Relação do fator 1α hipoxia-inducible e p21
WAF1 /cip1 expressão para célula apoptose e o resultado clínico em pacientes com câncer gástrico da arte abstracta
Fundo
hipoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) desempenha um papel essencial na homeostase de oxigénio. A expressão de genes de HIF-1α-indutível associada com a progressão do tumor. p21 medeia a paragem do ciclo celular e é um dos genes a jusante alvo de HIF-1.
Pacientes e métodos
foi examinada a relação entre o HIF-1α e expressão de p21, a apoptose e a progressão do tumor usando amostras de tecido obtidas a partir de 126 cirurgicamente pacientes com câncer gástrico.
resultados da análise imunohistoquímica indicaram que a perda de expressão p21 correlacionou positivamente com a idade do paciente e do tamanho do tumor. Metástases linfonodais foi significativamente mais frequente em tumores com perda de expressão p21 (P = 0,022). tumores HIF-1α-positivo /p21-negativos tinham um índice de apoptose menor do que quaisquer outras amostras de tumores, e os pacientes com tumores HIF-1α-positivo /p21-negativos também tinham um prognóstico significativamente pior do que as outras populações de pacientes.
Conclusão
Estes resultados sugerem que a perda de expressão de p21 resultados HIF-1α-dependentes na diminuição da apoptose, aumento da sobrevivência de células e tumores mais agressivos.
fundo
O crescimento descontrolado de células cancerosas resulta frequentemente em condições de hipóxia em células tumorais massas. resultados tumor hipóxia de um desequilíbrio entre o consumo elevado de oxigênio nas células tumorais rapidamente ciclismo e suprimento de oxigênio insuficiente, devido à falta de uma rede vascular fisiológica. Os organismos multicelulares desenvolveram mecanismos celulares que medeiam uma cascata de respostas adaptativas ao moleculares hipóxia. HIF-1α é um factor de transcrição que activa a expressão do gene através da ligação ao elemento responsivo a hipoxia (HRE), uma sequência de ADN presente a montante que actua em cis de vários genes essenciais para a resposta celular a hipoxia [1]. genes-HIF-1a responsivo também funcionam na via glicólise e na hematopoiese e angiogênese, através de todos que as células adquirem um metabolismo adaptado por hipoxia e aumento da oferta de oxigênio [2]. Recentemente, HIF-1α emergiu como um regulador chave no crescimento do cancro gástrico [3].
A apoptose é um mecanismo de morte celular evolutivamente conservada que também ocorre na resposta celular ao stress hipóxico adaptativa. Apoptose, também, é uma salvaguarda importante contra o desenvolvimento do tumor. Os tumores que exibem perda dos níveis de p53 tumor-suppressor gene exibem reduzidos de morte celular induzida por hipoxia e um aumento associado em progressão tumoral [4]. O gene p21 (WAF1) foi clonado em uma tela genética para efectores a jusante de p53 e, separadamente, uma tela para reguladores a montante de quinases dependentes de ciclina (CDKs) como proteína de CDK-interagindo (CIP1) [5]. O promotor de p21 pode ser transactivado por HIF-1 numa linha de células de cancro da próstata humano, indicando que o p21 é um gene alvo de HIF-1 [6]. Além disso, a expressão da p21 induzido por hipoxia foi abolida em células sem HIF-1α, mas não em células parentais [7].
HIF-1α pode, por conseguinte, promover tanto a sobrevivência das células e a paragem do crescimento através da indução de hipoxia de genes responsivos. No presente estudo, nós examinamos o papel de HIF-1α no controle da progressão do tumor hipóxico, examinando a relação entre a expressão de HIF-1α, a expressão da p21 e apoptose em tecidos de pacientes com cancro gástrico.
