Финансирование:. Поддерживается Национальный фонд естественных наук Китая (№ 30600278, № 30772359, № 81071997, № 81072073, № 81272779), Программа для нового века прекрасные таланты в университете (NCET-06-0641), исследовательский Фонд Научно-для Возвращается заморских китайских ученых (2008-889), и основные исследовательские фонды для центральных университетов (2012QN224). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение Результаты микроРНК-9 подавлялась и обратно коррелирует с экспрессией циклин D1 и Ets1 в желудочном раковых тканях и клеточные линии Так как предыдущие исследования свидетельствуют о важной роли Ets1 в инвазию и метастазирование раковых клеток [23], [24], мы дополнительно исследовали эффекты зер- 9 избыточная экспрессия и восстановление гена-мишени по миграции и инвазии рака желудка SGC-7901 и AGS клеток. Вестерн-блот и в реальном масштабе времени количественный RT-PCR показали, что трансфекция Ets1, но не циклин D1, спасли микроРНК-9-индуцированной понижающей регуляции Ets1 (рис. 5А и фиг. 5В). В Transwell анализа миграции, желудочные раковые клетки, стабильно трансфицированные микроРНК-9 предшественника представлена нарушенную способность миграции, чем те, трансфицировали отрицательным контрольным вектором (притворной) (рис. 5С). В Матригель анализе вторжения, микроРНК-9 избыточная экспрессия затухает инвазивность SGC-7901 и клетки AGS (рис. 5D). Кроме того, трансфекция Ets1, но не циклин D1, в СГК-7901 и линии AGS клеток восстановили микроРНК-9-meditaed ингибирование миграции и инвазии (рис. 5С и фиг. 5D). Кроме того, мы исследовали влияние микроРНК-9 нокдаун на ГЭС-1, SGC-7901 и AGS клетки. Трансфекция анти-Mir-9 ингибитора привело к усиленной миграции и инвазии этих клеток (рис. S3d и рис. S3E). Эти результаты показали, что микроРНК-9 заметно ослабило <ЕМ> в пробирке Функция и целевые гены микроРНК-9 являются опухоли конкретных и зависит от клеточного контекста. микроРНК-9 способен подавлять экспрессию Е-кадгерина при раке молочной железы [29], что приводит к ядерной транслокации -катенина и его связывания с транскрипционными факторами фактор Т-клеток /лимфоидную фактор энхансер 1, и последующее повышающей регуляции транскрипции гены, которые способствуют пролиферации клеток и ангиогенеза [29]. Принудительная экспрессия микроРНК-9 в линиях клеток рака молочной железы также приводит к значительным изменениям экспрессии нескольких генов в р53, связанных с пути апоптоза [30]. Благодаря прямой ориентации NF-kB, эктопической экспрессии микроРНК-9 ингибирует в пробирке Образцы тканей пациента Вестерн-блот RT-PCR в реальном времени количественный RT-PCR Количественное выражение микроРНК-9 микроРНК цели были предсказаны с использованием алгоритмов Miranda, miRDB, RNA22 и TargetScan [45]. Для того, чтобы идентифицировать гены, обычно предсказанные четырех различных алгоритмов, результаты прогнозных целевых показателей пересекались с использованием miRWalk [46].
<р> рак желудка является четвертым наиболее распространенным видом рака в мире [1]. Несмотря на улучшение в хирургической и мультимодального терапии, прогноз поздних стадий рака желудка по-прежнему остается на низком уровне из-за рецидива, инвазию и метастазирование, с выживаемостью 5 лет ниже 30% [1]. Более глубокое понимание механизмов, лежащих прогрессии опухоли является оправданным, чтобы обнаружить новые парадигмы для диагностики и лечения рака желудка [2]. MicroRNAs (микроРНК), недавно определили категории малых и высоко консервативных некодирующих РНК, могут участвовать в пост-транскрипционной регуляции экспрессии генов посредством частичного связывания с комплементарными нетранслируемые области 3 '(3'-НТО) мРНК-мишени, в результате чего трансляционной репрессии или мРНК деградации [3]. Все новые данные показывают, что микроРНК участвуют в биологических процессах, связанных с апоптозом, пролиферации, дифференцировки, инвазию и метастазирование, в то время как дерегулирование, которая имеет решающее значение для инициации рака и прогрессии [3]. В настоящее время необходимо срочно исследовать роли микроРНК и их гены-мишени в опухолевой прогрессии экспериментальными моделями.
