Фон
<р> MicroRNAs действуют как посттранскрипционных регуляторов экспрессии генов во многих биологических процессах. Их дерегулирования происходят обычно в рак желудка (GC). Хотя метилирование ДНК представляет собой важный механизм для микроРНК дерегуляции в раке, это поле в основном остается неисследованной.
Финансирование:. Эта работа при поддержке грантов от Национального фонда естественных наук Китая (2011, 91129716, к JY), Пекинского муниципального Наука &Amp; Технологиям Комиссии (2010B071, к J.Y.), Институт фундаментальных медицинских наук, Китайской академии медицинских наук (2009RC03, к J.Y .; 2010PYB06, к J.Y .; 2012G04, к J.Y.). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение Материалы и методы Пациенты и Особи с высоким молекулярным весом геномной ДНК была извлечена из желудка тканей рака с использованием набора ДНК Extraction (Биомед, BJ, Китай) в соответствии с инструкциями изготовителя. Бисульфит модификация была выполнена с использованием секвенирования набора Epitect бисульфит (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с протоколом. До 2 мкг геномной ДНК использовали в качестве исходного материала. Нормальная лимфоцит ДНК обрабатывали CpG метилтрансферазы (M.SssI) (NEB, Массачусетс, США) использовали в качестве положительного контроля, и реакционную систему без какого-либо шаблона был использован в качестве пустой контроль. пролиферации клеток и колоний Формирование анализа Миграция клеток и вторжения Для Transwell вторжения анализов, ГГК-27 и клетки MGC-803 суспендировали в 0,2 мл RPMI 1640 или DMEM без FBS были размещены в верхней камере каждой вставки (Millipore, MA, USA), предварительно покрытый с 40 мкл 1 мг /мл Матригель. Нижняя палата была заполнена 600 мкл RPMI 1640 или DMEM среде с 10% FBS как пищевой аттрактант. Через 24 часа, вторжение клетки, прикрепленные к нижней поверхности фиксировали 20% метанолом и окрашивали мае-Gruwald-Гимза (МГГ). Затем мембраны были вырезаны и заключали под покровных стеклах. Клетки в трех различных полях зрения подсчитывают, и все анализы проводили в трех повторностях. Каждый эксперимент повторяли по меньшей мере три раза. т теста Стьюдента (двусторонний) и х 2 тест были выполнены, и статистическая значимость была определена как a = 0,05 (двухсторонние). Средства ± SD отображаются на чертежах. микроРНК-10а вниз регулируется в желудочном раковых клеток микроРНК-10a Тормозит пролиферацию клеток в пробирке нокдауна из Hoxa1 Подавленные рака желудка роста и миграции клеток в пробирке Для того, чтобы выяснить, является ли низкой экспрессии зер- 10a в GC ткани была результатом epigenetical изменений, мы относились к HGC-27, MGC-803, SGC-7901 и MKN-45 клеток с ингибитором метилирования ДНК 5-аза. Выражение MIR-10a была повышающей регуляции в ТЖК-27, SGC-7901 и клетки MKN-45, когда они обрабатывали АЗА, предполагая, что экспрессия микроРНК-10a может быть подавлено в этих клетках с помощью метилирования ДНК (фиг. 6а). Выражение признательности авторы благодарят Hualu Чжао из IBMS (институт фундаментальных медицинских наук), PUMC (Peking Union Medical College) для оказания технической помощи и доктора Hongkai Чжан из Jiuxianqiao больницы за ее помощь в иммуногистохимии.
