PLOS ONE: regulação negativa do RPL6 por siRNA inibe a proliferação e progressão do ciclo celular da Cancer Cell gástrico humano Lines

Abstract

O nosso estudo anterior revelou que a proteína ribossômica humana L6 (RPL6) foi regulada em multirresistentes células de cancro gástrico e sobre-expressão de RPL6 poderia proteger do cancro gástrico de apoptose induzida por drogas. Foi ainda demonstrado que a sobre-regulação de RPL6 crescimento acelerado e melhorada in vitro de formação de colónias de células capacidade GES enquanto a sub-regulação de RPL6 exibiu os resultados opostos. O presente estudo foi desenhado para investigar o papel potencial da RPL6 na terapia do câncer gástrico para a clínica. A expressão de ciclina E e RPL6 em tecidos de cancro gástrico e mucosa gástrica normal foi avaliado por imunoistoquímica. Verificou-se que RPL6 e ciclina E foram expressas a um nível mais elevado em tecidos de cancro gástrico do que na mucosa gástrica normal e os dois foram correlativo em cancro gástrico. O tempo de sobrevida dos pacientes no pós-operatório foi analisado por análise de Kaplan-Meier e verificou-se que os pacientes com expressão positiva RPL6 mostrou tempo de sobrevida mais curta do que os pacientes que, com expressão negativa RPL6. RPL6 era então geneticamente regulados negativamente em SGC7901 câncer gástrico e linhas de células AGS por siRNA. Foi demonstrado que a regulação negativa da RPL6 reduzida formação de colónia capacidade das células cancerosas gástricas in vitro e reduziram o crescimento de células in vivo. Além disso, a sub-regulação de RPL6 poderia suprimir G1 para a fase S transição nestas células. Além disso, constatamos que RPL6 siRNA regulada ciclina E expressão em células SGC7901 e AGS. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que RPL6 foi sobre-expresso em tecidos humanos e gástricos causados ​​mau prognóstico. A sub-regulação de RPL6 podem suprimir o crescimento celular e na progressão do ciclo celular, pelo menos, através de regulação da ciclina E e para baixo que pode ser utilizada como uma nova abordagem para a terapia do cancro gástrico

citação:. Wu Q, Y Gou, Wang Q, Jin H, Cui G, Zhang Y, et al. (2011) regulação negativa do RPL6 por siRNA inibe a proliferação e progressão do ciclo celular de linhas celulares de cancro gástrico humano. PLoS ONE 6 (10): e26401. doi: 10.1371 /journal.pone.0026401

editor: Xin-yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 07 de agosto de 2011; Aceito: 26 de setembro de 2011; Publicado: 17 de outubro 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte por doações do Programa Nacional de Pesquisa básica da China (No. 2010CB732400, No. 2010CB529300) e da National Science Foundation Natural da China (No. 30.801.349). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico, com elevada moral, foi um dos cancros mais malignas em países asiáticos. A sua ocorrência foi um processo com multi-factores e multi-etapas, envolvidos em alterações em muitas moléculas, incluindo a activação de proto-oncogenes ou inactivação de genes supressores de tumores, alterações nas proteínas relacionadas com o ciclo celular e assim por diante. Na última década, um grande número de proto-oncogenes e genes supressores de tumores foram encontrados. Apesar do número considerável de genes já descritos, os novos genes com actividades potenciais ou-supressores de tumores oncogénicos ainda estão a ser identificados. No entanto, o mecanismo molecular da carcinogénese gástrica permanece obscura.

Ribossoma é essencial para a síntese proteica em todas as células, o qual é constituído de RNAs ribossomais (ARNr) e proteínas ribossomais (RPS). Muitos RPS também desempenham vários papéis que são independentes da biossíntese de proteínas, que é chamada função extra-ribossomal [1]. O aumento mais pesquisas demonstraram que o transtorno de tradução da proteína participou na tumorigênese e muitas proteínas ribossomais foram disfuncional em tumores, mas os mecanismos ainda eram desconhecidas [2]. Tem sido proposto que muitas RPS actuam como supressores tumorais haploinsufficient em peixes e diversos RPs genes podem também ser oncogenes em espécie humana [3]. O relatório mais cedo sobre as relações entre RPs e tumores foi publicado em 90 s do disfuncional 20 ^{th século, o que demonstrou a associação de RPS19 com a progressão do carcinoma do cólon e diferenciação [4] .Thereafter, mais e mais RPs foram encontrados em tumores , tais como elevada expressão de RPL19 em tumores da mama [5], a sobre-expressão de RPL7a e RPL37 em amostras de tecido de próstata de cancro [6], de maior expressão de RPL15 no cancro esofágico [7], RPS marcador de detecção o mais cedo do escamoso humano carcinoma do colo uterino [8], e a sobre-expressão de RPL36a associado com a proliferação celular em carcinoma hepatocelular [9] e assim por diante. Relatórios sobre a associação dos RPs com a carcinogênese ainda estavam aumentando [2], [10]. No entanto, as funções exatas de RPs no desenvolvimento do tumor são diversas e ainda precisar de mais esclarecimentos.}