<Р> При раке желудка человека, ряд микроРНК, как сообщается, будет аберрантно чрезмерно выраженной или вниз регулируется во время прогрессирование рака желудка, в том числе микроРНК-21 [4], MIR-15b [5], микроРНК-16 [5], и микроРНК-101 [6]. Эти микроРНК играют онкогенные или опухоль-подавляющих роль в регуляции клеточного роста, миграции и инвазии, подавляя свои гены-мишени. Например, онкогенными микроРНК-21 является аберрантно сверхвыражен в раке желудка, а также усиливает пролиферацию и инвазивность клеток рака желудка путем охвата реверсии индуцирующих богатых цистеином белок с Kazal мотивами [4]. В то же время, микроРНК-15b и микроРНК-16 являются понижающей регуляции при раке желудка, а также способствовать множественной лекарственной устойчивости клеток рака желудка путем модуляции апоптоза с помощью ориентации В-клеточного лейкоза /лимфомы 2 [5]. микроРНК-101 вниз регулируется в желудочном раковые ткани и клеточные линии, в то время как эктопическая экспрессия микроРНК-101 значительно ингибирует пролиферацию, миграцию и инвазию клеток рака желудка путем охвата энхансер zeste гомолога 2, цитохром с оксидазы субъединицы II и миелоидного клеточный лейкоз последовательность 1 [6]. Таким образом, он был центром для дальнейшего изучения экспрессии и функции микроРНК в биологии опухоли рака желудка.
<Р> микроРНК-9 (MIR-9) сначала идентифицируется в качестве одного из важнейших регуляторов для развития , физиологии и патологии нервной системы у нескольких организмов, в том числе Drosophila
, данио и млекопитающих [7] - [9]. Ряд последующих исследований показали, что измененную экспрессию микроРНК-9 связан с развитием и прогрессированием рака [10] - [14]. Предыдущие исследования указывают на то, что микроРНК-9 значительно подавляется при раке желудка, подразумевая его потенциальные роли в опухолевой прогрессии [15] - [18]. Он также указал, что микроРНК-9 может модулировать пролиферацию клеток рака желудка с помощью ориентации хвостового типа гомеобокс 2 (CDX2) [19] и NF-каппа В (NF-kB) [16]. Тем не менее, точная функция и основные механизмы MIR-9 в прогрессии рака желудка все еще требуют дальнейшего изучения. В этом исследовании мы покажем, в первый раз, что микроРНК-9 непосредственно нацелен циклин D1 и V-ЭТС вирус эритробластоз E26 онкогенов гомолога 1 (Ets1), и подавляет пролиферацию, инвазию и метастазирование клеток рака желудка в
пробирке и в естественных условиях
.
