Háttér katalógusa
A mikroRNS-ek működnek poszttranszkripciós szabályozók génexpresszió számos biológiai folyamatokat. Az deregulációs gyakran fordulnak elő a gyomorrák (GC). Bár a DNS-metiláció olyan fontos mechanizmus a mikro-RNS dereguláció rák, ezen a területen nagyrészt továbbra is feltáratlan. Katalógusa
Módszertan /fő eredményei katalógusa
A teljes RNS-t vontunk ki a szövetekből 100 beteg GC és négy gyomor rákos sejtvonalak. Az expressziós szinteket a miR-10a határoztuk meg real-time PCR specifikus TaqMan próbákat. Sőt, egy funkcionális elemzése miR-10a sejtproliferációt szabályozó, a migráció és invázió végeztünk. Ezt követően kvantitatív metiláció-specifikus PCR (qMSP) detektálni a DNS metiláció állapotát a CpG szigetek upstream miR-10a katalógusa. Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy a kifejezés a miR-10a GC sejtekben alacsonyabb volt, mint a normális sejtekben, ami volt köszönhető, hogy a hipermetiláció a CpG-szigetek upstream miR-10a katalógusa. Azt is igazolták a valamivel alacsonyabb kifejeződése miR-10a GC szövetekben, mint a szomszédos, nem daganatos szövetekben 100 GC betegek és megerősítette hipermetiláció CpG szigetek upstream miR-10a katalógusa egyes betegeknél. Ezenkívül újbóli bevezetése miR-10a GC sejtek volt képes gátolni a sejtproliferációt, a migrációt és inváziót. Bioinformatikai és immunoblot analízis jelezte, hogy a tumor szuppresszor szerepeinek miR-10a GC sejteket lehetőleg célzási HOXA1. Adataink azt mutatják, hogy a miR-10a működik, mint egy tumor szupresszor GC-sejtek, és részben elhallgattatta DNS hipermetiláció GC, ami arra utal, hogy a miR-10a szolgálhat a potenciális diagnosztikai vagy terápiás célpont a GC. bevezető hivatkozás: Jia H, Zhang Z, Zou D, Wang B, Yan Y, Luo M, et al. (2014) a mikro-RNS-10a leszabályozott DNS metiláció és funkciók tumorszuppresszorként gyomorrákban Cells. PLoS ONE 9 (1): e88057. doi: 10,1371 /journal.pone.0088057 katalógusa Szerkesztő: Jorg Tost, CEA - Institut de Genomique, Franciaország katalógusa Beérkezett: január 26, 2013; Elfogadva: január 4, 2014; Megjelent: január 31, 2014 katalógusa Copyright: © 2014 Jia et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa Forrás: Ez a munka ben támogatták a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (2011, 91129716, a JY), a pekingi Városi Science & Technológiai Bizottság (2010B071, a J. Y.), Institute of Basic Medical Sciences, kínai Orvostudományi Akadémia (2009RC03, hogy J.Y .; 2010PYB06, hogy J.Y .; 2012G04, hogy J. Y.). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa Bevezető a gyomorrák (GC) a második leggyakoribb halálok a rák világszerte [1]. Eddig néhány tumor szuppresszor gének és a tumor kapcsolatos gének számoltak be GC. Bár kiterjedt vizsgálatokat végeztek azonosítani genetikai útvonalak és mechanizmusok a rák kialakulásához, némi javulás a rák korai diagnózisában tettek. A mikroRNS (miRNS-ek) endogén kis nem kódoló RNS-ek, amelyeket azonosítottak, mint poszttranszkripciós szabályozói génexpressziót. Korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy miRNS fejtik keresztül működik tökéletlen bázispárok a 3'untranslated régió (3'UTR) a megcélzott mRNS-ek [2] és miRNS-ek már széles körben tanulmányozták az összefüggésben a sejtciklus szabályozásában, a differenciálódásban, a fejlődés és az apoptózis [3], [4]. Kumulált bizonyíték jelzi, hogy miRNS szabályozatlan a különböző betegségek, különösen a rák. Például a miR-216b jelentősen lefelé szabályozni nasopharingealis carcinoma [4]; miR-340 deregulált emlőrák és képes gátolni a mellrák sejtek migrációját és invázióját; [5] és miR-31 azonosították egy onkogént a nyelőcső pikkelyes sejtes karcinóma [6]. Mindent összevetve, miRNS azonosítottak lehetséges jelöltek új diagnosztikus biomarkerek és terápiás célpontok a rák. Katalógusa A miR-10a leírták, hogy fontos szerepet játszanak a Genesis és fejlődése a különböző emberi rákos. Például a miR-10a szabályozatlan fej-nyaki laphámrák és a hepatocellularis carcinoma [7], [8]. Továbbá, a humán méhnyakrák, miR-10a szolgál egy onkogént szabályozása által CHL1 [9]; leszabályozza miR-10a krónikus myeloid leukémia elősegíti CD34 + sejtek proliferációját [10]. Azonban, a funkció a miR-10a és a mechanizmus alapjául szolgáló gyomor carcinogenesis továbbra sem tisztázott. Ebben a tanulmányban azt pontosan mért expresszióját miR-10a 100 gyomorrákos betegeknél és vizsgálták a szerepek a miR-10a gyomor rákos sejteket. Azt találtuk, hogy a miR-10a-t lefelé szabályozni a GC szövetek és érvényesíteni kifejezése miR-10a elnyomta a proliferáció, migráció és invázió GC sejteket. Katalógusa Az epigenetikai módosítások, beleértve a DNS hipermetilációt hiszton deacetiláció és hisztonmetiláció szorosan összefüggő gén inaktiválása. Promoter hipermetiláció azt gondolják, hogy egy alternatív mechanizmus le-szabályozására tumor szuppresszor gének a humán rákok [11]. MiRNS amelynek expresszióját elfojtott DNS metiláció számoltak be néhány emberi rákok [12] - [14]. Hogy folytatják leszabályozza a miR-10a származik hipermetiláció genomi régió upstream miR-10a katalógusa, elemeztük a DNS metiláció CpG sziget a promoter régió miR 10a katalógusa 55 GC betegek és megállapította, hogy a down-regulációja miR-10a GC szövetekben oka lehet hipermetiláció CpG szekvenciák előmozdítója. katalógusa anyagok és módszerek katalógusa a betegeket példányok katalógusa Humán klinikai mintákat gyűjtöttünk sebészeti mintákban 100 beteg GC Cancer Institute és a Kórház kínai Orvostudományi Akadémia, General Hospital, a Népi Felszabadító hadsereg és a Shanxi Cancer Kórház. A megfelelő szomszédos, nem-daganatos szövetekben a makroszkopikus tumor árrés izoláltunk egy időben és alkalmaztunk kontrollként. A tumorokat rendeztek szerint a TNM (2010) osztályozási kritériumok, az Unió nemzetközi Rákellenes (UICC). Minden mintát két részre oszlik, és azonnal hirtelen lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, és -80 ° C-on, amíg az RNS extrakció. Négy gyomor rákos sejtvonalat (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 és MKN-45) volt, minden megőrzött a laboratóriumunkban és DMEM vagy 1640 10% FBS-t. A Clinical Research Etikai Bizottságának Intézet Basic Medical Sciences, kínai Orvostudományi Akadémia jóváhagyta a kutatási protokollt és írásos beleegyezését adta a résztvevők. Katalógusa RNS extrakció, cDNS-szintézis mRNS és miRNS, és a valós time PCR Assay Teljes RNS-t extraháltunk a gyomorrák szövetek és sejtek Trizol reagens (Invitrogen, CA, USA) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. RNS-t mennyiségileg abszorbancia 260 nm-en, és a cDNS-t szintetizáltunk az M-MLV reverz transzkriptáz (Invitrogen) 2 ug össz-RNS-t. Oligo (dT) 18-t használunk az RT primerek mRNS reverz transzkripciójával. A szár-hurok RT primert használtuk a reverz transzkripciójával miRNS. Kvantitatív RT-PCR-t végeztünk egy Bio-Rad CFX96 valós idejű PCR-rendszer (Bio-Rad, CA, USA) alkalmazásával SYBR Premix Ex Taq reagenskészlet (Takara, Dalian, Kína) vagy TaqMan próbákat (Applied Biosystems, Foster City, CA , USA) a gyártó utasításai szerint. A PCR-körülmények a következők voltak: 95 ° C-on 30 s, majd 40 ciklus: 95 ° C 5 s és 60 ° C-on 34 s. Az mRNS-ek, az adatokat normalizáltuk a endogén GAPDH kontroll. A miRNS-ek, U6 snRNS alkalmaztunk az endogén kontroll. A relatív mennyisége miR-10a mértük a 2 -ΔΔCT módszerrel. A primer szekvenciák táblázatban mutatjuk be az S1. Nagy molekulatömegű genomi DNS-t extraháltunk gyomorrák szövetekből egy DNS Extraction Kit (biomed, BJ, Kína), a gyártó utasításai szerint. Bisulfite módosítás segítségével végeztük Epitect biszulfit-szekvenáló kit (Qiagen, Hilden, Németország) protokoll szerint. Akár 2 ug genomiális DNS-t használjuk, mint a kiindulási anyag. Normál limfocita DNS-t kezelünk CpG metiltranszferáz (M.SssI) (NEB, MA, USA) alkalmaztunk pozitív kontrollként, és a reakció rendszer nélkül templátot használjuk vak kontrollt. A nátrium bisulfate- kezelt DNS-t amplifikáljuk a Bio-Rad CFX96 valós idejű PCR-rendszer (Bio-Rad) alkalmazásával KAPA SYBR® FAST qPCR Kit (Kapa Biosystems), a következő feltételek mellett: 95 ° C-on 5 percig, majd 40 ciklus: 95 ° C 30 s, 54 ° C-on 30 s és 72 ° C-on 30 s és a végső extenzió 72 ° C-on 10 percig. GAPDH használtuk belső kontrollként. qMSP reakciókat hajtottunk végre három párhuzamossal. A metiláció szint egy mintában becsülték Lu L et al. leírt [15]. A primer szekvenciák táblázatban mutatjuk be az S1. A gyomor rákos sejteket oltottunk 10 cm-es csészékben (1 × 10 6 sejt per edény) előtt egy nappal a gyógyszeres kezelés. A sejteket kezeltük 1 mM 5-aza-2'-deoxyazacytidine (5-aza) (Sigma, MO, USA) minden 24 H 3 napig. Az emberi gyomor sejtvonalak HGC-27, SGC-7901 és MKN-45 tenyésztettünk RPMI 1640 (Gibco, BRL, Egyesült Királyság) Media, kiegészítve 10% magzati marhaszérummal, és MGC-803 tartottuk DMEM (Gibco, BRL , UK), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal. Ezeket a sejtvonalakat 37 ° C-on nedvesített levegőben, amely 5% CO 2. Katalógusa A miR-10a utánozzák, a tülekedés utánozzák, siHOXA1 siRNS kódoltakat siRNS állítottam elő GenePharma (Shanghai, Kína ), és transzfektáltuk a sejtekbe egy végső koncentráció 50 nmol /l használva DharmaFECT1 reagens (Dharmacon, TX, USA). sejt proliferáció és telepképző assay a mimic- vagy siRNA- transzfektált sejteket oltottunk 96 lyukú lemezekre (5000 sejt /üreg). A sejteket 10% -os CCK-8 (Dojindo, Japán), 37 ° C hőmérsékleten, amíg a vizuális szín konverzió történt. Proliferációs sebességet meghatároztuk a 0, 12, 24, 48, 72, 96 órával a transzfekció után. A utánozzák-transzfektált sejteket tripszinizáltuk és újra szélesztjük 200 sejt per lyuk mennyiségben egy 6-lyukú lemezekre és karbantartani 1640 10% FBS. A sejteket 7 napig tenyésztjük, metanollal fixáltuk és megfestettük 0,1% -os kristályibolya 20% metanol, 15 percig. Apoptózis vizsgálatokat végeztünk HGC-27 és MGC-803 sejtvonalak felhasználásával Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit I (BD Biosciences), a gyártó protokollja, majd analizáltuk Calibur áramlási citométerrel (Becton Dickinson). sejtmigrációt és inváziós vizsgálati eljárást katalógusa sebgyógyító assay-t, hogy értékelje sejtek migrációját. Egy mesterséges seb jött létre egy összefolyó egyrétegű sejteket FBS nélküli használata 200 pl pipetta hegyét 24 órával a transzfekció után. Hogy láthatóvá vándorló sejtek és a sebgyógyulásban, a képeket vettünk 0, 12, 24, 36, 48, 60 óra. A transwell inváziós vizsgálati eljárást, HGC-27 és MGC-803 sejteket szuszpendálunk 0,2 ml RPMI 1640 vagy DMEM FBS nélküli kerültek a felső kamrába az egyes betétkés (Millipore, MA, USA) előre bevont 40 ul 1 mg /ml matrigel. Az alsó kamra tele volt 600 ul RPMI 1640 vagy DMEM tápközegben, amely 10% FBS-t, mint a táplálkozási attraktáns. 