( P <
; 0,001). As taxas positivas de expressão HSP90 foram mais elevados em ambos os grupos serosa invasão proeminente ( P Art < 0,001) eo grupo metástase linfonodal ( P Art < 0,001). Além disso, HSP90 foi significativamente correlacionada com MMP-9 entre 322 tecidos de câncer gástrico ( P Art < 0,001). Na análise uni e multivariada, HSP90 foi um fator prognóstico independente tanto para a sobrevida livre de recorrência (RFS) e sobrevida global (OS). Estes resultados sugerem que HSP90 podem desempenhar um papel importante na invasão do tumor, metástase e prognóstico, e pode agir como um alvo promissor para a previsão de prognóstico

Citation:. Wang J, Cui S, Zhang X, Wu Y, Tang H (2013) elevada expressão de choque térmico Protein 90 está associado a tumor agressividade e mau prognóstico em pacientes com câncer gástrico avançado. PLoS ONE 8 (4): e62876. doi: 10.1371 /journal.pone.0062876

editor: Yuan-Jia Chen, Pequim College Hospital Union Medical, Peking Union Medical College, da Academia Chinesa de Ciências Médicas, China

Recebido: 26 de setembro de 2012; Aceito: 26 de março de 2013; Publicação: 26 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho não tinha fonte de financiamento específico. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é o quarto câncer mais comumente diagnosticado ea segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1] - [2]. A ressecção completa do tumor e gânglios linfáticos adjacentes é o único tratamento curativo eficaz [3]. No entanto, após a ressecção completa, a taxa de sobrevida em 5 anos permanece baixa, relatado para ser apenas 23% [4]. Além disso, mesmo a adição de novela, terapias direcionadas molecularmente a quimioterapia padrão fornecem apenas um benefício de sobrevivência limitada [5]. Portanto, a identificação de novos marcadores de prognóstico e preditivos é importante, a fim de facilitar a selecção dos doentes que têm maior probabilidade de beneficiar de abordagens terapêuticas multimodais.

proteínas de choque térmico (HSPs) formam um conjunto de proteínas evolutivamente conservadas . HSPs mamífero foram classificados principalmente em quatro famílias de acordo com o seu peso molecular: HSP90, HSP70, HSP60 e pequenas HSPs (15-30 kDa) que incluem HSP27. Sabe-se que as HSPs são expressas em resposta a uma série de tensões incluindo hipertermia, os radicais livres derivados de oxigénio, análogos de aminoácidos, etanol e metais pesados ​​[6]. Recentemente, tem sido mostraram que HSPs foram significativamente associados com cânceres [7].

A proteína de choque térmico (HSP) 90 é uma chaperona molecular importante para o dobramento de proteínas, disposição intracelular e volume de negócios proteolítica dos reguladores-chave da célula crescimento e sobrevivência [8]. Muitos estudos têm demonstrado que a Hsp90 é a sobre-expressão em tumores sólidos, e tem associação significativa com o prognóstico [9] - [11]. Ele também relatou que a expressão HSP90 é rico em linhas celulares gástricas caner [12], ainda há grandes estudos têm sido realizados sobre a expressão em tumores humanos e sua associação com variáveis ​​clínico-patológicas. Portanto, o objetivo do nosso estudo é demonstrar a relação de expressão HSP90 com os parâmetros clínico e prognóstico no câncer gástrico avançado, e examinar a resposta de expressão HSP90 à quimioterapia neoadjuvante.

Materiais e Métodos

pacientes e dados clínicos

o estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão Institucional e Comité das Affiliated Oncológica Hospital de Guangzhou Medical College ética humana. consentimento por escrito para usar as amostras para fins de pesquisa foi obtido de todos os pacientes antes da cirurgia.