<р> Для исследования экспрессии микроРНК-9 в рак желудка, желудка тканей рака и прилегающей к нему неопухолевых слизистой оболочки были собраны из 86 первичных случаев. В режиме реального времени количественный ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR) показали, что микроРНК-9 понижающей регуляции в желудочном раковых тканей, чем в соседней неопухолевых слизистой оболочки ( P
= 0,001, рис. 1А). Выражение микроРНК-9 была значительно ниже в желудочных больных раком желудка с более глубоким вторжением стенки ( P
&л; 0,001), метастазов в лимфатических узлах ( P
&л; 0,001), отдаленных метастазов ( P
= 0,022) и продвинутой стадии TNM ( P
= 0,01) (Таблица S1). В противоположность этому, выше циклин D1 и уровни транскриптов Ets1 были обнаружены в раковых тканях желудка ( P
&л; 0,0001 и P
&л;.. 0,0001, соответственно, рис 1B и 1C рис). Был обратная корреляция между микроРНК-9 и экспрессии циклин D1 уровни транскриптов в желудочном раковых тканей ( P
&л;. 0.001, рис 1D). Кроме того, обратная корреляция между микроРНК-9 и экспрессии уровней транскриптов Ets1 Было также отмечено, в этих раковых тканях ( P
&л; 0,001., Рис 1E). Более низкая экспрессия микроРНК-9 и более высокие уровни транскриптов циклин D1 и Ets1 наблюдались в желудочном линий раковых клеток, чем в нормальных эпителиальных желудка ГЭС-1 клеток [20] (рис. 1F). Иммуногистохимическое окрашивание проводили для наблюдения за экспрессию циклина D1 и Ets1 в этих образцах рака (рис. S1). Ядерный циклин D1 было отмечено в 26/86 (30,2%) случаях, в то время как ядерная и цитоплазма окрашивание Ets1 наблюдалось у 58/86 (67,4%) случаях (таблица S1). Иммунореактивности циклин D1 и Ets1 была значительно выше в желудочных больных раком желудка с более глубоким вторжением стенки ( P
&л; 0,001 и P
= 0,001), метастазов в лимфатических узлах ( P
&л; 0,001 и P
&л; 0,001), отдаленных метастазов ( P
&л; 0,001 и P
&л; 0,001), а также продвинутой стадии TNM ( P
&л; 0,001 и P
= 0,004) (таблица S1). Более низкая экспрессия микроРНК-9 наблюдалась в желудочном раковых тканей с более высоким иммунным циклин D1 ( P
&л; 0,0001, рис 1G.) Или Ets1 ( P
&л;. 0,0001, рис 1H ). Эти результаты показали, что микроРНК-9 вниз регулируется и обратно коррелирует с экспрессией циклин D1 и Ets1 в желудочном раковых тканях и клеточных линиях.
микроРНК-9 вниз регулируется экспрессия циклин D1 и Ets1 через пост -transcriptional репрессии
<р> Чтобы исследовать гипотезу о том, что микроРНК-9 может влиять на экспрессию циклина D1 и Ets1 при раке желудка, вычислительное предсказание было выполнено баз данных микроРНК. Потенциальные сайты связывания MIR-9 с высокой комплементарности были отмечены на базах 2974-2995 циклин D1 3'-UTR и 2648-2670 из Ets1 в 3'-UTR (рис. 2А). Для исследования прямых последствий MIR-9 на экспрессию циклина D1 и Ets1 в желудочном раковых клеток, мы выполнили микроРНК сверхэкспрессии экспериментов. Стабильная трансфекция микроРНК-9 предшественника в SGC-7901 и AGS клеток привело к увеличению уровней микроРНК-9 (рис. S2). Вестерн-блот, ОТ-ПЦР в реальном времени количественного ОТ-ПЦР показал, что избыточная экспрессия микроРНК-9 привело к снижению белка и транскрипционные уровни циклин D1 и Ets1 в клеток рака желудка, чем те, трансфицировали отрицательным контрольным вектором (фиктивный) ( рис. 2В, рис. 2С, а на фиг. 2D). Кроме того, уровни фосфорилированной ретинобластомы (PRB, нижестоящим эффектором циклин D1) [21] и матриксных металлопротеиназ 9 (ММР-9, вниз по течению гена Ets1) [22], содержащиеся в MIR-9 уменьшались сверхэкспресирующим раковых клеток (рис. 2В, рис. 2С, а на фиг. 2D). Для дальнейшего изучения подавляющую роль микроРНК-9 в выражении циклин D1 и Ets1, мы провели нокдаун эксперименты микроРНК-9 путем трансфекции анти-MIR-9 или ингибиторов отрицательного контроля (анти-NC) в ГЭС-1, СГК -7901 и AGS клетки. Трансфекция анти-Mir-9 ингибитора, очевидно, снизился эндогенного микроРНК-9 выражение (рис. S3A), и повышающей регуляции уровней белка циклин D1, PRB, Ets1 и ММР-9, чем те, трансфицировали с анти-NC (рис. 2Е и рис. S4A). В режиме реального времени количественного ОТ-ПЦР анализ показал, что повышенные уровни транскриптов циклин D1, Ets1 и ММР-9 в культивируемых клетках, трансфецированных анти-Mir-9 ингибитора, по сравнению с теми, трансфицируют с анти-NC (рис. 2F и рис. S4B). В целом, эти результаты показали, что микроРНК-9 значительно ингибирует экспрессию циклина D1 и Ets1 через пост-транскрипционной репрессии.