Anteriormente, foram analisados ​​os perfis de mRNA de uma linha gástrica humana célula cancerosa SGC7901 e seu multi-resistente variante SGC7901 /VCR pelo diferencial exibido PCR e supressão de hibridização subtrativa [11], [12]. RPL6 foi identificada como uma das sobre-expressa genes em SGC7901 /ADR em comparação com SGC7901, o qual foi adicionalmente confirmada por RT-PCR e análise de transferência de Northern [13]. Estudos posteriores demonstraram que a sobre-regulação de RPL6 protegido células gástricas cancerosas da apoptose induzida por adriamicina e aumentada a resistência de células de cancro gástrico a múltiplos fármacos quimioterapêuticos, incluindo vincristina, adriamicina, etopside, cisplatina e 5-fludrouracil [13]. Estes dados indicaram que RPL6 poderia promover os fenótipos malignas de células de câncer gástrico, o que nos levou a realizar o estudo subsequente de explorar ainda mais o papel exacto do RPL6 na carcinogênese e desenvolvimento de câncer gástrico. Então descobrimos que geneticamente aumento da regulação do RPL6 em células GES poderia acelerar o crescimento e melhorar in vitro colónia capacidade de formação de células GES, enquanto a regulação negativa da RPL6 poderiam exibir os resultados opostos. Além disso, a regulação positiva de RPL6 poderia promover G1 para S de transição de fase de células GES. Um estudo adicional demonstrou que a sobre-regulada RPL6 ciclina E em células de expressão GES [14]. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que RPL6 poderia promover os fenótipos malignas das células cancerosas gástricas e RPL6 pode desempenhar um papel oncogênico na tumorigênese e desenvolvimento de câncer gástrico, o que nos levou a realizar o presente estudo para explorar o papel potencial da RPL6 no gene a terapia do câncer gástrico e pode ser usado como uma nova abordagem para a terapia do cancro gástrico.

resultados
expressão

RPL6 e ciclina e em amostras de cancro gástrico humano e combinados tecidos não neoplásicas adjacentes

Para explorar as relações entre RPL6 e expressão da ciclina e com o desenvolvimento de câncer gástrico, foi detectada expressão RPL6 e ciclina e em tecidos de câncer gástrico humano e combinados tecidos não neoplásicas adjacentes por coloração imuno-histoquímica. Os resultados revelaram que RPL6 e ciclina localizada quase em citoplasma e apenas ocasionalmente em núcleos em células de cancro gástrico (Fig. 1a). Uma análise mais aprofundada descoberto que a proporção positiva (incluindo amostras que manchado) de RPL6 foi de 84% (46 de 55 pacientes), enquanto que a relação positiva de ciclina E foi de 75% (41 de 55 pacientes) em amostras de cancro gástrico humano. A relação positiva de ambos RPL6 e ciclina E foi de 70% (38 de 55 pacientes), enquanto o rácio negativo (incluindo espécimes que não mancham) de ambos RPL6 e ciclina E foi de 11% (6 de 55 doentes) em amostras de cancro gástrico humano . A relação positiva de ambos RPL6 e ciclina E foi de 18% (8 de 55 pacientes) em tecidos não-neoplásicas adjacentes correspondentes (dados não mostrados). Como as diferenças entre a expressão da ciclina RPL6 e expressão em amostras de cancro gástrico humano, não houve diferença. O presente estudo demonstrou que as expressões RPL6 e ciclina E em amostras de cancro gástrico humano foram relativo (Fig 1B, p <. 0,05), o que pode desempenhar um papel con-generosa para o desenvolvimento de câncer gástrico e RPL6 e ciclina E pode servir como um biomarcador para o diagnóstico de câncer gástrico e um gene alvo para terapia de câncer gástrico. No final do acompanhamento, o tempo de sobrevivência dos pacientes foram analisados ​​pelo método de Kaplan-Meier e os resultados mostraram que durante os pacientes que foram seguidos, os pacientes com E tanto RPL6 positiva e ciclina positivo apresentou um tempo de sobrevivência mais curto e pior prognóstico do que aqueles com ambos RPL6 negativo e ciclina expressão de e negativa, ou aqueles com expressão positiva RPL6 positiva e ciclina e negativo ou com RPL6 negativo e ciclina, respectivamente (Figura 2 A, p. < 0,01), que pode ser revelado que os pacientes com ambos RPL6 positiva e ciclina E positivo mostrou mau prognóstico. Também é demonstrado que os pacientes com expressão negativa RPL6 mostrou tempo de sobrevivência mais longa do que RPL6 os positivos (Fig 2B, p <. 0,01), e os pacientes com ciclina expressão E positivo mostrou mau prognóstico (Fig 2C, p <. 0,01). Portanto, a conclusão pode ser tirada que RPL6 podem serviu como um biomarcador para avaliar o prognóstico de pacientes com câncer gástrico.