Foram analisados ​​tecidos de 322 pacientes (197 homens e 125 mulheres) com carcinoma gástrico avançado que foram tratados no Hospital Filiado oncológica de Guangzhou Medical College (Guangzhou, China) entre 2005 e 2011. a distribuição etária era de 22 a 84 anos, ea idade média foi de 56,11 ± 11,42 anos. De acordo com a nota anaplásico, 15 tumores eram bem diferenciados, 102 foram moderadamente diferenciado, e 205 foram pouco diferenciado. Todos os pacientes com câncer gástrico avançado incluídos no estudo tinham um diagnóstico histológico de diagnóstico que o tumor invadiu camada muscular ou serosa gástrica, o que foi confirmado patologicamente após a cirurgia. Relevantes características patológicas clínicas (Tabela 1) foram todos obtidos a partir de arquivos dos pacientes. estágio do tumor foi classificado de acordo com o sistema TNM 7ª Control Union International Cancer (UICC) [13]. Os casos foram seleccionados consecutivamente com base na disponibilidade de tecidos de ressecção e dados de seguimento. Cento e cinquenta e sete em 322 pacientes que foram acompanhados por pelo menos 36 meses tiveram dados de acompanhamento completos, que foram utilizados para a avaliação do prognóstico. Além disso, 54 casos em 322 pacientes foram submetidos a quimioterapia neoadjuvante, enquanto os outros não receberam radioterapia ou quimioterapia antes da gastrectomia. Estes 54 pacientes todos submetidos a uma biópsia de diagnóstico antes da quimioterapia neoadjuvante, e amostras tumorais combinadas foram obtidos durante a ressecção cirúrgica. Todos os espécimes de 54 pacientes tiveram tecidos tumorais residual suficiente para avaliar. Um total de 322 amostras de carcinoma gástrico avançado foram utilizados na imuno-histoquímica (IHQ) análise.

pré-operatório quimioterapia

O diagnóstico inicial de 54 pacientes foi feito depois de Janeiro de 2010. Os pacientes com estágio III-IV (M0) câncer gástrico foram inscritos para a quimioterapia neoadjuvante. estadiamento do tumor pré-tratamento foi realizado de acordo com um protocolo uniforme que incluiu endoscopia com endosonography, uma tomografia computadorizada do tórax e abdome, e laparoscopia diagnóstica.

Todos os 54 pacientes foram tratados com o regime FOLFOX (leucovorin, 5-fluorouracil , e oxaliplatina) [14] e gastrectomia foram submetidos com linfadenectomia D2 após a quimioterapia. A quimioterapia neoadjuvante consistiu de infusão intravenosa de oxaliplatina (85 mg /m ^{2, 2 h) e leucovorina (200 mg /m 2, 2 h), seguido de 5-fluorouracilo 2600 mg /m 2 como uma infusão contínua de 24 horas. Os ciclos foram repetidos em intervalos de 2 semanas durante um ou dois ciclos. ressecção cirúrgica do tumor foi programado 2 semanas após a conclusão da quimioterapia. Havia 16 pacientes que receberam um ciclo de regime FOLFOX, enquanto outros receberam dois ciclos de quimioterapia neoadjuvante.}

IHC Coloração

Foi utilizado um procedimento IHC descrito anteriormente [15]. Resumidamente, as amostras de tecidos, embebidos em parafina e fixados em formalina a partir de pacientes com consentimento foram cortadas em secções de 4-um e colocados em lamelas revestidas com polilisina, desparafinados em xileno e re-hidratadas numa série de álcoois graduados. As lâminas de tecido foram, em seguida, tratada com 3% de peróxido de hidrogénio em metanol durante 10 minutos para extinguir a actividade da peroxidase endógena, e os antigénios foram recuperadas em tampão de citrato de sódio 0,01 M (pH 6,0) usando um forno de microondas. Após 30 min de pré-incubação de soro de cabra normal a 10% para evitar coloração não específica, as amostras foram incubadas durante a noite utilizando um anticorpo primário, quer anti-HSP90 (Abcam, # ab13495, Reino Unido, diluição 1:200) ou anti-MMP-9 ( Abcam, # ab38898, Reino Unido, 1:200 diluição), em um recipiente de humidif içada a 4 ° C. As lâminas de tecido foram tratados com um sistema de detecção de peroxidase de rábano não-biotina de acordo com as instruções do fabricante (Gene Tech). Os resultados IHC foram avaliados por dois investigadores independentes cegos para a identidade dos pacientes e estado clínico. Em casos discrepantes, um patologista reviu os casos, e foi alcançado um consenso

HSP90 e MMP-9 intensidades de coloração foram classificados em uma escala de 0-3 de acordo com o percentual de tumor positivas (0, <.; células positivas 5%; 1, 5-20%; 2, 20-50%; ou 3, > 50%). A expressão é muito baixa para 0, para baixo 1, moderada e alta durante 2 para 3 (Fig. 1). HSP90 e MMP-9 expressão foram classificados como negativo para escores ≤1 e positivo para os escores ≥2.