24 órával később az invázió sejtek kapcsolódik az alsó felület fixáltuk 20% metanol és festettük May-Gruwald-Giemsa (MGG). Ezután a membránokat faragott és beágyazott alatt kenjük. A sejteket három különböző vizuális mezőben végeztünk számlálást, és az összes vizsgálatot végeztünk három példányban. Western-blot-analízist végeztünk a standard módszerek szerint. Fehérjéket elválasztottuk 10% SDS-PAGE, majd átvittük PVDF-membránokra (Amersham, Buckinghamshire, Egyesült Királyság). A membránokat blokkoltuk éjszakán át 5% zsírmentes szárított tej és 2 órán keresztül inkubáljuk egy anti-HOXA1 antitest (Bioworld, MN, USA) 1:500 hígításban vagy anti-GAPDH antitest (Proteintech, Chicago, USA) 1: 50000 hígításban. Mosás után TBST-vel (10 mM Tris, pH = 8,0, 150 mM NaCl és 0,1% Tween-20), a membránokat 2 órán keresztül inkubáljuk szekunder antitesttel (zsgb-Bio, Peking, Kína). Valamennyi kísérletet megismételjük legalább három alkalommal. A Student-féle t-teszt (kétfarkú), és az X 2 tesztet végeztünk, és a statisztikai szignifikancia definiáltuk α = 0,05 (két-oldalon). Az átlag ± SD megjelennek a számok. Katalógusa Eredmények katalógusa miR-10a lefelé szabályozni a gyomorrák sejtek katalógusa kifejeződését vizsgáltuk érett miR-10a négy emberi gyomor rákos sejtvonalat (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 és MKN-45) és egy humán gyomornyálkahártya sejtvonal (GES). Az expressziós szintje a miR-10a GES jelentős volt magasabb, mint a szintek a két gyomor rákos sejtvonalat (HGC-27 és MGC-803), és nem volt szignifikánsan, de érezhetően magasabb, mint a szintek a másik két gyomor rákos sejtvonalak (MKN-45, SGC-7901) (1A.). Ezek az adatok azt javasolta, hogy a down-regulációja miR-10a lényeges lehet a Genesis és fejlődése GC. Katalógusa Az Expression miR-10a Clinical GC betegeket és korreláció Klinikopatológiai Jellemzői további vizsgálata közötti összefüggés miR-10a és GC Genesis, észleltünk expresszióját miR-10a 100 klinikai betegek TaqMan® próbát származó valós idejű PCR a fent leírt módon. Ki 100 pár GC mintát, a kifejezés a miR-10a-t alulszabályozott 58 esetben (58/100, 58%), mint a megfelelő szomszédos szövetekben (ábra. 1b). Összességében, a kifejezés a miR-10a-t le-szabályozott GC szövetekben összehasonlítva a szomszédos szövetekben, bár a down-regulációja nem volt statisztikailag szignifikáns (p = 0,148, párosított t-tesztet, két-farkú) (ábra. 1c). a korreláció kiértékelése között kifejezése miR-10a és klinikopatológiai jellemzők, a betegeket két csoportra osztottuk szerint relatív expresszióját miR-10a rákos szövetekben szerint korábban közzétett tanulmány [16] . Táblázatban látható S2, statisztikailag szignifikáns asszociáció volt megfigyelhető a két TNM csoportban. Vannak több beteg, akik a I + II szakaszában a csoport alacsonyabb expressziója miR-10a azok GC szövetekben. Ez az összefüggés azt mutatja, hogy a miR-10a fontosabb lehet a korai rák kialakulásában. Adataink azonban kimutatták, hogy a kifejezés szintjén miR-10a nem volt összefüggés az életkor, a nem, a szövettani típus, a daganat százalékos, vénás invázió, ideg invázió, helyzet, Borrmann gépelés, pT stádium, pN stádium és a PM színpadon. Katalógusa miR-10a gátolja a sejtek proliferációs in vitro Matton tárni, hogy