A expressão de RPL6 em linhas celulares de cancro gástrico e seus derivados

Para explorar ainda mais o potencial papel de RPL6 em terapia génica do cancro gástrico, células SGC7901 e AGS foram transfectadas com ARNsi específicos de RPL6 e a piscina misto de variantes de células resistentes a G418 foi produzida. As variantes resistentes a G418 abrigam siRNA específico do RPL6 foram devidamente nomeado como SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 e SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. As células resistentes a G418 abrigam plasmídeos siRNA mexidos foram concebidos como SGC7901-siControl e AGS-siControl respectivamente. Como mostrado na Figura 3A, a expressão RPL6 foi significativamente regulada para baixo em SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 e SGC7901-siRPL6-2, células AGS-siRPL6-2 em comparação com as células progenitoras e as células de controlo. No presente estudo, SGC7901-siRPL6-2 e AGS-siRPL6-2 mostrou resultados inibidores mais eficazes, o que indicou que as células SGC7901-siRPL6-2 e AGS-siRPL6-2 poderia ser usado como um bom modelo de célula para esclarecer o potencial papel da RPL6 em terapia de gene de câncer gástrico para a clínica.

regulação negativa do RPL6 suprimir o crescimento de células de câncer gástrico in vitro

para estudar se a infra-regulação da expressão RPL6 poderia inibir o crescimento de SGC7901 e AGS células, células progenitoras, células de controlo e as suas variantes foram semeadas em placas de cultura e o seu crescimento foi monitorizado diariamente com ensaio de MTT. Tal como indicado pelas curvas de crescimento na Figura 3B, o controlo (SGC7901-siControl e AGS-siControl) as células mostraram uma taxa de crescimento semelhante a parental (SGC7901 e AGS) de células, respectivamente, ao passo que SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 e SGC7901 células -siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 apresentaram menor taxa de crescimento do que as células de controle e SGC7901-siRPL6-2, as células AGS-siRPL6-2 apresentou a menor taxa de crescimento (Fig 3B, p <. 0,05). O crescimento independente de ancoragem destas células foi ainda analisada com ensaio de formação de colónia em agar mole. Foi revelado que SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 e SGC7901-siRPL6-2, células AGS-siRPL6-2 produzido muito menos colónias de células em agar mole do que as suas células progenitoras e células de controlo (Fig 3C, p. < 0,05), células nomeadas com SGC7901-siRPL6-2 e AGS-siRPL6-2 produziu o mínimo de colónias. Estes dados sugerem que a regulação negativa da RPL6 podem suprimir o crescimento de células de câncer gástrico e inibem a capacidade de formação de colónias de células SGC7901 e AGS.