Follow-up

Os pacientes tiveram consultas de acompanhamento a cada 3 meses para os primeiros 3 anos após a cirurgia, a cada 6 meses para os próximos 2 anos, e anualmente. O período médio de acompanhamento foi de 27 meses (variação, 4-82 meses) em 322 pacientes, enquanto havia 33 meses em 157 pacientes cujo prognóstico foi analisada. Recorrência foram confirmadas por níveis de marcadores tumorais incluindo CEA, AFP, CA 19-9, CA125 e CA724, B-tipo de inspeção ultra-sônica a cada 3 traças, e tomografia computadorizada (TC) ou ressonância magnética (MRI) a cada 6 meses após a gastrectomia. As principais causas de morte foram recorrência do câncer gástrico. A sobrevida global (OS) foi calculado a partir da data da cirurgia até a data da morte ou do último acompanhamento. sobrevida livre de recidiva (RFS) foi definida a partir da data da cirurgia até a data de recaída ou a partir do período de ressecção da data da última observação feita.

Análise Estatística

Todos as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS (versão 16.0; Chicago, IL, EUA). Interdependência entre a expressão de HSP90 e dados clínicos foi calculada utilizando o teste do qui-quadrado, e exibido no cross-mesas. diferenças entre os grupos foram examinados usando o Student t
-teste. As curvas de sobrevida foram plotados utilizando o método de Kaplan-Meier e analisadas pelo teste de log-rank. fatores prognósticos significativos encontrados por análise univariada foram inseridos em uma análise multivariada utilizando o modelo de riscos proporcionais de Cox. Comparações múltiplas foram corrigidas utilizando o método de Bonferroni. Bicaudal valores
P foram calculados. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando P
. ≪ 0,05

Resultados

A Associação de HSP90 com variáveis ​​clínicopatológicos

Houve 322 casos de gástrico avançado câncer que foram investigados por imuno-histoquímica. coloração HSP90 localizado principalmente no citoplasma das células tumorais. Observou-se sobre-expressão de HSP90 em 224 dos 322 (69,6%) das amostras de câncer gástrico.

De acordo com os resultados de imuno-histoquímica, nós correlacionados status de HSP90 em 322 espécimes câncer gástrico com oito outros parâmetros clínico-patológicas amplamente reconhecidas (Tabela 1 ). Nossas análises mostraram que HSP90 níveis de expressão positiva foram significativamente maiores em pacientes com câncer gástrico com o aumento do tamanho do tumor ( P
= 0,001), local do tumor ( P Art < 0,001), invasão de profundidade ( P Art < 0,001), presença de metástase ganglionar ( P Art < 0,001) e estágio da doença ( P Art < 0,001) (Tabela 1). Não houve associação significativa entre sexo, idade e grau de diferenciação com expressão HSP90.

Impacto da HSP90 superexpressão na invasão e metástase no câncer gástrico

Notavelmente, a correlação de invasão serosa proeminente e metástase linfática com HSP90 positividade sugeriu um papel potencial de HSP90 em aumento da invasão e metástase de câncer gástrico. Por isso, foi investigada a relação entre a expressão da proteína HSP90 e MMP-9 em cancro gástrico.

As taxas positivas de expressão de HSP90 foram 89,9% e 92,3% no grupo de invasão serosa mais proeminente (T3 /T4) e mais grupo frequente linfonodal (N1-3), enquanto havia apenas 44,4% e 19,0% em T2 e N0 ( P Art < 0.001 e P Art < 0,001, respectivamente) ( Tabela 1). O nível de HSP90 em T3 apresentaram nenhuma diferença com os de T4, e, entretanto, a expressão de HSP90 não apresentaram diferenças significativas entre N1, N2 e N3 (Dados não mostrados). Além disso, a expressão da proteína HSP90 foi significativamente associada com MMP-9 expressão em 322 tecidos do carcinoma gástrico. Dos 98 pacientes com baixa expressão HSP90, 86 pacientes (87,8%) tinha baixa MMP-9 expressão, enquanto 134 dos 224 pacientes (59,8%) com alta expressão de HSP90 também teve alta MMP-9 expressão ( P <
; 0,001) (Figura 2)

