PLoS ONE: Экспрессия AFP и STAT3 участвует в Мышьяк Trioxide-индуцированный апоптоз и ингибирование пролиферации в AFP-продуцирующие рак желудка Cells

Абстрактный
<р> Альфа-фетопротеин (AFP) -продуцирующих рак желудка (AFPGC) , представленное производством AFP, имеет более агрессивное поведение по сравнению с распространенным раком желудка. Основные механизмы недостаточно хорошо изучены. Триоксид мышьяка (As <суб> 2O <суб> 3) используется в клинических условиях для лечения острого промиелолейкозе (APL) и обладает активностью <ЕМ> в пробирке
против нескольких твердых опухолевых клеточных линий, с индукцией апоптоза и ингибирование пролиферации простые эффекты. Преобразователь сигнала и активатор транскрипции 3 (STAT3) играет важную роль в онкогенеза различных первичных злокачественных опухолей и раковых клеток путем повышающей регуляции клеток-выживаемость и downregulating опухолевых супрессоров белков. Здесь мы обнаружили уменьшение экспрессии АФП и STAT3 после индукции апоптоза As <югу> 2О <суб> 3 в клетках AFPGC FU97. Кроме того, уровень целевой STAT3 онкогена Bcl-2 было снижено с As <суб> 2O <суб> 3, и что супрессора опухоли Вах был увеличен. Кроме того, выражение STAT3 и глубина инвазии и метастазов в лимфатических узлах были связаны. Выживаемость больных раком желудка была ниже AFP и STAT3 двойной избыточной экспрессии, чем с избыточной экспрессией либо в одиночку. Подавление AFP и экспрессия STAT3 играет важную роль в As <суб> 2О <югу> 3-индуцированный апоптоз клеток AFPGC, который предлагает новый механизм As <суб> 2О <югу> 3-индуцированный апоптоз клеток. Как <суб> 2О <суб> 3 может быть возможным средством для лечения AFPGC
<р> Образец цитирования:. Цзя Y, Лю D, D Сяо, Ма X, S Хань Чжэн Y и др. (2013) Выражение AFP и STAT3 участвует в Мышьяк Trioxide-индуцированный апоптоз и ингибирование пролиферации в клетках AFP продуцирующих рака желудка. PLoS ONE 8 (1): e54774. DOI: 10.1371 /journal.pone.0054774
<р> Редактор: Матиас А. Авила, Университет Наварры школы медицины и Центра прикладных медицинских исследований (CIMA), Испания
<р> Поступило: 4 ноября 2012; Принято: 14 декабря 2012 года; Опубликовано: 30 января 2013
<р> Copyright: © 2013 Цзя и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Это исследование поддерживается Национальным Природа научного фонда Грант Китая (NSFC, № 81000869 и 81272588). (Http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default166.htm.). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> Альфа-фетопротеин (AFP) является одним из основных плазменный белок, вырабатываемый желтка и печени во время внутриутробной жизни. В клинической практике АФП часто используется в качестве опухолевого маркера гепатоцеллюлярной карциномы и желточного мешка опухоли. Некоторые исследования показали, что другие опухоли у человека также может производить AFP и рак желудка был одним из наиболее распространенных [1] - [8]. AFP-продуцирующих рак желудка (AFPGC) имеет более агрессивное поведение по сравнению с распространенным раком желудка, так как болезнь быстро прогрессирует и часто метастазирует в региональные лимфатические узлы и печень [7] - [10]. Кроме того, AFPGC связан с более коротким интервалом, свободной от метастазов в печени после радикальной операции, а выживаемость значительно беднее, чем AFPGC без производства [1] AFP, [9], [10]. Таким образом, АФП может быть пассивным опухолевым маркером и активный стимулятор роста опухоли. Downregulating выражение AFP может быть эффективным подходом к AFP-продуцирующих рак
<р> триоксид мышьяка (As <суб> 2О <суб> 3) успешно используется для лечения лейкемии [11] - [13]. И активен в нескольких солидных опухолей, в том числе рака желудка [14]. Механизм действия As <суб> 2О <суб> 3 включает в себя влияющие на деятельность Akt, JNK киназ, NF-kB, глутатион, кальциевой сигнализации, активных форм кислорода (ROS), и каспаз, а также про- и противовоспалительных -apoptotic белки [15] - [18]. Нет стандартной химиотерапии не доступен для AFPGC, хотя некоторые схемы лечения продемонстрировали эффективность в небольшом числе случаев [19] - [21]. Кроме того, эффекты и механизм As <югу> 2О <суб> 3 против AFPGC остаются неясными.
<Р> преобразователь сигнала и активатор транскрипции 3 (STAT3) участвует в обоих трансдукции сигнала и активации транскрипции и имеет важную роль в различных биологических процессах, таких как метаболизм и онкогенеза [22], [23]. STAT3 конститутивно активируется в самых различных типов рака [24], [25]. Ориентация STAT3 может быть эффективным подходом к решению прогрессии опухоли. Этот STAT3 эффект опосредован через регуляцию различных STAT3 генов-мишеней, в том числе ингибиторы апоптоза и регуляторов клеточного цикла, такие как Bcl-2, MCL-1, сурвивин, p53, с-Мус, циклин D1, [26] - [31], и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) [32]. Тем не менее, роль STAT3 в AFPGC мало изучен.
<Р> Здесь мы исследовали влияние As <суб> 2О <суб> 3 на пролиферацию и АФП и экспрессии STAT3 в клетках AFPGC FU97. Мы оценивали вниз по течению событий сигнализации STAT3, экспрессии Bcl-2 и Вах, чтобы изучить возможные механизмы, лежащие в основе этого явления. Кроме того, мы оценили экспрессию AFP и STAT3 с помощью иммуногистохимии в образцах рака желудка человека. Подавление AFP и выражения STAT3 способствовали как <югу> 2О <югу> 3-индуцированный апоптоз и ингибирование пролиферации в AFPGC.