<р> рак желудка (GC) является второй наиболее частой причиной смерти от рака в [1] мире. До сих пор несколько генов-супрессоры опухолей и генов, связанных с опухолью были зарегистрированы в GC. Несмотря на обширные исследования были проведены для выявления генетических путей и механизмов, участвующих в развитии рака, было сделано несколько улучшений по ранней диагностике рака. MicroRNAs (микроРНК) являются эндогенными малые некодирующие РНК, которые были идентифицированы как посттранскрипционных регуляторов экспрессии генов. Предыдущие исследования показали, что микроРНК осуществляют свои функции через несовершенного спаривания оснований с 3'untranslated области (3'UTR) целевых мРНК [2] и микроРНК были широко изучены в контексте регуляции клеточного цикла, дифференциации, развития и апоптоза [3], [4]. Накопленная данные свидетельствуют о том, что микроРНК дерегулированы при различных заболеваниях, особенно при раке. Например, микроРНК-216b заметно понижающей регуляции в карциномы носоглотки [4]; микроРНК-340 разрегулирована при раке молочной железы и может ингибировать миграцию клеток рака молочной железы и инвазии [5]; и микроРНК-31 был идентифицирован как онкоген в пищеводе плоскоклеточного рака [6]. Взятые вместе, микроРНК были определены в качестве потенциальных кандидатов для новых диагностических биомаркеров или терапевтических мишеней рака.
<Р> MIR-10a сообщалось, играют важную роль в возникновении и развитии различных раковых заболеваний человека. Например, микроРНК-10a разрегулирована головы и шеи плоскоклеточный рак, а также в печеночно-клеточного рака [7], [8]. Кроме того, в рак шейки матки человека, микроРНК-10a служит как онкоген путем регулирования CHL1 [9]; понижающую регуляцию MIR-10a в хронический миелолейкоз способствует CD34 + клеток пролиферацию [10]. Тем не менее, функция микроРНК-10a и механизм лежащий в основе канцерогенеза желудка остаются неясными. В данном исследовании мы точно измерить экспрессию микроРНК-10a у 100 пациентов с раком желудка и исследовали роль микроРНК-10a в желудочном раковых клеток. Мы обнаружили, что микроРНК-10a подавлялась в GC тканях и усиленной экспрессии микроРНК-10a подавлял пролиферацию, миграцию и инвазию клеток GC
. <Р> эпигенетических модификаций, включая гиперметилированием ДНК, гистонов дезацетилирования и метилирования гистонов тесно связанный с инактивацией гена. Promoter гиперметилирование считается альтернативный механизм понижающей регуляции генов-супрессоров опухолей в злокачественных опухолях человека [11]. МикроРНК, экспрессия которых подавляется метилирования ДНК было зарегистрировано в нескольких злокачественных опухолей человека [12] - [14]. Для дальнейшего исследования, происходит ли вниз регуляция микроРНК-10a из гиперметилированием геномной области вверх по течению от микроРНК-10a
, мы проанализировали ДНК метилирование острова CpG в промоторной области зер- 10a
у 55 пациентов GC и обнаружили, что понижающую регуляцию MIR-10a в GC тканях может быть связано с гиперметилированием CpG последовательностей в его промотора.
<р> Человеческие клинические образцы были собраны из хирургических образцов из 100 пациентов с ГК в Институте рака и больницы, китайской академии медицинских наук, генеральный госпиталь Народной освободительной армии и онкологической больницы провинции Шаньси. Соответствующие смежные неопухолевых тканей от края макроскопической опухоли были выделены в то же время и использовали в качестве контролей. Опухоли были поставлены в соответствии с TNM (2010) критериев классификации Союза по международному контролю рака (UICC). Все образцы были разделены на две части, и сразу же замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° С до экстракции РНК. Четыре желудка клеточные линии рака (ТЖК-27, MGC-803, SGC-7901 и MKN-45) были сохранены в нашей лаборатории и поддерживали в DMEM или 1640 с добавлением 10% FBS. Клинические исследования Комитет по этике Института фундаментальных медицинских наук, Китайской академии медицинских наук утвердил протоколы исследования и письменное информированное согласие было получено от участников.