Efeito do Tumor HSP90 nível de proteína no prognóstico

a análise de sobrevivência mostrou que a RFS e oS foram significativamente diferente entre os 157 pacientes de acordo com a expressão de HSP90 (<.. em> P Art < 0.001 e P Art < 0,001, respectivamente) (Fig 3).. A RFS médio pós-operatório e OS foram 27,0 meses e 33,0 meses, respectivamente. A RFS médio pós-operatório e OS de pacientes com coloração positiva de HSP90 foram 15,0 meses e 20,0 meses, enquanto que os de pacientes com coloração negativa de HSP90 foram 60,5 meses e 64,0 meses. Os 3 anos e 5 anos as taxas de sobrevivência cumulativos de pacientes com expressão HSP90 negativo foram 83,1% e 75,7%, em comparação com 39,4% e 30,1% dos pacientes com expressão positiva HSP90, respectivamente (Tabela 2).

para examinar o impacto da HSP90 superexpressão na RFS e oS, foi realizada a análise univariada de variáveis ​​clínico-patológicas tradicionais de prognóstico. Os resultados da análise univariada mostraram que as variáveis ​​significativas na análise RFS e OS incluído superexpressão HSP90 ( P Art < 0.001 e P Art < 0,001, respectivamente), maior tamanho do tumor ( P
= 0,002 P
= 0,002, respectivamente), proeminente invasão serosa ( P Art < 0.001 e P Art < 0,001, respectivamente) e metástases em linfonodos ( P Art < 0.001 e P Art < 0,001, respectivamente) foram fatores prognósticos positivos para a RFS e OS em pacientes com câncer gástrico (Tabela 2). No entanto, sexo, idade, local do tumor ou a diferenciação de status não tinha valor prognóstico na RFS e OS de pacientes com câncer gástrico.

Além disso, para avaliar o impacto independente da HSP90 superexpressão na RFS e OS, um Cox multivariada proporcional modelo de risco foi ajustado para o tamanho do tumor, profundidade de invasão, metástase linfonodal e expressão HSP90. Nossos resultados demonstraram que a expressão HSP90 foi um fator prognóstico independente para ambos os RFS (HR = 2,158, IC 95%: 1,165-3,999; P
= 0,015) e OS (HR = 1,888, IC 95%: 1.022- 3.486; P
= 0,042) dos pacientes com câncer gástrico. O tamanho do tumor, profundidade de invasão e metástases em linfonodos todos tiveram valor prognóstico independente na análise multivariada (Tabela 3).

Resposta de HSP90 em neoadjuvante Quimioterapia

A diferença na sobrevida observada em pacientes com câncer gástrico nos levou a questionar se a expressão HSP90 foi relacionada com a administração de quimioterapia. Detectamos expressão HSP90 em materiais de biópsia de diagnóstico e amostras cirúrgicas correspondentes em 54 pacientes com câncer gástrico.

HSP90 foi expressa em 66,7% (36/54) das biópsias e 57,4% (31/54) dos espécimes de ressecção. A quimioterapia neoadjuvante não alterou a expressão HSP90 entre as amostras de biópsia e tumorais ( P
= 0,321) (Fig. 4). Em 24 (44,4%) casos, expressão HSP90 foi idêntico na biópsia e as amostras correspondentes. 13 (24,1%) casos apresentaram regulação positiva da expressão de HSP90 e 17 (31,5%) casos apresentaram regulação negativa da expressão HSP90 nas amostras cirúrgicas em comparação com o material de biópsia.

Discussão

proteínas de choque térmico ( HSPs) são encontrados para ser aumentada em muitos tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. A sua expressão pode desempenhar um papel importante na manutenção da homeostase de proteína das células malignas, mesmo no ambiente hipóxico e acidótico hostil do tumor. Enquanto isso, as HSPs permitir que as células tumorais a tolerar alterações genéticas que de outra forma seria fatal [16]. Tem sido relatado que a sobre-expressão de HSPs é associado com prognóstico pobre, tal como HSP27 no cancro rectal [17], a HSP70 em adenocarcinoma pancreático [18] e a HSP90 em tumores do estroma gastrointestinal [19]. No entanto, o papel de HSP90 no câncer gástrico ainda não foi completamente elucidado.