Материалы и методы

Этика Заявление
<р> протокол исследования был одобрен по медицинской этике клинических испытаний andHuman комитета Центральной больницы Цзинань путем. Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов.

Культура клеток и наркологический
<р> человеческой линии клеток AFPGC FU97 была получена из японской коллекции Research биоресурсам (Япония) и поддерживали в DMEM ( Invitrogen) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS;. Invitrogen) с добавлением 1% антибиотиков при температуре 37 ° с в атмосфере 5% сО <суб> 2 увлажненный воздух
<р> Как <суб> 2O <суб> 3 ( Sigma), растворили в фосфатном буферном растворе (PBS) в 1 моль /л в качестве маточного раствора и хранили при температуре 4 ° с. Для в пробирке
использования, раствор разбавляют до соответствующей концентрации в среде роста без FBS. Экспоненциально растущие клетки обрабатывали As <югу> 2O <подразделам> 3 при конечных концентрациях 1, 5 или 10 мкмоль /л. Контрольные культуры обрабатывали дистиллированной PBS до конечной концентрации 0,1% в культуральной среде. Все эксперименты проводились в трех экземплярах.

MTT цитотоксичности
<р> Эффект As <суб> 2О <суб> 3 на ингибировании в пробирке
определяли рост клеток FU97 путем измерения МТТ (3- [4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенилтетразолийбромид) окрасить абсорбцию живых клеток. FU97 клетки высевали в 96-луночные планшеты в количестве 1,6 × 10 3 клеток на лунку в 100 мкл среды DMEM, содержащей 10% FBS в течение ночи. После воздействия различных концентраций As <к югу> 2О <суб> 3 в течение 24, 48 и 72 ч, добавляли 20 мкл (5 г /л) МТТ (Sigma, St. Louis, МО) раствор добавляли в каждую лунку и планшеты инкубировали в течение еще 4 ч при 37 ° С. Формазина растворяли в 150 мкл /лунку диметилсульфоксида (ДМСО), и оптическая плотность регистрировали при длине волны 490 нм. Ингибировани (%) = (1-значение в экспериментальной группе /значение в контрольной группе) × 100%. 0 мкмоль /л группа была использована в качестве пустой контроль.