Экстракция РНК, кДНК Синтез мРНК и микроРНК, и вещественно- время ПЦР
<р> Суммарную РНК экстрагировали из желудка раковых тканей и клеток с использованием тризола реагента (Invitrogen, CA, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. РНК определяли количественно по поглощению при 260 нм и кДНК синтезировали с помощью М-MLV обратной транскриптазы (Invitrogen) с 2 мкг тотальной РНК. Олиго (дТ) 18 использовали в качестве праймеров для RT обратной транскрипции мРНК. Стебель-петля RT праймер использовали для обратной транскрипции микроРНК. Количественный ОТ-ПЦР проводили в Bio-Rad CFX96 ПЦР в реальном времени системы (Bio-Rad, Калифорния, США) с использованием SYBR Премикс Ex Taq Kit (Takara, Далянь, Китай) или TaqMan зонды (Applied Biosystems, Foster City, CA , США) в соответствии с инструкциями изготовителя. Условия ПЦР были следующими: 95 ° С в течение 30 сек, затем 40 циклов при 95 ° С в течение 5 с и 60 ° С в течение 34 сек. Для получения мРНК, данные были нормализованы с помощью эндогенного контроля GAPDH. МикроРНК, U6 мяРНК был использован в качестве эндогенного контроля. Относительное количество микроРНК-10a измеряли с помощью метода -ΔΔCT 2 . Последовательности праймеров представлены в таблице S1.
ДНК экстракция, метилирование-специфической ПЦР (ССП) и количественное метилирования-специфической ПЦР (qMSP)
<Р> Натриевая bisulfate- обрабатывали ДНК амплифицировали с помощью Bio-Rad CFX96 ПЦР в реальном времени системы (Bio-Rad) с использованием KAPA SYBR® БЫСТРО КПЦР наборы (Kapa Biosystems) со следующими условиями: 95 ° с в течение 5 мин с последующим 40 циклов 95 ° C в течение 30 с, 54 ° с в течение 30 с и 72 ° с в течение 30 с и конечным удлинением при 72 ° с в течение 10 мин. GAPDH, был использован в качестве внутреннего контроля. qMSP реакции проводили в трех экземплярах. Уровень метилирования в образце оценивалась как Lu L и соавт. описано [15]. Последовательности праймеров приведены в таблице S1.
5-аза-2'-deoxyazacytidine Лечение
<р> Клетки рака желудка были посеяны в 10-см чашки (1 × 10 6 клеток на чашку) за один день до лечения препаратом. Клетки обрабатывали 1 мкМ 5-аза-2'-deoxyazacytidine (5-аза) (Sigma, МО, США) каждые 24 ч в течение 3 дней.
Культура клеток и олигонуклеотиды Трансфекция
<р> желудочном клеточные линии человека ТЖК-27, СГК-7901 и MKN-45 культивировали в среде RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK), дополненной 10% эмбриональной бычьей сыворотки, и МГЦ-803 поддерживали в среде DMEM (Gibco, BRL , Великобритания) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Эти клеточные линии поддерживали при температуре 37 ° С в увлажненном воздухе, содержащем 5% CO <суб> 2.
<Р> микроРНК-10a мнемосхема, скремблирования имитируют, siHOXA1 миРНК и миРНК скремблирования были синтезированы GenePharma (Шанхай, Китай ) и трансфицировали в клетки при конечной концентрации 50 нмоль /л с использованием DharmaFECT1 Реагент (Dharmacon, штат Техас, США).
<р> mimic- или siRNA- трансфицированные клетки высевают в 96-луночные планшеты (5000 клеток /лунку). Клетки инкубировали с 10% ХЦК-8 (Dojindo, Япония) при 37 ° С до тех пор, пока произошло визуальное преобразование цвета. скорости пролиферации определяли при 0, 12, 24, 48, 72, 96 часов после трансфекции.
<р> мимических-трансфицированные клетки обрабатывали трипсином и пересевали при 200 клеток на лунку в 6-луночные планшеты и выдерживают в 1640 году с 10% ЭТС. Клетки культивировали в течение 7 дней, фиксировали метанолом и окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым в 20% метаноле в течение 15 мин.
апоптозом клеток Анализ
<р> Апоптоз анализы проводили в ТЖК-27 и линии MGC-803 клеток с использованием монтажного комплекта аннексина V-FITC обнаружения Апоптоз I (BD Biosciences) в соответствии с протоколом производителя, а затем анализироваться Calibur проточном цитометре (Becton Dickinson).