No presente estudo, descrevemos o valor prognóstico da expressão da proteína HSP90 no cancro gástrico avançado, e determinou a relação de expressão HSP90 com invasão, metástase, ea resposta quimioterápico de pacientes com câncer gástrico. A imuno-histoquímica foi utilizada para analisar a correlação da expressão da proteína HSP90 com fatores patológicos clínicos e efeito prognóstico de 322 pacientes com câncer gástrico. O resultado demonstrou que os níveis de proteína HSP90 foram significativamente associados com o tamanho do tumor, local do tumor, invasão profundidade, metástases em linfonodos e estágios clínicos. Além disso, a análise de Kaplan-Meier mostrou que, em geral, os pacientes HSP90-positiva tiveram pior prognóstico do que os pacientes HSP90-negativos por ambos RFS e OS. Além disso, a análise do modelo de Cox multivariada indicou que o estatuto de expressão HSP90 foi identificado como um fator de risco independente para ambos os RFS e OS. Os nossos dados sugerem que a HSP90 pode desempenhar um papel importante no prognóstico de tumores e que a HSP90 pode ser um factor potencial de prognóstico do cancro gástrico.

Sabe-se que a degradação da matriz extracelular (ECM) era um sinal para o início de invasão e metástase, e as MMPs são importantes moléculas envolvidas na degradação da ECM durante a invasão e metástase [20]. Chu et ai. [21] relatou que o câncer de MMP-9 foi significativamente correlacionada com profundidade de invasão e metástase ganglionar e que pacientes com câncer gástrico MMP-9-positivas tiveram resultados piores do que aqueles com tumores MMP-9-negativos. Além disso, tem sido relatado que a HSP90 e MMP-9 podem constituir-se como um complexo em linfomas de células grandes anaplásicas, e MMP-9 pode ser activado por HSP90 para promover a invasão celular. [22] Os nossos resultados demonstraram que a expressão de HSP90 e MMP-9 foram correlacionados uns com os outros, o que implica uma maior actividade invasiva e metástases em células de cancro de alta expressão de HSP90. HSP90 pode ser uma molécula-chave para a progressão de cancro gástrico. Além disso, a HSP90 foi altamente expressa em profundidade de invasão, especialmente nos carcinomas de T3 e T4. Em relação ao estado do linfonodo estava em causa, os pacientes com metástase ganglionar tendem a mostrar expressão HSP90 elevada, enquanto que não houve diferença estatisticamente entre N1, N2 e N3. Colectivamente, a expressão de HSP90 no cancro gástrico promove a agressividade do tumor sugere que a HSP90 pode ser um alvo viável na terapia do cancro.

Além disso, investigou-se a resposta de HSP90 em quimioterapia neoadjuvante, e descobriu que a quimioterapia neoadjuvante não alterou a expressão de HSP90 entre a biópsia e tumorais espécimes de câncer gástrico. Ele sugeriu-nos que os níveis de HSP90 permanecem praticamente inalteradas, com efeito quimioterápico, o que nos proporcionou a oportunidade de fazer uma importante observação de que a expressão dos níveis de HSP90 nos tumores era estável, não importa se ele recebeu quimioterapia neoadjuvante ou não. Tem sido relatado que a HSP90 confere resistência à quimioterapia no cancro [23] - [24]. Além disso, a inibição da expressão de HSP90 pode reduzir a angiogénese e a proliferação de células de cancro gástrico, e superar a resistência à quimioterapia [12]; [25]. Tomados em conjunto, a segmentação de HSP90 com inibidores químicos pode ser considerada no tratamento do cancro gástrico, especialmente quando HSP90 foi altamente expressa no cancro gástrico.

Em resumo, demonstramos a sobre-expressão de HSP90 pode desempenhar um papel importante na invasão tumoral , metástase e prognóstico, e pode funcionar como um alvo promissor para a previsão de prognóstico no câncer gástrico.

Reconhecimentos

Agradecemos os dados clínicos fornecidos pelo departamento de patologia.

• PLOS ONE: Enterococcus faecalis infecção provoca inflamação, Produção intracelulares OXPHOS-Independent ROS, e danos no DNA em câncer gástrico humano Cells
• PLoS ONE: Funções MicroRNA-219-2-3p como um supressor tumoral no câncer gástrico e é regulado pelo DNA metilação