RPL6 siRNA tumorigênese inibido de células de câncer gástrico in vivo

Para confirmar ainda mais os efeitos de RPL6 na tumorigénese do cancro gástrico, ensaio de formação de tumor foi realizada em ratinhos nus. SGC7901, AGS e SGC7901-siRPL-2, células AGS-siRPL6-2 foram inoculadas por via subcutânea na direita ou esquerda parte superior das costas de ratinhos nus atímicos em um único local. (A Fig. 4A e C) Quatro semanas mais tarde, os ratinhos foram mortos e os tumores transplantados foram excisadas e os tamanhos do tumor foram avaliadas (Figura 4B e D, p. ≪ 0,05). Houve uma diminuição significativa dos tamanhos de xenoenxertos em RPL6 células para baixo-regulado. Estes dados indicaram que knock-down de RPL6 poderia suprimir tumorigénese de células de câncer gástrico in vivo e RPL6 podem desempenhar um papel fundamental na promoção do crescimento maligno das células cancerosas gástricas in vivo.

RPL6 desacelerou G1-S transição de fase SGC7901 células

Para desvendar os mecanismos subjacentes a função supressora de RPL6 no crescimento de células de câncer gástrico, foram analisados ​​os efeitos da RPL6 sobre a distribuição do ciclo celular de SGC7901 células (Fig. 5A). Como mostrado na Figura 5B, as células SGC7901-siRPL6-1 mostrou um ligeiro aumento da percentagem de fase G1 e diminuiu percentagem da fase S, enquanto que as células SGC7901-siRPL6-2 mostraram aumento da percentagem significativa da fase G1 e diminuiu percentagem da fase S (P < 0,05 ) em comparação com células parentais e células controle. Estes indicaram que siRNA específico do RPL6 poderia desacelerar a transição G1-S de SGC7901 células.

RPL6 expressão da ciclina E em células cancerosas gástricas regulada para baixo ao nível da proteína

É bem conhecido que a progressão G1-S é controlada por complexos e /CDK2 ciclina D /CDK4 e ciclina, que são regulados por membros da família INK4, p21 e p27, respectivamente. A expressão destes reguladores em células SGC7901 e AGS e suas variantes foram determinados por análise Western Blot. Tal como indicado na Figura 6, a expressão de ciclina E foi significativamente regulada negativamente em células AGS-siRPL6-2 SGC7901-siRPL6-2 e. Expressões de CDK2, p16, p21 e p27 não foi alterada em variantes celulares SGC7901 e AGS. Estes dados sugerem que a sub-regulação de RPL6 diminuiu a expressão de ciclina E em células SGC7901 e AGS, que pode delinear o papel potencial de RPL6 e ciclina E no desenvolvimento do cancro gástrico e RPL6 podem usado como um gene alvo para o cancro gástrico em a clínica.

Discussão

o presente estudo demonstrou que RPL6 e ciclina e foram sobre-expressos em tecidos de câncer gástrico e há uma correlação positiva entre eles em tecidos com câncer gástrico. Seguem-se resultados revelaram que os pacientes com expressão negativa RPL6 mostrou tempo de sobrevivência mais do que aqueles com expressão positiva RPL6, o que sugere que os pacientes positivos RPL6 mostrou mau prognóstico. Outras pesquisas demonstraram que a sub-regulação de RPL6 por RPL6-específica siARN inibiu o crescimento de proliferação e independente de ancoragem de linhas celulares de cancro gástrico in vitro, reprimido progressão do ciclo celular e suprimiu ciclina expressão de E, além disso, knockdown de RPL6 por ARNsi específicos de RPL6 suprimida a formação de tumores a capacidade de células gástricas cancerosas in vivo.

no nosso estudo anterior, os genes expressos diferencialmente associados com a resistência a múltiplos fármacos de células cancerosas gástricas foram isoladas através de apresentação diferencial por RT-PCR e hibridação subtractiva [11], [ ,,,0],12]. RPL6, um componente da subunidade grande do ribossoma, foi assim isolado um clone como sobre-expressos em células de cancro gástrico multirresistentes [11]. Foi demonstrado que RPL6 poderiam proteger as células gástricas cancerosas da apoptose induzida por droga quimioterapêutica [13]. Estes dados sugerem que RPL6 pode envolver na regulação do fenótipo maligno de câncer gástrico. Outras estudo foi projetado para explorar o papel da RPL6 na tumorigênese e desenvolvimento de câncer gástrico, e os resultados sugerem que a regulação positiva de RPL6 acelerado crescimento e na colónia vitro formando capacidade das células GES enquanto down-regulação da RPL6 apresentaram resultados opostos. Além disso, a regulação positiva de RPL6 acelerada G1 a S transição de fase de células GES, pelo menos, através de up-regulação da expressão de ciclina E, enquanto a regulação negativa da RPL6 mostraram resultados opostos [14]. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que RPL6 pode desempenhar um papel oncogênico na tumorigênese e desenvolvimento de câncer gástrico e poderá servir como uma nova abordagem para a terapia genética do cancro gástrico.