Анализ фрагментации ДНК с помощью электрофореза
<р> В общей сложности из 10 6 клеток осторожно соскабливают с посуды, дважды промывают в холодной PBS, и центрифугировали со скоростью 15000 оборотов в минуту в течение 10 мин, а затем подвергали лизису в 200 мкл буфера для лизиса (1 мл 1 М Трис-HCl, рН 7,4, 0,2 мл 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА], 0,5 мл 10% -ного Тритона Х-100 ). Лизируют клетки выдерживали при температуре 4 ° С в течение 10 мин, и надосадочную жидкость инкубировали с 2 мкл РНКазы А (10 мг /мл в Трис-ЭДТА буфере) при 50 ° С в течение 30 мин, затем с 2 мкл протеиназы К (10 мг /мл в дистиллированной воде) в течение 45 мин при 50 ° с. Раствор смешивают с 5 М NaCl (20 мкл) и 2-пропанола (120 мкл), инкубировали при 20 ° С в течение 24 ч, затем центрифугировали при 15000 оборотах в минуту в течение 20 мин. Осажденный ДНК растворяли в Трис-ЭДТА (5 мкл) буфера и подвергались электрофорезу на 2% агарозном геле и буфере Трис-ацетат-ЭДТА при 50 В. Схема фрагментации ДНК визуализировали с использованием УФ-просвечивания.

Hoechst 33258 Окрашивание Анализ апоптозом клеток

клетки, выращенные на стеклянной крышкой ведомостях фиксировали 4% параформальдегидом /PBS в течение 30 мин, промывали в течение 15 мин в 0,1% Triton X-100 /PBS и инкубировали в темноте с помощью Hoechst 33258 (10 мкг /мл) в течение 15 мин. После того, как крышка-слипы были промыты в PBS, положительные ядра подсчитывали. Нормальные ядра и апоптотических ядер (загущенные или фрагментарной хроматина) были легко отличимы.

Количественная ПЦР в реальном времени
<р> Клетки культивировали с As <суб> 2О <суб> 3 (5 мкмоль /л ) в течение 72 ч. Суммарную РНК экстрагировали с использованием реагента Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) и количественно с помощью спектрофотометрии. Первой нити кДНК получали с использованием случайных праймеров, следуя инструкциям набора (Takara, Japan). В режиме реального времени количественный ПЦР AFP, STAT3 и ее вниз по течению генов, участвующих в 7300 ПЦР в реальном времени системы (ABI, USA) с Takara SYBR Премикс Ex Taq реагентов (Takara, Japan). Праймеры были разработаны и проверены Invitrogen. Грунтовка информация в таблице 1. ПЦР-реакции проводили в трех повторах в объеме 20 мкл, в течение 2 мин при 94 ° С в течение начальной денатурации, а затем 30 циклов при 94 ° С в течение 30 сек и при 60 ° С в течение 45 s. Ген GAPDH, контроль домашнего хозяйства использовался в качестве внутреннего контроля. Каждый набор праймеров был впервые опробован для определения оптимальных концентраций, и продукты были выполнены на агарозном геле 1%, чтобы подтвердить соответствующий размер. Впоследствии ABI кривая диссоциации программное обеспечение было использовано для управления несколькими видами в каждой ПЦР-амплификации. кДНК из FU97 клеток без As <суб> 2О <суб> 3 лечения была использована для построения стандартной кривой для каждого гена.