a miR-10a a gyomor karcinogenezis mi transzfektált miR-10a utánozzák a GC sejtvonalak HGC-27 és MGC-803, mindkettő mutatott magas transzfekciós hatékonyság (2A.). Amint azt a CCK-8 növekedési assay 0, 1, 2, 3 és 4 nap után utánozzák transzfekció overexpressziója miR-10a csökkentett sejtproliferációt mindkét sejtvonalban, míg a Scramble utánzó nem volt hatása a sejtproliferációra szemben a kezeletlen sejtek (ábra. 2b). Ezt követően, a telepképződést vizsgálatokat végeztünk, hogy értékelje a proliferatív képességét utánzó-transzfektált HGC-27 és MGC-803 sejteket és kiderült, hogy a túlzott mértékű expressziója a miR-10a HGC-27 sejtek csökkentett kolónia képződését (ábra. 2c). Azonban egyik MGC-803 sejtekben kialakult telep, amely oka lehet a sejtek viszonylag gyenge tapadás. Ahhoz, hogy tovább hatását kezelni miR-10a sejt apoptózis a két GC sejtvonal, a korai apoptózis az MGC-803 és HGC-27 sejteket vizsgáltuk Annexin V festéssel után miR-10a utánozzák transzfekció. Ahogy az várható volt, néhány korai apoptotikus sejtek (20,8% -ban HGC-27 és 22,9% MGC-803) detektáltunk a Scramble utánozzák kezelt sejtek, míg a miR-10a utánozza kezelés növelte a százalékos korai apoptotikus sejtek (28,4% HGC -27 és 27,7% MGC-803) (ábra. 2d). Együttesen arra a következtetésre jutottunk, hogy a miR-10a tudta elnyomni a sejtek túlélését GC sejteket indukálva apoptózist. Katalógusa miR-10a gátolja a sejtek migrációs és behatolás in vitro Matton További hatásait vizsgáló miR-10a sejtvándorlásra és invázió, melyek a legfontosabb tényezők a rosszindulatú progresszió és metasztázis. A migrációs képességét bizonyítja az a sebgyógyulást /scratch esszé HGC-27 és MGC-803 sejtekben. Mindkét sejtvonal kezelt miR-10a utánzó voltak jellegzetesen kevesebb vándorló, mint azok, kezeltünk a Scramble kontroll vagy kezeletlen sejtek 12, 24, és 36 óra után a karcolás (ábra. 3A). Továbbá, mi végzett Matrigel sejt inváziós vizsgálati eljárás, és megfestettük a megszállták sejtek mérésére irányított invázió képességeit után a sejtek ectopiásan expresszáló miR-10a a két sejtvonal. Az invazív transzfektált sejtek miR-10a utánzó drámaian képest csökkent a tülekedés kontroll és kezeletlen sejtek (ábra. 3b). Az eredmények azt mutatták, hogy a miR-10a fontos szerepet játszottak a szabályozó-migráció és invazív GC, és azt javasolta, hogy a down-regulációja miR-10a hozzájárulhat a daganatos áttétek a gyomor kialakulásában. Katalógusa miR-10a célok HOXA1 a GC katalógusa miRNS végre biológiai funkciók révén negatívan szabályozzák célgénjeinek. Leírták, hogy az onkogén HOXA1 közvetlen cél a miR-10a megakariocitopoiezis és az emberi hasnyálmirigy-rák [17] - [19]. Ahogy várható PicTar volt egy komplementer szekvencia között van-miR-10a és HOXA1 3'UTR (4A.). Azonban nem ismert, hogy a miR-10a szabályozza a sejtek szaporodása, migrációja és inváziót GC megcélozva HOXA1. Annak tisztázása, hogy szabályozási kapcsolatot, először észlelte a fehérje és mRNS-szintje HOXA1 a miR-10a utánzó transzfektált HGC-27 és MGC-803 sejtek alkalmazásával Western-blot és RT-PCR. Megfigyeltük nyilvánvaló csökkenése HOXA1 fehérje szintje jelenlétében miR-10a utánozza összehasonlítva a tülekedés ellenőrzés a két sejt (ábra. 4b). Az mRNS szintje HOXA1 is lefelé szabályozni HGC-27 sejtek, ami arra utal, hogy a miR-10a gátolja HOXA1 kifejezés lebontásával mRNS HOXA1 a HGC-27 sejtekben. Azonban kevés változás a mRNS szintjén HOXA1 a MGC-803 sejtekben, ami arra utal, hogy a miR-10a meglehet alul szabályozzák HOXA1 expresszió