Assays <р> пробирного ранозаживляющие проводили для оценки миграции клеток. Искусственная рана была создана на сливающийся монослой клеток без FBS с использованием 200 мкл кончика пипетки через 24 часа после трансфекции. Для визуализации миграции клеток и заживление ран, снимки были сделаны на 0, 12, 24, 36, 48, 60 часов.
вестерн-блоттинга
<р> Вестерн-блот-анализ проводили в соответствии со стандартными методами. Белки разделяли с помощью 10% SDS-PAGE, а затем переносили на мембраны ПВДФ (Amersham, Buckinghamshire, UK). Мембраны блокировали в течение ночи с 5% обезжиренного сухого молока и инкубировали в течение 2 ч с анти-Hoxa1 антитела (BioWorld, MN, USA) в 1:500 разведений или анти-GAPDH антитела (Proteintech, Чикаго, США) в 1: 50000 разведений. После промывки TBST (10 мМ Трис, рН 8,0, 150 мМ NaCl и 0,1% Tween 20), мембраны инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом (zsgb-био, Пекин, Китай).
Статистика
Результаты
<р> Мы исследовали экспрессию зрелого MIR-10a в четыре желудка человека линии клеток рака (ТЖК-27, MGC-803, SGC-7901 и MKN-45) и желудка человека линии клеток эпителия (GES). Уровень экспрессии микроРНК-10a в GES было значительным выше, чем уровни в двух желудочных линий раковых клеток (HGC-27 и MGC-803) и был, не значительно, но заметно выше, чем уровни в двух других желудочных линий раковых клеток (MKN-45 и ЮГК-7901) (рис. 1а). Эти данные свидетельствуют о том, что понижающая регуляция СИК-10a может иметь отношение к генезису и развитию GC.
Выражение MIR-10a в клинической GC пациентов и их корреляция с клинико-патологическими характеристиками
<р> Для дальнейшего изучения взаимосвязи между микроРНК-10a и GC генеза, мы обнаружили экспрессию микроРНК-10a в 100 клинических пациентов с помощью TaqMan зонда, полученных ПЦР в реальном времени, как описано выше. Из 100 пар образцов GC, экспрессия микроРНК-10a подавлялась в 58 случаях (58/100, 58%) по сравнению с соответствующими соседними тканями (рис. 1b). В целом, экспрессия микроРНК-10a подавлялась в GC тканях по сравнению с окружающими тканями, хотя понижающая регуляция не было статистически значимым (р = 0,148, парные Т-тест, с двумя хвостами) (рис. 1в).
<р> для того, чтобы оценить корреляцию между экспрессией микроРНК-10a и клинико-патологическими характеристиками, пациенты были разделены на две группы в соответствии с относительным выражением MIR-10a в раковых тканях в соответствии с ранее опубликованной работе [16] , Как показано в таблице S2, наблюдалась статистически значимая связь между этими двумя группами TNM. Есть больше пациентов, которые находятся в I + II стадии в группе с более низкой экспрессии микроРНК-10a в их GC тканях. Эти отношения показали, что микроРНК-10a может быть более важным в начале канцерогенеза рака. Тем не менее, наши данные показали, что уровень экспрессии микроРНК-10a не было никакой корреляции с возрастом, полом, гистологическим типом, процент опухоли, венозного вторжения, нервного вторжения, положение, Бормана печатать, пТл стадии, П.Н. стадии или стадии пМ.