Вестерн-блот анализ
<р> Клеточные гранулы гомогенизируют в буфере для экстракции (50 ммоль /л Трис-HCl, рН 6,8, 0,1% SDS, 150 мкмоль /л NaCl, 100 мг /л фенилметилсульфонилфторида, 1 мг /л апротинина, 1% NP-40 и 0,5% ортованадата натрия), инкубировали при 4 ° С в течение 30 мин и центрифугируют в течение 20 мин при 12 000 г /мин. Общее содержание белка в лизате клеток измеряли с использованием колориметрического набора Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Для вестерн-блот-анализа, общего белка разделяли на 10% SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (0,45 мкм, Millipore, Биллерика, Массачусетс, США), которые инкубировали в течение 24 ч при 4 ° С с антителами к АФП (1 :500, R &Amp; D), STAT3 (1:1000), каспазы 3 (1:500), Bcl-2 (1:500), БАКСА (1:500) и GAPDH (1:1000, все технологии клеточной сигнализации) , затем конъюгированного с пероксидазой хрена анти-мыши /кролика IgG-антитела (Santa Cruz Biotechnology) после окончательной промывки. Реакции были разработаны с использованием 4-хлор-1-нафтола (Sigma) и H <суб> 2О <югу> 2. Сигналы были обнаружены с использованием расширенного набора хемилюминесценции (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK). Уровень GAPDH был внутренний стандарт.

Иммуноанализ AFP Концентрация в супернатанте
<р> Супернатант FU97 клеток собирали после обработки как <суб> 2О <югу> 3 или отрицательного контроля в течение 24, 48 и 72 концентрация h.AFP в супернатанте определяли с помощью двухузельного иммуноферментного анализа в системе TOSOH AIA (Япония). Отсечка значение АФП составила 10 нг /мл.

Пациенты
<р> Мы рассмотрели данные из хирургических и патологических записей для 24 пациентов с AFPGC и 24 случайно отобранных пациентов с нормальным уровнем сывороточного AFP и соответствуют AFPGC пациентов от рака желудка стадии. Пациенты подверглись хирургической резекции в клинической больнице университета Шаньдун, Китай, с января 1996 года по декабрь 2011 года больных AFPGC показали повышенный уровень сывороточного АФП, но никаких сопутствующих заболеваний печени. Гистопатологические присутствие AFP позитивности было подтверждено с помощью иммуногистохимии. Мы связались с каждого пациента, чтобы подтвердить выживание или дату смерти.

Immunohistochemistry
<р> Immunohistochemistry участие использование биотин-стрептавидин-пероксидазы с комплектом Vectastain ABC (Vector Laboratories, Калифорния, США). Вкратце, срезы ткани (4 мм) были получены из образцов тканей залитых парафином. Срезы депарафинизировали ксилолом с последующей дегидратацией в градуированном спирте. Срезы нагревали в микроволновой печи в течение 2 мин при 900 Вт для получения антигена, а затем инкубировали с 0,3% <к югу> 2 раствора H <суб> 2O в метаноле в течение 30 мин, чтобы блокировать эндогенной пероксидазы. После 3 промывок с phosphatebuffered физиологическим раствором (PBS), предметные стекла инкубировали с 10% нормальной лошадиной сывороткой, чтобы блокировать неспецифическую фоновое окрашивание, а затем инкубировали с первичным кролика антителами анти-AFP (1:100 разведение) и анти-STAT3 (1:200) в влажной камере при 4 ° С в течение ночи. После промывки PBS, срезы инкубировали с биотинилированным-конских антитела против мышиных антител в течение 30 мин, промывали 3 раза PBS, и инкубировали с стрептавидин-конъюгированные с пероксидазой в течение 30 мин. Срезы визуализировали путем инкубации с 3, 3'-диаминобензидин раствор (0,3% Н <югу> 2O <югу> 2 и 0,05% 3, 3'-диаминобензидина) и контрастно гематоксилином. Пропуски первичного антитела был отрицательным контролем. Каждый прогон включал положительный и отрицательный контроль. Для отрицательного контроля, первичное антитело было заменено PBS.