révén transzlációs elnyomás, de nem mRNS hasítás MGC-803 sejtek (ábra. 4c). Továbbá elemeztük a fehérje szintje HOXA1 24 GC betegeknél. Ezek közül a minták voltak 12 beteg, akiknél a miR-10a-t alulszabályozott azok GC szövetek és 12 beteg, akiknél a miR-10a volt, akár szabályozott azok GC szövetekben (ábra. 4d). HOXA1 volt, akár szabályozott a legtöbb betegnél, akiknél a miR-10a-t alulszabályozott azok GC szövetekben. Hasonlóképpen, HOXA1 volt alulszabályozott a legtöbb betegnél, akiknél a miR-10a volt, akár szabályozott azok GC szövetekben. Összehasonlítása miR-10a szintet és protein szintje HOXA1 GC kiderült, hogy fordított összefüggés miR-10a és HOXA1 (r 2 = 0,1839, p = 0,0366) (ábra. 4e). Együttesen ezek az észleletek erős bizonyíték arra, hogy HOXA1 közvetlen célpontja a miR-10a GC. Azt is kimutatták a mRNS szintje HOXA1 ezeknél a betegeknél és megfigyeltük, hogy mRNS szintje HOXA1 több betegnél nem volt összhangban a fehérje szintje, amely azt mutatta, hogy a miR-10a expresszióját szabályozza a célt, HOXA1 keresztül transzlációs elnyomás, de nem mRNS hasítás ezeknél a betegeknél (ábra. S1). katalógusa Knock-down az HOXA1 Elnyomott Gyomor rákos sejtek növekedését és migráció in vitro Matton Továbbá, kértük, hogy HOXA1 játszott fontos szerepek gyomor rákos sejtekben. Szerepét vizsgálja a HOXA1 GC, mi leütötte endogén HOXA1 a HGC-27 és MGC-803 sejtvonal felismerni a hatást sejtburjánzás és sejtek migrációját. Megfigyeltük, hogy HOXA1 elnyomás gátolta a sejtek proliferációját és migrációját a HGC-27 és MGC-803-sejtek, illetve (ábra. Az 5a és 5b). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a miR-10a funkcionál tumor szupresszor sejtek GC elnyomásával HOXA1 kifejezést. Katalógusa miR-10a epigenetikusan Silenced GC sejtvonalak Hogy világosabb, hogy az alacsony kifejeződése miR 10a GC szövet volt az eredménye epigenetical változtatások kezeltünk HGC-27, MGC-803, SGC-7901 és MKN-45 sejtek DNS-metiláció gátló 5-aza. A kifejezés a miR-10a-ben fel-szabályozták HGC-27, SGC-7901 és MKN-45 sejteket, amikor kezeltük AZA, ami arra utal, hogy ez a kifejezés a miR-10a lehet elfojtott ezekben a sejtekben a DNS metiláció (FIG. 6a). katalógusa a tanulmány szabályozásában a miR-10a DNS metiláció, kerestük a humán genom jelenlétét CpG sziget körül miR-10a a "CpG sziget kereső" szoftver, és meghatározott CpG sziget található, 1638 bp upstream miR-10a katalógusa (6B.). Továbbá kimutattuk a DNS metiláció státuszát qMSP MSP a négy GC sejtvonalak. A CpG-szigetre hipermetiláltnak mind a négy GC sejtvonal, ami összhangban volt az alacsony expressziója miR-10a ezekben GC sejtvonalakban. Amikor a GC sejtvonalakat kezeltük 5-aza-CDR metiiációs szintet csökkent összehasonlítva a DMSO-csoport (ábra. 6c). tovább vizsgálta a metilációs állapotát CpG sziget a GC szövetek és a szomszédos normál szövetben 55 véletlenszerűen kiválasztott esetek keresztül qMSP. A metiláció szintje a 55 GC szövetek magasabb volt, mint a szomszédos, nem rákos szövetekben (p < 0,01), ami összhangban volt az alacsony expressziója miR-10a GC szövetekben (ábra. 6d). Ezen kívül véletlenszerűen kiválasztott két pár mintát, amelyen elemzésére DNS metiláció szinten hidrogén-szulfát szekvenálás PCR (BSP), hogy érvényesítse a pontosságát MSP. Az eredmények a BSP összhangban voltak, hogy a qMSP és arra kiegészítve mutatja. S2. Továbbá, a metilációs szintje miR-10a (M /M + U) ezekben GC betegnél fordított összefüggés a kifejezés a miR-10a (r 2 = 0,1956, p = 0,0006) (ábra. 6e). Azt is kimutatták