Hoje em dia, cada vez mais pacientes morreram de câncer por causa de os fenótipos malignos deles. terapia do cancro perturbado pessoas no mundo. Além de quimioterapia e tratamento de cirurgia, a terapia genética é um romance e tratamento do câncer promissor. Um dos métodos mais usados ​​para a terapia génica é a interferência de ARN (ARNi). ARNi, um mecanismo de silenciamento de gene altamente conservado desempenha um papel importante na regulação da expressão do gene. silenciamento de genes por um mecanismo pós-transcricional envolvendo RNA de cadeia dupla homólogo foi descoberto pela primeira vez em sistemas artificiais onde RNA fita dupla (dsRNA) foi introduzido através de injecção ou por expressão de construções transgênicas. Este fenómeno ocorre por pequeno ARN interferente (siRNA) no citoplasma das células de mamífero. Na tecnologia de siRNA, foram considerados dois mecanismos de libertação, a entrega directa de nucleótidos ARNip sintético e introdução de um ADN de plasmídeo (pADN) codificando uma construção de curto hairpin (shRNA) que seria enzimaticamente degradada em siRNA [15]. SiRNA desempenhado suas funções inibidoras, combinando com as sequências de mRNA e inibiu a consequente expressão de mRNA e tradução, e trabalhou como regulação negativa. Hoje em dia, mais e mais cientistas descobriram que derrubou expressão gênica por siRNA poderia suprimir significativamente o crescimento de tumores e metástases. inibidor ligada ao X de proteína apoptose (XIAP), um importante membro dos inibidores de proteína de apoptose (IAP) da família, está envolvido no controlo da divisão celular, a proliferação celular e a inibição da apoptose [16], [17]. A sub-regulação de XIAP por siARN pode suprimir significativamente a proliferação de células tumorais e sensibilizar células tumorais aos agentes quimioterapêuticos [18], [19]. A osteopontina (OPN) de proteína, que foi sobre-expresso na maioria dos doentes com cancro gástrico e associada com a sua patogenia, desempenhou um papel importante na proliferação, invasão, metástase e sobrevivência do cancro gástrico [20]. Em seguida, sub-regulação da OPN por ARNsi específicos de OPN inibiram significativamente o crescimento, a migração e a invasão de células de cancro gástrico [21]. CML66, um antigénio tumoral romance que desempenhou um papel oncogénica, foi sobre-expresso na maioria das linhas celulares de cancro e tipos de cancro [22], derrubar a sua expressão por CMl66-específica siARN inibiu significativamente a proliferação, invasão e metástase de células HeLa, tanto em vivo e experimentos in vitro [23]. FABP5, que codifica o ácido gordo cutânea proteína de ligação (C-FABP), é sobre-regulada no cancro da próstata e actua como um oncogene putativo. A sub-regulação de FABP5 por siARN de crescimento de células de cancro específico da próstata FABP5 eficazmente inibida em ratinhos nus [24]. Além disso, quando RPS13 proteína ribossômica que aprimorou linha de células de câncer gástrico crescimento SGC7901 foi derrubado por siRNA, que o crescimento celular SGC7901 inibiu significativamente específicos de RPS13 e colônia capacidade de formação in vitro e suprimiu a capacidade formação de tumores em ratinhos nus [25]. Pesquisas anteriores também descobriram que a entrega sistémica de siRNA via atelocolagénio, que visa especificamente os tumores, é seguro e viável para a terapia do cancro no cancro da próstata [26]. Portanto, as provas acima sugeriu que siRNA, por inibição da expressão génica pode ser uma nova abordagem para a terapia do cancro e fazer a terapia genética do cancro viável para o tratamento clínico.