Статистический анализ
<р> Данные выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение и анализировали с использованием SPSS v11.5 (SPSS Inc., Чикаго , IL, USA). Ассоциация клиникопатологическими переменных и AFP и экспрессии STAT3 определяли с помощью критерия хи-квадрат, и коррекция Яте была применена в небольшом количестве образцов. Хи-квадрат или два хвостами т
критерий Стьюдента использовался для оценки различий между группами. Анализ выживаемости участвует тест лог-ранговый, с кривыми Kaplan-Meier. P &л; 0,05 считалось статистически значимым

Результаты

Замедление роста и индукции апоптоза в клетках FU97 по As <югу> 2О <суб> 3
<р> FU97 клетки обрабатывали. различные концентрации As <югу> 2О <суб> 3 (1, 5 и 10 мкмоль /л) на 24, 48 и 72 ч. Как <суб> 2О <югу> 3 ингибирует пролиферацию клеток FU97 концентрации и времени Зависимо (рис. 1А). В клетках, обработанных 5 мкмоль /л и 10 мкмоль /л в виде <к югу> 2О <суб> 3 в течение 72 ч, ингибирование роста 56,27 ± 3,91% и 73,46 ± 4,64%, соответственно. фрагментация ДНК является характерной особенностью процесса апоптоза. Типичная фрагментацию ДНК лестницы были обнаружены в FU97 клетках, обработанных 5 мкмоль /л и 10 мкмоль /л В <к югу> 2О <суб> 3 (рис. 1В). Здесь мы дальше изучать морфологические изменения клеток путем апоптоза. FU97 клетки обрабатывали 5 мкмоль /л и 10 мкмоль /л As <к югу> 2О <суб> 3 в течение 72 ч, окрашивали с помощью Hoechst 33258 и наблюдали под флуоресцентными результатов microscope.The показал, что как <суб> 2О <суб> 3 индуцированных FU97 клеток апоптоз в зависимости от концентрации, как показано фрагментированных и конденсированных ядер (рис. 1в). Для выяснения дальнейшего влияния As <к югу> 2O <подразделам> 3 на апоптоза клеток, caspase3 измеряли с помощью западных blot.The результатов рис. 1D ясно показали, что экспрессия белка каспазы 3 значительно увеличился в FU97 cells.Therefore, как <суб> 2О <суб> 3 может ингибировать рост клеток и индуцирует апоптоз клеток AFPGC FU97.

Ингибирующее действие As <суб> 2О <суб> 3 на экспрессию AFP и STAT3 в клетках FU97
<р> Для выяснения роли АФП и STAT3 в качестве <> 2O к югу <югу> 3 индуцированное ингибирование пролиферации и апоптоза, влияние As <суб> 2О <суб> 3 на AFP и STAT3 экспрессию исследовали с помощью количественной ПЦР в реальном времени и вестерн-блот. Клетки обрабатывали 1, 5 и 10 мкмоль /л В <к югу> 2О <суб> 3 для 72 h.The мРНК и экспрессию белка АФП и STAT3 и фосфорилирования STAT3 были значительно подавлена ​​с As <суб> 2О <суб> 3 лечение в зависимости от концентрации (рис. 2, рис. 7).

AFP Концентрация, связанные с ростом и ингибирование апоптоза в FU97 супернатанта клеточной культуры
<р> Для дальнейшего подтверждения ингибирующего эффекта Как <суб> 2О <суб> 3 на AFP, мы измерили уровень белка альфа-фетопротеина в супернатанте FU97 клеток. Как <суб> 2О <суб> 3 может привести к снижению концентрации АФП уровня белка Зависимо (рис. 3, рис. 7). Этот результат совпал с соотношением клеточного торможения роста (рис. 1А), апоптоз FU97 клеток (рис. 1В, С, D), а также снижение экспрессии мРНК AFP и STAT3 (рис. 2, а) и экспрессии белка альфа-фетопротеина, STAT3 и pSTAT3 (рис. 2В).

пониженные уровни STAT3 Таргетинг Гены, Bcl-2 и Вах, с As <суб> 2О <суб> 3 Лечение в FU97 клеток

Для того, чтобы исследовать выражение из STAT3 ориентации генов, мы исследовали экспрессию антиапоптической Bcl-2 и проапоптотического Вах в FU97 клетках, обработанных As <суб> 2O <суб> 3. Экспрессии мРНК и белка Bcl-2 была подавлена ​​в виде <к югу> 2О <суб> 3 обработанных клеток (рис. 4), но Вах был повышающей регуляции, что позволяет предположить, что эффект As <суб> 2O <суб> 3 в апоптозом клеток опосредуется путем ингибирования конститутивно активированных STAT3 (рис. 7).