микроРНК-9 непосредственно ориентированы циклин D1 и Ets1 в раковых клетках желудка
<р> Для определить, является ли микроРНК-9 может подавлять экспрессию циклина D1 и Ets1 путем ориентации его сайты связывания в 3'-UTR, продукты ПЦР, содержащие интактные целевые сайты или мутации микроРНК-9 последовательностей распознавания семян (рис. 3А) были вставлены в люциферазы репортер вектор. Плазмиды трансфицировали в желудочном раковых клеток, стабильно трансфецированных с отрицательным контрольным вектором (макете) или микроРНК-9 предшественника. Renilla
люциферазные деятельность нормированные на тех светлячка были значительно сокращены в SGC-7901 и AGS клеток, стабильно трансфицированных с микроРНК-9 предшественника (рис. 3б), и эти эффекты были отменены мутирует предполагаемый MIR-9 связывающие сайты в пределах 3'-UTR циклина D1 и Ets1 (рис. 3, б). Более того, нокдаун MIR-9 с анти MIR--9 ингибитора увеличили люциферазы деятельность в ГЭС-1, SGC-7901 и клетки AGS (рис. 3С и рис. S4C), в то время как мутация микроРНК-9 сайта узнавания отменили эти эффекты (рис. 3C и фиг. S4C). Эти результаты показали, что микроРНК-9 непосредственно и специфически взаимодействовали с сайтов-мишеней в 3'-UTR циклина D1 и Ets1.
микроРНК-9 подавлял пролиферации в пробирке
рака желудка клетки через нацеливание циклин D1
<р> Так как выше доказательства показали, что микроРНК-9 ингибирует экспрессию D1 циклин, и объединяя факты, циклин D1, играет критическую роль в прогрессии клеточного цикла и пролиферации раковых клеток [21], Кроме того, мы исследовали влияние MIR-9 избыточная экспрессия и восстановление гена-мишени на культивируемых клеток рака желудка. Вестерн-блот и в реальном масштабе времени количественной ОТ-ПЦР показал, что трансфекция циклин D1, но не Ets1, спасли микроРНК-9-индуцированной понижающей регуляции циклин D1 (рис. 4 и рис. 4б). В анализе образования колоний, микроРНК-9 избыточная экспрессия ослабляется рост SGC-7901 и AGS клеток, по сравнению с теми трансфицировали отрицательным контрольным вектором (притворной) (рис. 4в). Проточная цитометрия показали, что микроРНК-9 избыточная экспрессия индуцированного клеточного цикла в G <югу> 0 /G <югу> 1 фаза в SGC-7901 и клетки AGS (рис. 4D). Кроме того, трансфекция циклин D1, но не Ets1, в SGC-7901 и клетки AGS восстановили ингибирования пролиферации и клеточного цикла, вызванной чрезмерной экспрессии микроРНК-9 (рис. 4С и фиг. 4D). С другой стороны, мы исследовали влияние микроРНК-9 нокдаун на ГЭС-1, SGC-7901 и AGS клетки. Введение анти-MIR-9 ингибитора в этих клетках приводит к повышенной способности пролиферации (рис. S3B) и прогрессии клеточного цикла (рис. S3C). Эти результаты показали, что микроРНК-9 заметно подавлен в пробирке
пролиферации и прогрессии клеточного цикла клеток рака желудка путем ориентации циклин D1.