<р> Чтобы исследовать роль микроРНК-10a в желудочном канцерогенезе, мы трансфецировали микроРНК-10a имитировать в GC клеточных линий ТЖК-27 и МГЦ-803, обе из которых проявляли высокую эффективность трансфекции (фиг. 2а). Как было показано с помощью CCK-8 Анализы роста 0, 1, 2, 3 и 4 дня после того, как мимической трансфекцией, избыточная экспрессия микроРНК-10a уменьшается пролиферацию клеток в обеих клеточных линиях, в то время как свалка мнемосхема не оказывает влияния на пролиферацию клеток по сравнению с необработанными клетками (фиг. 2b). Впоследствии, анализы образования колоний проводили для оценки пролиферативной способности мимических-трансфицировали ТЖК-27 и MGC-803 клеток и показали, что избыточная экспрессия микроРНК-10a в ТЖК-27 клеток уменьшается образование колоний (фиг. 2в). Тем не менее, ни одна из клеток MGC-803, образованные колонии, которые могут быть из-за относительно слабой приверженности клеток. Для дальнейшего эффекта микроРНК-10a на апоптоза клеток в двух клеточных линиях GC, ранний апоптоз MGC-803 и ГГК-27 клеток исследовали с помощью аннексина V окрашивания после микроРНК-10a мимической трансфекцией. Как и следовало ожидать, несколько ранних апоптотических клеток (20,8% в ТЖК-27 и 22,9% в MGC-803) были обнаружены в скремблирования мимических обработанных клеток, в то время как лечение микроРНК-10a подражает увеличил процент ранних апоптотических клеток (28,4% в ТЖК -27 и 27,7% в MGC-803) (рис. 2d). Все вместе, мы пришли к выводу, что микроРНК-10a может подавлять выживаемость клеток в GC клеток путем индукции апоптоза клеток.
микроРНК-10a Угнетает миграции клеток и вторжения в пробирке
<р> Мы далее оценивали эффекты MIR-10a на клеточной миграции и инвазии, которые являются ключевыми факторами, определяющими злокачественной прогрессии и метастазирования. Способность миграции была продемонстрирована с помощью анализа заживления ран /царапин в HGC-27 и клеток MGC-803. Обе клеточные линии, обработанных с микроРНК-10a мимических были отчетливо менее мигрирующим, чем у пациентов, получавших контроль скремблирования или необработанных клеток через 12, 24 и 36 часов после того, как царапать (фиг. 3а). Кроме того, мы провели анализ клеточного вторжения Matrigel и окрашивали инфильтрации клеток для измерения направленного вторжения способности клеток после эктопически экспрессии микроРНК-10a в двух клеточных линиях. Инвазивности клеток, трансфицированных микроРНК-10a мимике резко снизилась по сравнению с контролем скремблирования и необработанными клетками (фиг. 3b). Эти результаты показали, что микроРНК-10a сыграли важную роль в регуляции клеточной миграции и инвазивности в GC и предположил, что вниз регулирование MIR-10a может способствовать метастазирования опухоли в желудочном канцерогенезе.
микроРНК-10a Цели Hoxa1 в GC
<р> МикроРНК выполняют биологические функции посредством негативной регуляции их генов-мишеней. Было сообщено, что онкоген Hoxa1 является прямой мишенью MIR-10a в мегакариоцитопоэза и рака поджелудочной железы человека [17] - [19]. По прогнозам PicTar, была комплементарной последовательностью между HAS-MIR-10a и Hoxa1 3'UTR (рис. 4а). Тем не менее, неизвестно, регулирует ли микроРНК-10a клеточную пролиферацию, миграцию и вторжение в GC с помощью таргетинга Hoxa1. Для того, чтобы уточнить их регулирующую отношения, мы впервые обнаружили белок и уровни мРНК Hoxa1 в микроРНК-10a мимических-трансфецировали ТЖК-27 и MGC-803 клеток с помощью Вестерн-блоттинга и ОТ-ПЦР. Мы наблюдали очевидное снижение уровня белка Hoxa1 в присутствии микроРНК-10a мимике по сравнению с контролем скремблирования в двух клетках (фиг. 4, б). Уровень мРНК Hoxa1 также подавляется в ТЖК-27 клеток, предполагая, что микроРНК-10a ингибирует экспрессию Hoxa1 путем деградации мРНК Hoxa1 в ТЖК-27 клетках. Тем не менее, было мало изменения в уровне мРНК в клетках Hoxa1 MGC-803, предполагая, что микроРНК-10a может вниз регулировать