No presente estudo, a expressão de ciclina E e RPL6 em gástrica tecidos de cancro e os tecidos não neoplásicos adjacentes combinados foram detectados e os resultados indicaram que RPL6 e ciclina e mostraram maior expressão em tecidos de cancro gástrico do que os tecidos não neoplásicos adjacentes emparelhados. Além disso, existe uma correlação entre RPL6 e ciclina E expressão em tecidos de cancro gástrico, o que sugeriu que elas podem desempenhar um papel-con generosa no desenvolvimento do cancro gástrico e RPL6 pode servir como um biomarcador para o diagnóstico do cancro gástrico. Seguem-se os resultados demonstraram que pacientes com ambas as expressões positivas positivos e ciclina E RPL6 mostrou uma menor sobrevida e pior prognóstico do que o controle correspondente e também indicou que os pacientes com expressão negativa RPL6 mostrou mais tempo de sobrevida e melhor prognóstico do que pacientes com expressão positiva RPL6, que sugeriu que RPL6 podem serviu como um biomarcador para prognóstico do câncer gástrico e um gene alvo para terapia de câncer gástrico na clínica.

para explorar ainda mais o potencial viabilidade de RPL6 como alvo a terapia genética do cancro gástrico na clínica, batemos down expressão RPL6 em SGC7901 e células AGS por ARNsi específicos de RPL6, os resultados mostraram que a sub-regulação de RPL6 em linhas celulares parentais cancro gástrico (SGC7901 e AGS) inibiu o crescimento celular de forma eficaz e em capacidade de formação de colónia in vitro. Além disso, a análise do ciclo celular indicou que a sub-regulação de RPL6 desacelerado G1 para a fase S de células de cancro gástrico. A análise por Western blot demonstrou que RPL6 inibiu a progressão do ciclo celular através de sub-regulação da ciclina E. experiências de formação de tumores em ratinhos nu sugeriu que a sub-regulação de RPL6 poderia suprimir a formação de tumores in vivo.

Ciclina E, uma célula de chave proteína ciclo que desempenharam papéis fundamentais na transição G1-S estava em desordem em muitos tumores diferentes [27], [28], [29], [30], [31]. Pesquisas anteriores demonstraram que a ciclina E foi uma importante molécula na tumorigênese. No presente estudo, nós descobrimos que a expressão de ciclina E, em conjunto com RPL6 foi maior em tecidos de cancro gástrico humano do que em tecidos não-neoplásicas adjacentes correspondentes, o que sugeriu o papel desempenhado da ciclina E no desenvolvimento do cancro gástrico. Outras pesquisas demonstraram que RPL6 afectado o crescimento celular através da regulação da ciclina E, que mostrou que a elevada expressão de ciclina E acelerou o crescimento celular, enquanto a baixa expressão da ciclina E desacelerado proliferação celular. Ciclina E e RPL6 podem desempenhar papéis con-generosa para o desenvolvimento de câncer gástrico.

Em conclusão, o presente estudo demonstrou que a expressão RPL6 e ciclina foram associados uns com os outros em tecidos com câncer gástrico e eles podem jogar con- generosas papéis no desenvolvimento do cancro gástrico, o que sugere que pode RPL6 utilizado como uma ferramenta de diagnóstico de cancro gástrico. Seguir-se a análise dos dados demonstrou que os pacientes com expressão negativa RPL6 mostrou mais tempo de sobrevida e melhor prognóstico do que pacientes com expressão positiva RPL6 no pós-operatório, o que sugeriu que RPL6 serviu como um biomarcador para prognóstico do câncer gástrico e um alvo novo gene para terapia de câncer gástrico. Um estudo adicional indicou que a sub-regulação da expressão específica por RPL6-RPL6 siARN SGC7901 inibiu o crescimento celular e na capacidade de formação de colónias in vitro, desacelerado SGC7901 célula G1 a transição de fase S, e suprimiu a formação de tumores in vivo. Em conclusão, nosso estudo confirmou que RPL6 siRNAs pode ser usado como uma nova abordagem para a terapia do cancro gástrico para a clínica.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Para amostras de tecido , todos os pacientes foram informados consentimento para usar o excesso de espécimes patológicos para fins de pesquisa. Os protocolos utilizados neste estudo foram aprovados pela Protecção do hospital de Seres Humanos Comissão. O uso de tecidos humanos foi aprovado pelo conselho de revisão institucional da Quarta Universidade Médica Militar e foi conformado com a Declaração de Helsínquia, e com a legislação local. Pacientes que oferecem amostras para o estudo assinaram o termo de consentimento informado. Para a pesquisa animal, todos os procedimentos para a experimentação em animais foram realizados de acordo com as diretrizes Animal Care Institucional e Comitê de uso do Centro de Experimentação Animal da Quarta Universidade Médica Militar. O ID aprovação para o uso de animais foi No. 10218 por Experiment Centro animal da Quarta Universidade Médica Militar.