Materiais e métodos
materiais clínicos
sujeitos foram 126 pacientes com câncer gástrico (85 homens, 41 mulheres; faixa etária de 27 a 88 anos, idade média, 65,2 anos) submetidos à gastrectomia em nossa instituição em 1994. ressecção curativa foi realizada em 77 pacientes e ressecção não curativa em 49. amostras de tecidos ressecados foram fixados em solução de formol a 10% e embebidos em parafina. Secções (4 mm de espessura) foram montadas em lâminas de vidro. Todas as amostras foram examinadas macroscopicamente e histologicamente, com base em critérios propostos pelas Regras Gerais para o Estudo câncer gástrico [8]. O exame histológico foi realizado em preparações de tecido coradas com hematoxilina e eosina (H & E). No estudo atual, os tumores foram divididos em dois tipos histológicos: o tipo diferenciado, compreendendo adenocarcinoma papilar e adenocarcinoma tubular, e tipo indiferenciada, compreendendo adenocarcinoma pouco diferenciado, carcinoma de células anel de sinete, e adenocarcinoma mucinoso. Dois blocos de parafina foram preparadas para todos os pacientes "contendo tanto um tecido tumoral e tecido normal adjacente, e a outra de tecido de tumor contendo a invadir o nível mais profundo da parede do estômago.
Coloração imuno-histoquímica
Todos os espécimes foram imunocoradas com um anticorpo monoclonal anticorpo contra p21 WAF1 /CIP1 (SX118, diluída 1:50, DAKO, Glostrup, Dinamarca), p53 (DO-7, diluída 1:50, DAKO, Glostrup, Dinamarca), e HIF-1α (NB 100- 105, diluído 1:. 100, Novus Biologicals, Littleton, CO, EUA) [9] Após desparafinização e re-hidratação, as lâminas para p21 e p53 imunocoloração foram autoclavadas em tampão de citrato (0,01 M, pH 6,0) a 120 ° C durante 10 minutos;.. 0,001 M de EDTA (pH 8,0) foi usado para HIF-1αimmunostaining para facilitar a reactividade do antigénio de tecido embebido fixo com o anticorpo da peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação das amostras em metanol contendo 0,3% de peróxido de hidrogénio durante 10 minutos as amostras foram então lavadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubadas com soro normal de coelho durante 30 minutos. As secções foram incubadas com os anticorpos primários acima mencionados durante 2 horas à temperatura ambiente, em seguida, lavadas três vezes em PBS. Para detecção, utilizou-se um kit de Histofine SAB-PO (H) (Nichirei Corp., Tóquio, Japão). As secções foram então incubadas com o coelho anti-ratinho biotinilada immunogloblin (Ig; IgG, IgA, e IgM; Nicchirei Corp) durante 10 minutos, lavadas três vezes em PBS e tratou-se com estreptavidina conjugada com peroxidase durante 10 minutos. Após uma lavagem final em PBS, o rótulo da peroxidase foi detectada por incubação das secções em diamino-benzidina tetra-hidro-cloreto de (DAB) durante 3 minutos. contra-coloração nuclear foi feito utilizando uma solução de hematoxilina de Mayer. Para controlos negativos, anticorpos primários foram substituídos por não-imune, soro normal. imunoistoquímica automatizada também foi realizado para suportar a imunocoloração descrita acima, usando um sistema Ventana Discovery ™ (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, EUA).
Avaliação de imunomarcação de proteínas
p21 estava presente nos núcleos de células de tumor (Figura 1A). Em alguns casos, a mucosa gástrica normal de proteína expressa a p21, e coloração nuclear pode ser detectado nos atinge superficiais do tumor, mas não nas regiões mais profundas. Nós contado o número de células p21-positiva na secção do tumor conjunto, e avaliados o número de células p21-postive de acordo com a altura das camadas. O padrão de imunocoloração HIF-1α no tumor foi nuclear e /ou citoplasmático (Figura 1B). A coloração nuclear de HIF-1α estava ausente no tecido normal excluindo coloração citoplasmática. Em todas as amostras, a proteína p53 foi detectada em tecidos normais, e presentes nos núcleos das células do tumor (Figura 1C). Uma célula com imunocoloração nuclear para p21, p53 ou HIF-1α (fraco ou forte) foi classificado como positivo. Com base nestes critérios, as áreas de coloração focal com o maior percentual de coloração nuclear p53 e p21 positivo no tecido tumoral profunda foram estimados. Um tumor foi pontuado como p21- ou p53-positiva quando mais de 10% das células tumorais apresentaram coloração nuclear, de acordo com relatórios anteriores [10]. expressão HIF-1α foi frequentemente evidente em regiões em torno das bordas invasores do tumor e áreas necróticas tais como aqueles perto de uma úlcera profunda. Nós teve como tumores positivos para a sobre-expressão de HIF-1α se coloração nuclear foi detectado em mais de 10% das células tumorais, independentemente da reactividade citoplasmática em qualquer nível [9, 11]. Figura 1 A), a expressão da p21 em tecido tumoral adjacente. imunomarcação nuclear é evidente (ampliação original, 100 ×). B) a expressão de HIF-1α em invadir regiões de tumor. A variabilidade na intensidade da imunocoloração nuclear é evidente, acompanhada por coloração citoplasmática (ampliação original, 100 ×). C) imunomarcação nuclear de p53 no tecido tumoral (ampliação original, 100 ×). tecido D) Tumor coradas com H & E (ampliação original, 200 ×). tecido do tumor contém células (seta) com características de apoptose
Avaliação para a apoptose
Marcámos células em apoptose como aqueles mostrando as características típicas de apoptose, quando amostras de tecido foram coradas com H &. E (Figura 1D). As células apoptóticas foram identificados com base nas características da apoptose: compactação e migração dos contornos nucleares e celulares, fragmentação nuclear e protuberância, ea presença de corpos apoptóticos [12]. As células apoptóticas foram contadas em amostras de tecidos de todos os pacientes. Cinco campos de alta potência (400 ×) com a distribuição mais abundante de células tumorais foram seleccionados para a contagem e entre 1000 e 1500 células tumorais foram contadas. O índice apoptótico foi então calculada como a percentagem de células apoptóticas. As áreas com extensa necrose foram evitadas. Um único patologista em cada instituição revisou as lâminas e contou células em apoptose de acordo com os critérios descritos acima.
Análise estatística
O programa BMDP Statistical Package (BMDP, Los Angeles, CA) para a IBM (Armonk, NY) 3090 de mainframe computadores foram utilizados para todas as análises estatísticas [13]. conjuntos de dados foram comparadas pelo qui-quadrado e estudante da T-testes usando os programas 4F e 3S BMDP. O programa BMDP 1L foi usado para analisar o tempo de sobrevivência usando o método de Kaplan-Meier. A significância estatística foi fixado em P < 0,05.
Resultados
expressão p21 e fatores clínico-patológico
A Tabela 1 mostra a correlação da expressão ou a perda de expressão da p21 com vários fatores clínico-patológico. Em geral, 71 (56,3%) dos espécimes tumorais 126 foram negativos para a expressão de p21. Em tumores de pacientes com menos de 65 anos de idade, perda de expressão p21 foi significativamente mais frequente do que em tumores de pacientes com idade superior a 65 (P = 0,026). Perda de expressão p21 foi significativamente mais frequente em tumores com tamanho grande (P = 0,03), em comparação com tumores menores. No que diz respeito a metástases, tumores com a perda de expressão de p21 tendia a mostrar aumento da frequência de invasão linfático (P = 0,089, Tabela 1) e uma significativamente maior frequência de metástases linfáticas (P = 0,022, Tabela 2) do que os tumores que expressam p21. A Tabela 3 mostra a relação entre a expressão de p21, e a expressão de p53, e HIF-1α. A sobre-expressão de p53 foi detectada em 57 (45,2%) de tumores, e a sobre-expressão de HIF-1α foi detectada em 49 (38,9%) tumores. A análise imunohistoquímica não revelou uma correlação entre a expressão da p21 e p53 ou p21 e HIF-1α superexpressão (P = 0,444 e 0,609, respectivamente) .table 1 Relação entre a expressão da p21 e fatores clínico-patológico