экспрессию Hoxa1 через трансляционной репрессии, но не мРНК расщепление в клетках MGC-803 (рис. 4в). Кроме того, мы проанализировали уровни протеина Hoxa1 у 24 пациентов GC. Среди этих образцов, было зарегистрировано 12 больных, у которых микроРНК-10a подавлялась в их тканях GC и 12 пациентов, у которых микроРНК-10a был повышающей регуляции в тканях GC (рис. 4г). Hoxa1 была повышающей регуляции у большинства больных, у которых микроРНК-10a подавлялась в своих GC тканях. Точно так же, Hoxa1 подавлялась в большинстве пациентов, у которых микроРНК-10a был до регулируемых в своих GC тканях. Сравнение уровней микроРНК-10a и уровней протеина Hoxa1 в ГХ показал обратную корреляцию между микроРНК-10a и Hoxa1 (г 2 = 0,1839, P = 0,0366) (фиг. 4E). В совокупности эти результаты дают убедительные доказательства того, что Hoxa1 является непосредственной мишенью MIR-10a в GC. Мы также обнаружили уровень мРНК Hoxa1 у этих больных и наблюдали, что уровень мРНК Hoxa1 у нескольких пациентов, не соответствует уровню белка в котором указывается, что микроРНК-10a регулирует экспрессию своей цели, Hoxa1, через репрессии трансляции, но не мРНК расщепление у этих пациентов (фиг. S1).
<р> Далее, мы спросили играли ли Hoxa1 важно роли в клеток рака желудка. Для изучения роли Hoxa1 в GC, мы сбиты эндогенный Hoxa1 в ТЖК-27 и линий MGC-803 клеток, чтобы обнаружить влияние на клеточную пролиферацию и миграцию клеток. Мы наблюдали, что Hoxa1 репрессии ингибирует клеточную пролиферацию и миграцию ТЖК-27 и MGC-803 клеток, соответственно (фиг. 5a и 5b). Эти результаты свидетельствуют о том, что микроРНК-10a функционирует как подавитель опухоли в GC клетки путем подавления экспрессии Hoxa1.
микроРНК-10a эпигенетически глушителем в GC клеточных линиях
<р> изучить регулирование MIR-10a с помощью метилирования ДНК, мы искали человеческую базу данных генома на наличие CpG островов вокруг MIR-10a с использованием программного обеспечения "CpG острова Searcher» и определил остров CpG, расположенный 1638 п.н. выше микроРНК-10a
(фиг. 6б). Кроме того, мы обнаружили статус метилирования ДНК с помощью qMSP и ПМП в четырех GC клеточных линий. Остров CpG был гиперметилированы во всех четырех GC клеточных линий, что согласуется с низкой экспрессии микроРНК-10a в этих клеточных линиях GC. Когда GC клеточные линии обрабатывали 5-аза-корд, уровень метилирования был уменьшен по сравнению с группой ДМСО (фиг. 6в).
Вниз-регулирование MIR-10a в GC пациентов было обусловлено Гиперметилирование своих CPG островов
<р> Мы рассмотрели далее статус метилирования острова CpG в GC ткани и прилегающей нормальной ткани 55 случайно выбранных случаев через qMSP. Уровень метилирования в 55 тканях GC был выше, чем в соседних нераковых тканей (р ≪ 0,01), что согласуется с низкой экспрессией микроРНК-10a в дс ткани (фиг. 6d). Кроме того, мы случайным образом выбраны две пары образцов, на которых проанализировать уровень метилирования ДНК с помощью бисульфата секвенирования ПЦР (BSP) для проверки точности МПВ. Результаты БСП согласуются с тем из qMSP и были дополнены в качестве фиг. S2. Кроме того, уровень метилирования MIR-10a (M /M + U) у этих пациентов GC обнаруживал обратную корреляцию с выражением MIR-10a (г 2 = 0,1956, P = 0,0006) (фиг. 6е). Мы также обнаружили уровень метилирования MIR-10a в нормальных клетках желудка и желудочных линий раковых клеток. Результаты qMSP показали, что остров CpG был частично метилированной в клетках GES, но чрезвычайно гиперметилированы в двух желудочных линиях раковых клеток ТЖК-27 и MGC-803, который также предположил, что остров CpG вверх по течению от микроРНК-10a <бр> был гиперметилированы в GC клетках (фиг. 6f). В совокупности эти результаты дают убедительные доказательства того, что экспрессия микроРНК-10a регулировалась метилирования ДНК у этих пациентов GC. Вниз регулирование MIR-10a у больных ГЦ было связано с гиперметилированием его островов CpG.