Клинические характеристики выбранного населения
<р> были 34 мужчины (70,8%) и 14 женщины (29,2%) пациентов, при этом средний возраст 66 лет (диапазон, 45-83 лет). В клинико-патологические характеристики пациентов приведены в таблице 2. Были 48 пациентов имели полные последующие данные, и период наблюдения был от 3-х месяцев до 60 месяцев, со средним периодом 33.7 месяцев. Общая продолжительность жизни была определена как несколько месяцев с момента операции до даты смерти или потери наблюдения.

Иммуногистохимическое Экспрессия STAT3
<р> Потому что нам не хватает информации о выражении STAT3 в AFPGC, мы определили свое выражение с помощью иммуногистохимического окрашивания AFPGC пациента ткани. В 24 AFPGC первичных опухолей, 11 были положительными (46%) и 13 были отрицательными (54%) для экспрессии STAT3. В 24 АФП-отрицательные образцы рака желудка, 8 (33%) первичные опухоли были положительными и 16 (67%) были отрицательными для экспрессии STAT3. Кроме того, несмотря на относительно низкое число пациентов с полными данными, STAT3 избыточная экспрессия была в значительной степени связано с глубиной инвазии и метастазов в лимфатических узлах (р &л; 0,05). В AFP-положительных и -отрицательные групп (рис 5, таблица 2, рис . 7).

Экспрессия AFP и STAT3 ассоциируется с плохим прогнозом рака желудка

медианы выживаемости AFP-положительных пациентов составила 23 месяцев (95% доверительный интервал, 16-30 месяцев ). который был значительно короче, чем в АФП-негативных пациентов, 53 месяцев (95% доверительный интервал, 47-59 месяцев) (P &л; 0,05) .The Медиана выживаемости в STAT3-позитивных группе составила 38 месяцев (95% доверительный интервал , 29-47 месяцев), который был значительно короче, чем в STAT3-отрицательной группы, 54 месяца (95% доверительный интервал, 47-61 месяцев) (P &Лт;. 0.05, фиг.6А и в, рис 7) .Furthermore. , выживаемость была ниже ОВП и STAT3 дважды положительных пациентов, чем с выражением AFP или STAT3 в одиночку (P < 0,05, рис 6C и D, рис 7..). У пациентов с двойным положительным выражением AFP и STAT3 медиана выживаемости составила 22 месяцев (95% доверительный интервал 11-33 месяцев). Для сравнения, у пациентов с одним выражением АФП или STAT3, медиана выживаемости составила 54 мес (95% доверительный интервал 44-64 месяцев) и 59 месяцев (95% доверительный интервал 47-71 месяцев).

Обсуждение
<р> AFPGC было трудно поддается лечению, главным образом, из-за склонности к метастазированию и устойчивости к обычной терапии. Альтернативные методы лечения конкретно решения этих вопросов необходимо срочно. Как <суб> 2О <суб> 3 было использовано в клинических испытаниях APL в течение многих лет, и 10 мг /сут как <суб> 2О <суб> 3 был найден эффективным в индукции полной ремиссии у больных с впервые диагностированным и рецидивирующей APL [ ,,,0],33]. Как <суб> 2О <суб> 3 пролиферации ингибируется клеток и индуцирует апоптоз линии гепатоцеллюлярной карциномы клеток человека HepG2 [34], которая была дополнительно поддержана клинического испытания, показывая как <суб> 2O <суб> 3, чтобы быть эффективным и безопасным для пациентов с поздними стадиями первичной карциномы печени [35], то токсичность была снижена мягкий и уровень сыворотки AFP. Поэтому мы исследовали, может ли как <суб> 2О <суб> 3 также индуцирует ингибирование роста клеток и апоптоз напоминающий печеночную ткань аденокарциномы желудка AFPGC FU97 клеток и обнаружили противоопухолевые свойства As <суб> 2О <суб> 3 в клетках AFPGC.