Fatores
p21 (+) (n = 55)
p21 (-) (n = 71)
valor P
Idade (anos) Art < 65
20
40
0,026
65 ≦
35
31
Sexo Masculino
38
47
0,731
Feminino
17
24
profundidade de invasão
t1
33
35
0,231
t2,3,4
22
36
Histologia
Diferenciada
35
39
0,325
indiferenciado
20
32
tamanho do tumor Art < 3 cm
23
22
0,03 Sims 3 cm ≦
22 invasão
49
linfática
negativo
26
23
0,089
Positive
29
48
invasão venosa
negativo
42
57
0,595
positiva
13
14
Tabela 2 Relação entre a expressão da p21 e metástase
tumor p21-negativos (%)
valor P
metástases linfonodais
Negative
36/75 (48,0)
0,022
positiva 35/51 (68,6)
metástase hepática
negativo
68/122 (55,7)
0,447
Positive
3/4 (75,0)
disseminação peritoneal
negativo
62/112 (55,4)
0,525
positiva
9/14 (64,3)
Tabela 3 Relação entre p21 e p53 e expressão
HIF-1α |
|
p21
|
|
|
positiva (n = 55)
negativo (n = 71)
valor P
p53
positiva (n = 57)
27
30
0,444
negativo (n = 69)
28
41
HIF-1α
positiva (n = 49)
20
29
0,608
negativo (n = 77)
35
42
apoptose associada a HIF-1α e expressão p21
A média apoptótica índice de todos os 126 tumores foi de 8,95 ± 6,24 (intervalo 0-37). Os tumores foram divididos em quatro populações diferentes com base em HIF-1α e a expressão da p21 e o índice apoptótico média para cada grupo foi calculado (Tabela 4). Os tumores que foram-HIF-1α positiva /p21-negativos teve o menor índice de apoptose. Houve diferença significativa entre os tumores que estavam HIF-1α-positivo /p21-negativos, e aqueles que foram-HIF-1α negativo /p21-negativos (P = 0,037) .table 4 apoptose associada a HIF-1α e expressão p21
Fator
apoptose índice
HIF-1α (-), p21 (+) n = 35
9,6 ± 7,33 ***
HIF -1α (-), p21 (-) n = 42
9,83 ± 6,96 **, ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
8,85 ± 4,04 *, **, ***
HIF-1α (+), p21 (-) n = 29
6,97 ± 4,22 *, **, ***
* P = 0,129 ** P = 0,037 * ** P = 0,078 (média ± SD)
Os resultados clínicos associados com HIF-1α e expressão p21
O tempo médio de seguimento dos pacientes foi de 55 ± 28 (± 1 DP) meses (variação, 1-82 meses). A taxa de sobrevivência de cinco anos de doentes com tumores p21-negativo foi menor do que a de tumores p21-positivos, mas a diferença não foi estatisticamente significativo (dados não apresentados). Os 126 pacientes foram novamente divididos em quatro populações com base na expressão de HIF-1α e expressão p21, e examinou a relação entre a expressão de HIF-1α e prognóstico em amostras de p21-positivo ou tumorais -negative. A Tabela 5 mostra as taxas de sobrevivência 1, 3 e 5 anos para os pacientes e a correlação com HIF-1α e expressão p21. Pacientes com tumores HIF-1α-positivo /p21-negativos tiveram um prognóstico significativamente pior do que as outras populações de estudo. Em particular, em pacientes com tumores de HIF-1a positivo, aqueles que tinha perdido expressão de p21 tinha um prognóstico significativamente pior do que aqueles com a expressão da p21 (P = 0,042) .table taxa de sobrevivência de 5 anos associada com HIF-1α e expressão de p21
Fator
sobrevivência
1 ano
3 anos de sobrevida
5 anos de sobrevida
HIF-1αg (-), p21 (+) n = 35
94,1
82,0
82,0 ***
HIF-1α (-), p21 (-) n = 42
92,7
80,0
80,0 **, ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
95,0
85,0
70,0 *, **, * **
HIF-1α (+), p21 (-) n = 29
68,1
57,4
45,9 *, **, ***
* P = 0,042 ** P = 0,003 *** P = 0,003 (%)
Discussão
Nossos resultados mostram que a perda de expressão p21 correlacionou positivamente com a mais jovem idade do paciente e do tumor maior. Além disso, muitos pacientes com tumores p21-negativos tiveram metástase linfonodal quando comparado com aqueles com tumores p21-positivas, com uma frequência significativamente maior. Estes resultados sugerem que a perda de expressão de p21 está envolvido nos processos de crescimento de tumores e metástases, em concordância com os relatórios anteriormente [14, 15].