Обсуждение
<р> В этом исследовании мы установили, что микроРНК-10a подавлялась в человеке рак желудка, частично из-за его промоторной ДНК гиперметилированием. Дальнейшие исследования показали, что избыточная экспрессия микроРНК-10a подавлено клеточную пролиферацию, миграцию и инвазивность в GC клеточных линий ТЖК-27 и MGC-803, возможно, за счет ориентации онкоген Hoxa1.
<Р> МикроРНК было зарегистрировано для регулирования различных развития и клеточные процессы, и участвуют во многих заболеваний человека, особенно при раке. МикроРНК подавляют экспрессию генов путем пристреливать мРНК путем связывания с их 3'-НТО. Эти микроРНК проявляют регуляторную роль в патогенезе рака и участвуют в клеточной пролиферации, дифференцировки, апоптоза, метастазирование и сопротивления [4], [20]. MIR-10a играет важную роль в ряде видов рака, в том числе гепатоцеллюлярной рака [9], рак поджелудочной железы [17], острый миелоидный лейкоз [21] и хронического миелолейкоза [10]. Аномальная экспрессия микроРНК-10a, вероятно, играет решающую роль в злокачественной трансформации и по отношению к тканевой специфичности. Его дерегулирование может внести свой вклад в развитие неоплазии желудка.
<Р> Проверка экспрессии микроРНК-10a в клинических образцах показали, что микроРНК-10a подавлялась в 58 (58/100, 58%) тканей GC по сравнению с окружающими тканями. Тем не менее, Вэйдун Chen и др.
Исследовали экспрессию микроРНК-10a в 33 случаях GC и наблюдали, что экспрессия микроРНК-10a был в ГЦ тканях выше, чем в соседних тканях [22]. Несоответствие может быть результатом различного количества клинических образцов и нехарактерной изменения MIR-10a в GC тканях. Наши данные должны быть более биологически Представительный из-за большего количества клинических образцов. Только большая часть, но не все пациенты ГЦ имеют понижающую регуляцию MIR-10a в их ГЦ тканях хотя и микроРНК-10a функционирует как опухолевый супрессор в клеток рака желудка. Это может быть из-за отдельного механизма генезиса ГК у разных людей. Там могут быть некоторые другие важные гены или факторы, ответственные за онкогенеза у больных ГХ в которых ГК ткани микроРНК-10a остается неизменной или повышающей регуляции. Кроме того, выражение микроРНК-10a не обнаруживали корреляции с клинико-патологическими характеристиками для стадии TNM, за исключением, что указывает, что микроРНК-10a может играть частичную роль в онкогенеза особенно на ранних стадиях.
<Р> Многие микроРНК, как сообщается, коррелируют с канцерогенез, тем не менее, основной молекулярный механизм остается неясным. В нашем докладе, функциональный анализ MIR-10a, включая клеточную пролиферацию, миграцию и инвазии анализы, помогли нам лучше понять вклад MIR-10А желудочного канцерогенеза. Трансфекция MIR-10a имитируют пролиферации клеток значительно тормозится, миграцию и инвазивность в GC клетках, что свидетельствует о том, что подавление MIR-10a может способствовать прогрессированию опухоли в желудочном канцерогенезе. Дальнейшие исследования необходимы для выяснения этого механизма.