микроРНК-9 уменьшал в пробирке <бр> миграция и инвазия клеток рака желудка путем ориентации Ets1
миграции и инвазии клеток рака желудка через таргетирование Ets1.
микроРНК-9 ослабляется рост и метастазирование клеток рака желудка в естественных условиях
<р> Далее мы изучали эффективность MIR-9 против роста опухоли и метастаз в естественных условиях
. Стабильная трансфекция микроРНК-9 предшественника в SGC-7901 или AGS клеток привело к снижению роста и веса подкожных ксенотрансплантатов опухолей у бестимусных голых мышей, по сравнению с теми, стабильно трансфицированные отрицательным контрольным вектором (притворной) (рис. 6A и фиг. 6B ). Кроме того, экспрессия циклин D1, Ets1 и вниз по течению MMP-9 была снижена путем стабильной трансфекции микроРНК-9 предшественника (рис. 6в). Средняя плотность CD31-положительных сосуда была снижена в опухолях, образованных путем инъекции опухолевых клеток, стабильно трансфицированных микроРНК-9-предшественника (рис. 6d). В экспериментальных исследованиях с метастазированием, СГК-7901 или AGS клетки, стабильно трансфицированные микроРНК-9-предшественников, установленным статистически меньше легочных метастатические колонии, чем макетом группы (рис. 6е). Эти результаты свидетельствуют о том, что микроРНК-9 ингибирует рост и метастазирование клеток рака желудка <ЕМ> В естественных условиях
.
Нокдаун циклин D1 и Ets1 phenocopied микроРНК-9 сверхэкспрессии-опосредованного ингибирования на пролиферацию , миграция и инвазия клеток рака желудка в пробирке
<р> Так как выше результаты показали отрицательную регуляцию циклин D1 и экспрессии Ets1 от MIR-9, мы выдвинули гипотезу, что нокдаун циклин D1 и Ets1 может оказывают аналогичное воздействие на культивируемых клеток рака желудка. Малые интерферирующие РНК (миРНК), ориентированная на область кодирования циклин D1 и Ets1, Si-CCND1 и си-Ets1, были разработаны и трансфицировали в SGC-7901 и AGS клеток. Трансфекция си-CCND1 и си-Ets1 привело к снижению экспрессии циклина D1, PRB, Ets1 и ММР-9 в желудочном раковых клеток, соответственно, по сравнению с теми трансфицировали скремблирования миРНК (Si-SCB) (рис. 7А, рис . 7D и рис. S5). Нокдаун циклин D1 подавлял пролиферацию и индуцирует остановку клеточного цикла в G <югу> 0 /G <югу> 1 фаза в SGC-7901 и клетки AGS (рис. 7В и рис. 7в). Кроме того, нокдаун Ets1 в SGC-7901 и AGS клеток привело к снижению возможности миграции и инвазии (рис. 7E и рис. 7F). Эти результаты свидетельствуют о том, что нокдаун циклин D1 и Ets1 phenocopied (обладали подобные фенотипы к) микроРНК-9 избыточная экспрессия в подавлении пролиферации, миграции и инвазии клеток рака желудка в пробирке
.
Обсуждение
<р> Это хорошо установлено, что профиль экспрессии микроРНК-9 при раке зависит от распределения в тканях. В первичных опухолей головного мозга, микроРНК-9 поднимается и функционирует как существенный фактор в нервной канцерогенеза [10]. микроРНК-9 также чрезмерно выраженное в рак шейки матки [11], что говорит о его опухоли роль промотора в развитии и прогрессии опухоли. Тем не менее, микроРНК-9 подавляется в нескольких раковых заболеваний человека, в том числе рака поджелудочной железы [12], рак яичников [13] и колоректальном раке [14], и связан с злокачественной прогрессии рака молочной железы [25] и колоректального рака ( 14). Ло и др.