Os espécimes de tecido e linhas celulares

Os espécimes de tecido embebidas com parafina foram coletados de 55 pacientes com câncer gástrico submetidos a gastrectomia em nosso hospital entre 2004 e 2009. Todos os casos de câncer de estômago e tecidos não tumorais adjacentes foram diagnosticados clinicamente e patologicamente. Os dados sobre características clínicas e prognósticos dos pacientes foram coletadas e analisadas retrospectivamente. Um total de 55 pacientes foram acompanhados até o final do ano de 2009, e dois deles foram perdidos durante o período de acompanhamento. gástrico humano linha celular de adenocarcinoma SGC7901 foi obtido a partir da Academia de Ciências Médicas militar, AGS foi obtido a partir da Shanghai Cell Bank (Xangai, China). As duas linhas de células foram preservadas em nosso instituto. Todas as linhas celulares foram mantidas em RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo inactivado pelo calor (FCS) a 37 ° C com 5% de CO _{2 numa incubadora humidificada (Forma Scientific, Marietta, OH).}

a imuno-histoquímica e imuno-histoquímica de pontuação

desparafinados e seções reidratados foram lavados em água doce durante 10 minutos. recuperação de antigénio induzida por calor foi realizado durante 20 minutos a 95 ° C com tampão de citrato de sódio 10 mM (pH 6,0). Após as lâminas foram arrefecidos à temperatura ambiente durante 40 minutos, que foram bloqueadas em peróxido de hidrogénio a 3% durante 20 minutos e, em seguida, no estado líquido confinando soro de cabra normal durante 40 minutos. Depois disso, eles foram deixados reagir durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários para IgG, RPL6 e ciclina (Santa Cruz). Depois de reaquecimento para 40 minutos, que foram, em seguida, feito reagir com o segundo anticorpos (Zhongshan Goldenbridge Biotecnologia CO.LTD) durante mais 40 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, os produtos foram desenvolvidos com 3,3'-diaminobenzidina e contrastadas com hematoxilina. Scoring foi concluída por um patologista especializado e um cientista que ficaram cegos com a informação clínica e patológica. Em caso de discrepância, um consenso foi alcançado pela conferência. As proporções de células positivas (0 a 3) e as intensidades de coloração (0 a 3) foram avaliadas separadamente com uma ampliação de × 200. O primeiro foi calculado por contagem do número de células de tumor coradas entre o número total de células tumorais, por exemplo, quando 25% do total de células foram coradas, a proporção era de pontuação 1 e é igual a 50% a 2, 75% iguais a 3, 0% é igual a 0. a pontuação intensidade foi avaliada pela cor do núcleo da célula tumoral manchado, especificamente, a pontuação 0 significa acromática, +1 significa âmbar, +2 significa amarelo, e 3 significa castanho. pontuação combinada + 1~ + 2 foram definidos "negativo" e + 3~ + 6 foram consideradas "positivo".