<Р> В человеческом геноме, микроРНК-10a
расположен выше по потоку от НОХВ4
. MIR-10b
, другой член семьи микроРНК-10, находится выше по потоку от HOXD4
. Эти два члена отличаются друг от друга только в одной базе и имеют идентичные последовательности семенные, что свидетельствует об их аналогичные функции. Kwoneel Ким [12] сообщает, что микроРНК-10b играет роль в GC как супрессор опухоли. В нашем исследовании мы показали, что избыточная экспрессия микроРНК-10a ингибирует пролиферацию опухолевых, миграцию и инвазивность, которая была похожа на функцию MIR-10b в GC. Нох генов высоко консервативны транскрипционные факторы, которые являются определяющими для правильного передне-заднего паттерна оси тела [23]. Hoxa1 была утверждена в качестве прямой цели микроРНК-10a при раке поджелудочной железы человека [17] и мегакариоцитопоэза [18]. Мы также наблюдали, что избыточная экспрессия микроРНК-10a пониженные уровни белка Hoxa1 в двух GC клеточных линий, предполагая, что Hoxa1 является прямой мишенью MIR-10a при раке желудка.
<Р> эпигенетических модификаций, как было показано, являются ключевыми посредниками лежащий в основе понижающей регуляции экспрессии микроРНК и демонстрируют тесную корреляцию с канцерогенеза [12], [13], [24]. Наши данные показали, что гиперметилирование острова CpG вверх по течению от микроРНК-10a
привела к понижающей регуляции MIR-10a в клеточных линиях ГХ и ГХ пациентов. Кроме того, лечение АЗА увеличилась MIR-10a в линиях GC клеток. На основании наших данных, статус метилирования MIR-10a могут быть использованы в качестве потенциального биомаркера в GC.
<Р> Таким образом, в этом исследовании сообщается, что микроРНК-10a выступает в качестве супрессора опухоли в GC клетки и частично вниз -regulated от гиперметилированием ДНК. Принудительная экспрессия микроРНК-10a подавляет пролиферацию клеток, миграцию и инвазивность в пробирке
. Статус метилирования и уровень экспрессии микроРНК-10a могут служить в качестве потенциальных биомаркеров GC, и микроРНК-10a может иметь потенциальное терапевтическое значение в терапии рака. Дальнейшие исследования по эпигенетической регуляции экспрессии микроРНК необходимы, и регуляция экспрессии микроРНК эпигенетическими препаратов может обеспечить новую терапевтическую стратегию для желудка и других злокачественных опухолей человека.
Поддержка информации Рисунок S1 изображения.
Уровень мРНК Hoxa1 в 24 пациентов GC был обнаружен QRT-PCR
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0088057.s001
(TIF) Рисунок S2
.
БСП анализ статуса метилирования у двух пациентов GC. Заполненный и открытые кружки обозначают метилируется и неметилированные сайты CpG соответственно
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0088057.s002
(TIF)
Таблица S1.
праймеры используются в этой статье
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0088057.s003
(XLSX)
Таблица S2.
ассоциация между экспрессией микроРНК-10a с клинико-патологическими особенностями у больных раком желудка
DOI:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s004
(XLSX)
Пациенты с СРК могут получить пользу от добавок витамина D,
Открытие узкого пищевода
Модуляция микробиоты и восстановление эубиоза могут помочь обуздать осложнения COVID-19
Панкреатит
Пищевые реакции регулируются микробиомом кишечника,
Страны с более старым населением имеют более высокий уровень инфицирования и смертности от SARS-CoV-2,
Кишечные бактерии связаны с метаболическими изменениями и аутизмом в новом исследовании
Исследователи из Калифорнийского технологического института сделали важное открытие, которое может объяснить, как кишечные бактерии могут способствовать поведению, схожему с аутизмом. Команда обнару
Генетически измененные кишечные бактерии снижают риск развития колоректального рака у мышей - результаты исследования
Исследователи обнаружили, что редактирование генов бактерий, присутствующих в кишечнике мышей, может помочь уменьшить воспаление и связанный с этим риск колоректального рака. Исследование ученых из Юг
Грибы и бактерии в кишечнике могут в равной степени влиять на здоровье человека и тяжесть заболевания.
Микробиом кишечника получил много внимания, но новое исследование показывает, что грибки в кишечнике также являются важными микроорганизмами для функционирования и здоровья кишечника, что затем сказыв