a metilációs szintje miR-10a normál gyomor sejtek és gyomorrák sejtvonalakon. Az eredmények a qMSP feltárta, hogy a CpG-szigetre volt részlegesen metilezett a GES sejtekben, de rendkívül hipermetilációja a két gyomor rákos sejtvonalak HGC-27 és MGC-803, ami azt is javasolta, hogy a CpG-szigetre upstream miR-10a Vita katalógusa Ebben a vizsgálatban megállapítottuk, hogy a miR-10a-t lefelé szabályozni az emberi gyomorrák részben annak köszönhető, hogy a DNS-promoter hipermetilációt. További vizsgálatok kimutatták, hogy a túlzott mértékű expressziója a miR-10a elfojtott sejtproliferációt, a migrációt és invazív a GC sejtvonalak HGC-27 és MGC-803, lehetőség célzás az onkogén HOXA1. miRNS leírták, hogy szabályozzák a különböző fejlődési és celluláris folyamatok és érintettek számos emberi betegségek, különösen a rák. MiRNS elnyomja génexpresszió megcélozva mRNS keresztül való kötődés 3 'UTRs. Ezek a miRNS mutatnak szabályozó szerepet a rák patogenezisében, és részt vesznek a sejtproliferáció, differenciálódás, az apoptózis, metasztázis és ellenállás [4], [20]. MiR-10a fontos szerepet játszik számos rákos megbetegedések, beleértve a hepatocelluláris rák [9], hasnyálmirigyrák [17], az akut mieloid leukémia [21], és a krónikus myeloid leukémiát [10]. Az abnormális expressziója a miR-10a valószínűleg döntő szerepet játszanak a malignus transzformáció és relatív, hogy szövet-specificitást. A dereguláció hozzájárulnak a gyomor daganat. Katalógusa A validációs expressziójának miR-10a klinikai mintákban kimutatták, hogy a miR-10a-t lefelé szabályozni a 58 (58/100, 58%) GC szövetek összehasonlítva a szomszédos szöveteket. Azonban Weidong Chen et al. Számos miRNS leírták, hogy korrelál a tumorigenezis, azonban a mögöttes molekuláris mechanizmusa még nem tisztázott. A jelentés elkészítése, funkcionális elemzését miR-10a, beleértve a sejtek szaporodását, a migráció és behatolás vizsgálatokban, segített nekünk, hogy jobban megértsük a hozzájárulást a miR-10a gyomor kialakulásában. Transzfekció miR-10a utánozzák jelentősen gátolta a sejtburjánzást, a migráció és invazív GC sejtekben, jelezve, hogy a védekezés a miR-10a elősegítheti a tumor progresszió gyomor kialakulásában. További vizsgálatok szükségesek megvilágítani ezt a mechanizmust. Katalógusa Az emberi genom, miR-10a katalógusa előtt található a HOXB4 katalógusa. miR-10b katalógusa, másik tagja a miR-10 család előtt található a HOXD4 katalógusa. Ez a két tag egymástól eltérő csak egy bázis és mutatnak azonos mag szekvenciák, ami arra utal, hogy a hasonló funkciókat. Kwoneel Kim [12] arról számolt be, hogy a miR-10b szerepet játszik a GC, mint egy tumor szupresszor. Tanulmányunkban bemutattuk, hogy a túlzott kifejeződése miR-10a gátolta a tumor proliferáció, migráció és invazív, amely hasonló volt a funkciója miR-10b GC. HOX gének erősen konzervált transzkripciós faktorok, amelyek meghatározó helyes anterior-posterior mintázatának a test tengelye [23]. HOXA1 már érvényesített, mint a közvetlen cél a miR-10a humán hasnyálmirigyrák [17] és megakaryocytopoiesis [18]. Azt is megfigyelték, hogy a túlzott mértékű expressziója a miR-10a csökkent HOXA1 fehérje szint két GC sejtvonal, ami arra utal, hogy a HOXA1 közvetlen cél a miR-10a gyomorrákban. epigenetikai módosítások kimutatták, hogy kulcsfontosságú mediátorok alapjául szolgáló leszabályozza miRNS expresszió és mutatnak szoros összefüggést karcinogenezissel [12], [13], [24]. Adataink igazolták, hogy a hipermetiláció CpG sziget upstream miR-10a katalógusa