Superexpressão HIF-1α tem sido associada a um prognóstico clínico em alguns tipos dos cancros humanos [16-18]. No entanto, alguns estudos sugerem que a expressão tumoral de HIF-1α não confere uma vantagem de sobrevivência [18, 19]. Embora a maioria dos genes de alvo de HIF-1 pode promover o crescimento do tumor através da sua expressão aumentada, os genes de HIF-1-activados, incluindo p21, também têm o potencial para inibir o crescimento sob condições hipóxicas [20, 21]. A expressão ectópica de HIF-1α em células endoteliais resultou em aumento da regulação do p21, a redução das atividades de CDK, parada do ciclo celular no G 0 /G 1 ponto de verificação, e apoptose subsequente [22]. No estudo atual, descobrimos que células em apoptose foram sub-representadas em tumores HIF-1α-positivo /p21-negativos. Sob condições de hipoxia, HIF-1α pode inibir a proliferação do tumor através do controlo do ciclo celular mediada por p21, o que resulta na selecção de células que são resistentes a apoptose e tratamentos anti-cancro. A maioria das células tumorais reter a capacidade de sofrer apoptose em resposta ao stress hipóxico [23]. Quando a resposta apoptótica a hipóxia é perdida, células tumorais emergentes podem ser mais resistentes ao tratamento e, portanto, podem contribuir para a reincidência do tumor subsequente [24]. Os mecanismos pelos quais a hipoxia selecciona para células resistentes a apoptose não é clara, mas o envolvimento da mutação p53 foi examinado [25]. Os relatórios demonstraram que a hipoxia inibe o crescimento celular, e podem causar apoptose através de uma via dependente de p53 [26]. HIF-1α também tem sido demonstrado que promovem a apoptose dependente de p53 [27], mas outros estudos mostraram que a paragem do crescimento, em resposta a hipoxia é independente de p53 [26]. No estudo atual, não encontramos evidências de uma relação entre p53 e p21 expressão. Também foi avaliada a relação entre o HIF-1α e a expressão de p53 para a apoptose das células, mas não encontrou nenhuma diferença estatística entre HIF-1α e expressão de p53 (dados não apresentados). Nosso estudo anterior mostrou que a combinação de superexpressão HIF-1α com p53 não funcionais tendem a indicar um prognóstico sombrio [28].
Em pacientes com tumores de HIF-1a positivo, a correlação entre a perda de expressão p21 e má evolução clínica pode reflectir uma diferença fisiológica na capacidade de p21-positiva contra tumores p21-negativo para sobreviver sob condições hipóxicas. Apesar de activação da transcrição HIF-1α-dependente tem sido associada com o crescimento de tumores, os nossos resultados sugerem que a expressão concomitante de p21 e HIF-1α podem retardar o crescimento do tumor em algum grau.
O mecanismo molecular subjacente a expressão de HIF-1α em particular cancro garante atenção [29]. A ocorrência generalizada de upregulated HIF-1α em cancros comuns eo envolvimento de vias de hipóxia na angiogénese tumoral certamente argumentar por sua importância e aplicabilidade larga. A quimioterapia e a radiação que alvo de HIF-1α pode ser eficaz e realista, e, de facto, esta abordagem tem sido relatada [30]. No entanto, as diferenças qualitativas e quantitativas na resposta hipóxica de diferentes tipos de células não são bem conhecidos [31]. Assim, é necessária mais investigação para avaliar os efeitos das vias HIF-1 mediadas sobre a proliferação celular e apoptose em cancros humanos sob microambientes de hipóxia.
No presente estudo, mostramos que a superexpressão HIF-1α e perda de p21expression em cancros gástricos correlacionada com mau prognóstico do paciente, em comparação com tumores que retiveram a expressão da p21, ou tinham perdido a expressão HIF-1α. Um mecanismo potencial para este foi sugerido pela descoberta de que células em apoptose foram sub-representadas em tumores HIF-1α-positivo /p21-negativos. tumores agressivos que não conseguem induzir a p21 em um HIF-1α - forma dependente pode ter aumentado a sobrevivência da célula, sem a apoptose, e contribuir para um mau prognóstico para pacientes de apoio Financiamento
Departamento de Cirurgia e Ciência, Graduate School of Medical. Ciências da Universidade Kyushu, em Fukuoka, Japão.
Declarações
Agradecimentos
os autores agradecem K. Miyamoto para assistência técnica.
autores 'original apresentada arquivos para imagens
Abaixo estão os links para os autores 'original apresentada arquivos de imagens. 'arquivo original para a figura 1 12957_2006_249_MOESM2_ESM.tiff Autores' 12957_2006_249_MOESM1_ESM.jpeg Autores arquivo original para 'arquivo original para a figura 3 12957_2006_249_MOESM4_ESM.tiff Autores' figura 2 12957_2006_249_MOESM3_ESM.tiff Autores arquivo original para a figura 4 Conflito de Interesse em O autor (s ) declaram que não têm interesses conflitantes.
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