Мы предоставляем доказательства того, что как <суб> 2О <суб> 3 имеет сильное антипролиферативное действие на FU97 клеток в концентрации и времени зависимым образом. Плазменный уровень мышьяка в клиническом лечении острого промиелоцитарного лейкоза может достигать 5.5-7.3 мМ [36]. В нашем исследовании, все результаты показали, что 5 мкмоль /л В <суб> 2О <суб> 3 эффективно ингибирует пролиферацию и индуцирует апоптоз клеток через 72 часа. Эта доза является клинически значимым, что позволяет предположить, что AFPGC клетки чувствительны к югу как <> 2О <суб> 3.
<Р> AFPGC, как представлено производство AFP, проявляет более высокую пролиферативную активность, слабый апоптоз, и богаче неоваскуляризации, чем AFP-отрицательных рака желудка. С другой стороны, высокий уровень АФП в полностью развитом гепатокарциномой или в сыворотке хозяина связаны с более агрессивное поведение, и увеличение анаплазии [37], [38]. Исследования AFP нокдаун по миРНК нашли пролиферацию клеток тормозится в гепатомы [39]. Таким образом, АФП может функционировать в фундаментальном шагом в прогрессии АФП-позитивного рака. Подавление экспрессии АФП может представлять собой соответствующую терапевтическую стратегию. Мы обнаружили, что как <суб> 2О <суб> 3 может мРНК AFP подавляют и экспрессию белка. Кроме того, деактивация АФП на As <суб> 2О <суб> 3 может ингибировать клеточную пролиферацию и индуцирует апоптоз клеток в клетках AFPGC FU97. Кроме того, секреции АФП в виде <суб> 2О <суб> 3-обработанные клетки были дозо и время зависимым от уменьшились в супернатанте. Подавление экспрессии АФП может способствовать как <суб> 2О <югу> 3-индуцированное ингибирование роста клеток и апоптоз. Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия AFP подавляется в ответ на As <суб> 2О <суб> 3 лечения. AFP может играть важную роль в пролиферации и апоптоза AFPGC.
<Р> В дополнение к точкой конвергенции для многочисленных онкогенных сигнальных путей, STAT3 также участвует в росте клеток и выживаемости. В клетках лейкемии, как <суб> 2O <суб> 3 активирует многочисленные внутриклеточные пути передачи сигналов, что приводит к индукции апоптоза [40]. Как <суб> 2O <суб> 3 ингибирование STAT3, прежде, чем ингибирование клеточной пролиферации, было описано в нескольких клетках миеломы [41]. Кроме того, как <суб> 2О <суб> 3 ингибирует белок тирозинкиназы, таким образом, косвенно убывающую активации STAT белков [42] .Therefore, понижающая регуляция STAT3 считается одним из механизмов действия As <суб> 2О <суб> 3 при остром промиелоцитарном лейкозе (APL) .Мы нашли STAT3 активируется в клетках AFPGC, и как <суб> 2О <суб> 3 может экспрессию STAT3 подавляют мРНК и экспрессию белка STAT3 и pSTAT3. Особенно, подавлена ​​экспрессия STAT3 и pSTAT3 согласуется с подавляются выражением AFP на As <суб> 2O <суб> 3. STAT3 может быть подавлена ​​каким-то фактором во время его активации в ответ на As <суб> 2О <суб> 3. в AFPGC. Независимо от возможных механизмов, участвующих в регуляции STAT3, высокий уровень экспрессии АФП в AFPGC может иметь важные последствия. Предыдущие исследования также показали, что АФП может димеризации с другими белками, такими как ядерные рецепторы (т.е. рецептора ретиноевой), факторы транскрипции и каспаз, все из которых могут способствовать росту опухолевых клеток [43], [44]. Это, в свою очередь, привело к предположению, что АФП может димеризуются с транскрипционных факторов STAT3 способствовать росту AFPGC. Необходимы дальнейшие исследования регуляции экспрессии STAT3, связанного с AFP.
<р> STAT3 может индуцировать апоптоз клеток путем транскрипционно downregulating экспрессии Bcl-2 [45]. Bcl-2 является вверх по течению эффекторные молекулы в пути апоптоза и мощным супрессоров апоптоза. Он может олигомеризоваться Вах, который впоследствии деполяризует митохондриальный мембранный потенциал, чтобы освободить цитохром с и индуцируют апоптоз [46]. Соотношение Bcl-2 к Bax имеет важное значение в определении того, клетки подвергаются апоптозу или выживание. Мы нашли пониженную экспрессию Bcl-2 наряду с заторможенной экспрессии STAT3 с As <югу> 2О <югу> 3 обработки в клетках AFPGC. В отличие от этого, была увеличена экспрессия Bax. Наряду с выводами, содержащимися в других клеточных системах, где был найден тормозится уровень STAT3 для уменьшения экспрессии Bcl-2 и индуцирует апоптоз [45], то как <суб> 2О <югу> 3-индуцированные эффекты, которые мы обнаружили, может быть опосредовано путем ингибирования конститутивно активированного STAT3
.