construção de plasmídeo e transfecção

Dois pares de hairpin pequena interferência RNA (siRNA ) para oligos RPL6 foram concebidos de acordo com as directrizes de concepção siRNA de TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. comparar sequências alvo para a base de dados do genoma humano numa pesquisa BLAST a eliminar a partir da consideração qualquer sequência alvo com 21 pares de bases contíguas de homologia com outras sequências de codificação . Para oligo-1, sentido: 5'-GATCCGGAGAAGGTTCTCGCAACTTTCAAGAGAAGTTGCGAGAACCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3 ', anti-sentido: 5'AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGGTTCTCGCAACTTCTCTTGAAAGTTGCGAGAACCTTCTCCG-3'; para oligo-2, sentido: 5'-GATCCGTCGAGTTCCTCTACGAAGATTCAAGAGATCTTCGTAGAGGAACTCGATTTTTTGGAAA-3 ', anti-sentido: 5'-AGCTTTTCCAAAAAATCGAGTTCCTCTACGAAGATCTCTTGAATCTTCGTAGAGGAACTCGACG-3'; Um duplex de ADN precipitação também foi concebido como controlo, para oligo-1, sentido: 5'-GATCCGGTGAGATCTTCGACACAGTTCAAGAGACTGTGTCGAAGATCTCACCTTTTTTGGAAA-3 ', anti-sentido: 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGGTGAGATCTTCGACACAGTCTCTTGAACTG TGTCGAAGATCTCACCG-3'. Para o recozimento de modo a formar cadeias duplas de ADN, 0,01 M de cada um de sentido e anti-oligos foram utilizados. Os duplexes foram diluídas e depois ligado com pSilencer3.1-H1 neo vetor (Co TaKaRa Biotecnologia (Dalian)., Ltd). Os produtos foram transformados em células DH5a competentes-. colónias resistentes à ampicilina foram seleccionados, identificados por digestão de restrição, e ainda confirmada por sequenciação de ADN. De acordo com as instruções dos fabricantes, plasmídeos siARN da RPL6 foram transfectados em células SGC7901 utilizando Lipofectamina 2000 reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA), respectivamente. Vinte e quatro horas após a transfecção, a G418 (400 ug /ml) foi adicionado no meio de cultura para o estabelecimento de clones estáveis. Os clones foram expandidos misturados durante mais de 2 meses. As células SGC7901 e AGS (também chamadas de células parentais) expressando estavelmente RPL6 exógenas foram nomeados como SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 e SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. E as células transfectadas com siControl foram nomeados como SGC7901-siRPL6 Controle e Controle de AGS-siRPL6 (também chamadas de células de controle).

A proliferação celular ensaio

3- (4,5-dimetiltiazol-2- il) -2,5-difenil-tetrazólio (MTT) foi realizada para avaliar o efeito de RPL6 sobre a proliferação celular, como descrito anteriormente [32]. A absorvância a 490 nm (A490) de cada poço foi lida num leitor de microplacas BP800 (Biohit, Helsínquia, Finlândia). Cada experiência foi realizada em quadruplicado e foram repetidas 3 vezes.

agar mole ensaios de formação de colónias

ensaio de formação de colónia em agar mole foi utilizada para determinar o potencial de crescimento celular independente de ancoragem. Doze placas de poços foram cheios com 0,5 ml de 0,5% de agar nobre (Invitrogen) em RPMI 1640 suplementado com soro de vitelo a 10% como uma camada inferior e deixou-se solidificar a 4 ° C durante a noite. Um total de 200 células foram suspensas em 0,25 ml de 0,3% de agarose e semearam-se sobre o ágar de fundo. placas de cultura de células foram mantidas durante 2 semanas num CO _{2 incubadora. O número de colónias foi contado sob um microscópio.}

tumorigenicidade em ratinhos nus

formação do tumor foi realizado para avaliar os efeitos de RPL6 na tumorigenicidade in vivo. Ratinhos BALB /c nu com 4 a 6 semanas foram fornecidos por Shanghai Câncer Institute e alojados em gaiolas micro-isoladoras ar sob pressão positiva, e mantido a uma temperatura constante (22 ° C) e humidade durante o estudo tumorigenicidade. Aproximadamente 3 × 10 ^{6 células em fase log foram colhidas e injectadas subcutaneamente na parte superior das costas de ratinhos BALB /c nus. Pelo menos três ratinhos nus foram utilizadas para cada grupo. Os ratinhos foram mortos 4 semanas mais tarde e o peso do tumor de cada murganho foi avaliado. Todos os procedimentos para a experimentação animal foram realizados de acordo com as diretrizes Animal Care Institucional e Comitê de uso do Centro de Experimentação Animal da Quarta Universidade Médica Militar.}

ciclo celular análise

Para a análise de ciclo celular distribuição de fases, SGC7901 e suas variantes em fase log foram colhidas e lavadas duas vezes com PBS gelado. As pelotas de células foram fixadas em 70% de etanol, tratou-se com RNase A (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) e coradas com iodeto de propídio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

• PLOS ONE: O reparo de DNA Gene APE1 T1349G Polimorfismo e risco de câncer gástrico em uma população chinesa
• PLOS ONE: perda da proteína leucemia promielocítica no câncer gástrico: Implicações para o IP-10 Expressão e Tumor-linfócitos infiltrantes