vezetett leszabályozza a miR-10a GC sejtvonalak és GC betegeknél. Sőt, AZA kezelés növelte a miR-10a GC sejtvonalakban. Eredményeink alapján, a metilációs állapotát miR-10a alkalmazhatunk, mint potenciális biomarker GC. Összefoglalva, ez a tanulmány beszámol arról, hogy a miR-10a működik tumorszuppresszor GC sejtekben, és részben le -regulated DNS hipermetiláltsági. Erőltetett kifejezése miR-10a elnyomja sejtburjánzást, a migráció és invazív in vitro katalógusa. A metilációs állapotát, és az expressziós szint a miR-10a szolgálhat potenciális biomarkerek GC, és miR-10a lehet lehetséges terápiás értékét a rákterápiában. További vizsgálatok a epigenetikai szabályozása miRNS expressziós szükségesek, és a szabályozás a miRNS expresszió epigenetikus gyógyszerek egy új terápiás stratégiát gyomor és egyéb emberi rákos. Katalógusa alátámasztó információk Köszönetnyilvánítás katalógusa A szerzők köszönetet mondanak Hualu Zhao származó IBMS (Institute of Basic Medical Sciences), PUMC (Peking Unió Medical College) technikai segítségnyújtás és Dr. Hongkai Zhang Jiuxianqiao Hospital neki segítséget immunhisztokémiai. katalógusa
Következtetések /Jelentősége
DNS-extrakció a metilezés-specifikus PCR (MSP) és kvantitatív metiiációspeeifikus PCR (qMSP)
5-aza-2'-deoxyazacytidine kezelés
Sejttenyészet és oligonukleotidok transzfektálása
sejt apoptózis assay
Western-blot
Statisztika
down-regulációja a miR-10a GC betegeket volt köszönhető, hogy a hipermetilációja a CpG szigetek katalógusa
hipermetilációját GC sejtek (ábra. 6f). Együttesen ezek az észleletek erős bizonyíték arra, hogy a kifejezés a miR-10a szabályozta DNS metiláció ezekben GC betegeknél. Leszabályozza a miR-10a GC beteg volt köszönhető, hogy hipermetiláció a CpG szigetek. Katalógusa
Vizsgáltuk expressziójának miR-10a 33 GC esetekben és megfigyelték, hogy a miR-10a expresszió nagyobb volt GC szövetekben, mint a szomszédos szövetekben [22]. Az inkonzisztencia lehet eredménye a különböző mennyiségű klinikai minta és a jellegtelen változás a miR-10a GC szövetekben. Adataink kell több biológiailag képviselettel, mert a nagyobb számú klinikai mintákban. Csak egy nagyobb részét, de nem minden a GC betegek egy down-regulációja miR-10a azok GC szövetekben azonban a MIR-10A működik, mint egy tumorszuppresszor a gyomor rákos sejtekben. Ez azért lehet, mert a különböző mechanizmus keletkezésének GC különböző személyek. Lehet, hogy néhány más fontos gének vagy felelős tényezők tumorképzésért GC betegek, akiknek GC szövetek miR-10a nem változott, vagy akár szabályozni. Ezen túlmenően, a miR-10a expressziós nem mutatott korrelációt a klinikopatológiai jellemzőit, kivéve a TNM-beosztása, jelezve, hogy a miR-10a játszhat részleges szerepet tumorigenezis, különösen korai szakaszában.
ábra S1.
Az mRNS szintje HOXA1 a 24 GC esetben észleltek qRT-PCR. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0088057.s001 katalógusa (TIF) hotelben ábra S2.
BSP elemzés a metiiációs állapotát két GC betegeknél. Töltött és üres körök képviselik metilezett és nem metilezett CpG helyek ill. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0088057.s002 katalógusa (TIF) hotelben táblázat S1. katalógusa A primereket használjuk ezt a cikket. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0088057.s003 katalógusa (XLSX-) hotelben táblázat S2.
közötti társulás kifejezése miR-10a klinikopatológiai jellemzők gyomorrákos betegeknél. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0088057.s004 katalógusa (XLSX-) hotelben