Для дальнейшей демонстрации играет ли STAT3 ключевую роль в AFPGC, мы исследовали пациентов AFPGC с точки зрения выражения STAT3. STAT3 позитивности в AFP-положительных опухолей составила 46%, а в AFP-отрицательных опухолей на 33%. У пациентов с AFPGC имели более высокий уровень экспрессии STAT3, хотя не имеет существенного значения, возможно, из-за небольшого числа пациентов. Однако STAT3-позитивных выражение было связано с раковой ткани, глубина инвазии и метастазов в лимфатических узлах в AFPGC. Клинически у пациентов с AFPGC имеют плохой прогноз [1], [9], [10]. Мы подтвердили, что прогноз был хуже для пациентов с чем без АФП, которые были сопоставимы по стадии рака. Кроме того, выживаемость больных с обоими АФП и STAT3 позитивности была значительно хуже, чем те, с только AFP или STAT3 позитивности. Таким образом, в данном конкретном типе рака желудка, STAT3 по-видимому, играют важную роль в выживании и пролиферации клеток. Выражение STAT3 в AFPGC может объяснить клинически агрессивное поведение AFPGC, и выражение STAT3 может быть полезным показателем прогрессии, если подтверждено обширным перспективных исследований в больших когорт. Подавление экспрессии AFP и STAT3 может представлять собой соответствующую терапевтическую стратегию в AFPGC. Что касается взаимосвязи между ОВП производства и экспрессии STAT3, нет имеется сообщение, описывающее основные механизмы для date.It Сообщалось, что экспрессия АФП в раке желудка обусловлена ​​отсутствием фактора транскрипции ATBF1 [47]. Кроме того, ATBF1, как ген-супрессор опухолей, enhancesthe подавление сигналов STAT3 взаимодействием с PIAS3 [48] .Therefore, разумно считать, что инактивация гена ATBF1 в AFPGC, в результате мутации или снижению экспрессии, может быть позволить AFPGC клетки для получения белка АФП и overexpres STAT3. Для того, чтобы выяснить, какие факторы участвуют в выражении производства и STAT3 AFP, необходимы дальнейшие исследования.
<Р> В заключение, как <суб> 2О <суб> 3 может ингибировать клеточную линию AFPGC FU97 рост и индуцирует апоптоз. Возможные механизмы были связаны с подавлением AFP и STAT3 и STAT3 ориентации антиапоптозную гена Bcl-2 и повышающей регуляции гена подавителя опухоли Вах (рис. 7). Экспрессия STAT3 в AFPGC играет важную роль в инвазии опухоли и прогноза. Как <суб> 2О <суб> 3 может быть возможным новый адъювантной препарат в лечении AFPGC. Настоящее исследование дает некоторую теоретическую основу для его клинического применения заслуживает дальнейшего изучения.

• PLoS ONE: микроРНК-9 Подавляет пролиферацию, инвазию и метастазирование клеток рака желудка через Таргетинг цикл…
• PLoS ONE: Роман протеомики на основе клинической диагностики Технология Обозначает Неоднородность в активирова…