Отметили понижающую регуляцию MIR-9 в 24 образцов рака желудка [15], который впоследствии был подтвержден в 9 [16], 72 [17] и 13 [18] рак желудка случаи. Тем не менее, Inoue и др.
Сообщили о положительной регуляции MIR-9 в 5 больных раком желудка с помощью ПЦР в реальном времени на основе микроРНК массивов [26], и этот другой нахождение в микроРНК-9 профиля экспрессии может быть вызвано гетерогенности ограниченных образцов. В данном исследовании мы показали, что микроРНК-9 значительно вниз регулируется в 86 первичных образцов рака желудка, чем в соседних неопухолевых тканях, что согласуется с предыдущими результатами [15] - [18]. Важно отметить, что мы также подтверждают, что экспрессия микроРНК-9 обратно связана с клинической стадии, инвазии и метастазирования рака желудка. У людей зрелого микроРНК-9 кодируется тремя независимыми генами, MIR-9-1, MIR-9-2 и MIR-9-3, размещение на хромосомах 1, 5 и 15, соответственно [27]. Предыдущие исследования указывают на то, что вниз регулируется микроРНК-9 Выражение при раке желудка связано с аномальным гиперметилированием промоторной области микроРНК-9 генов, кодирующих [17]. Точно так же, аберрантных гиперметилирование микроРНК-9 семейных генов также и в некоторых первичных опухолях с метастазами в лимфатических узлах, таких, как рак толстой кишки, рак легкого, рак молочной железы, меланома и [14], [28]. Важно отметить, что в настоящее время исследование показало обратную корреляцию между уровнями микроРНК-9 и экспрессии циклина D1 и Ets1 в желудочном раковых тканях, подразумевая, что циклин D1 и Ets1 может отрицательно регулируется микроРНК-9.
и В естественных условиях
рост клеток рака яичников [31] и рост и метастазирование меланомы [32] , В neuroblatoma, избыточная экспрессия микроРНК-9 ингибирует нашествие, метастазирование и ангиогенез опухолевых клеток посредством ориентации матрицы металлопротеиназы 14 [33]. Ван и др.
Сообщили, что избыточная экспрессия микроРНК-9 ингибирует в пробирке
и рост в естественных условиях
клеточной линии MGC803 аденокарцинома желудка через репрессировать NF-kB на уровне пост-транскрипционной [16]. Тем не менее, в недавнем исследовании, Rotkrua и др.
Показали, что микроРНК-9 могут быть вовлечены в желудочном канцерогенезе через понижающего регулирования CDX2, и нокдаун MIR-9 уменьшилось в пробирке
распространение рака желудка MKN-45 клеток [19], а их выводы должны быть дополнительно укреплены с MIR-9 избыточная экспрессия, гена-мишени спасения, и в естественных условиях
исследований. Кроме того, в настоящее время спорным, играет ли CDX2 онкогенного или опухолевый роль супрессора в желудочном канцерогенезе [34], [35]. Кроме того, потенциальная роль микроРНК-9 в инвазии и метастазирования рака желудка не выяснены до сих пор. Таким образом, функции и прямые цели MIR-9 в желудочном прапорщика рака дальнейшего исследования.
<Р> В этом исследовании мы показали, что избыточная экспрессия микроРНК-9 уменьшал пролиферацию, миграцию и инвазию клеток рака желудка, который был похож на циклин D1 или Ets1 нокдаун, что указывает на потенциальное применение MIR-9 в качестве мишени для терапии рака желудка. Кроме того, наши данные подтвердили, что микроРНК-9 непосредственно ориентированы циклин D1 и Ets1 в желудочном раковых клеток с помощью 3'-UTR люциферазы анализа. Так как последние данные свидетельствуют о том, что некоторые микроРНК может альтернативно модулировать экспрессию генов, взаимодействуя с промоутерами [36] - [38], потенциальной роли MIR-9 в регуляции транскрипции циклина D1 и Ets1 через взаимодействие с промоутерами остаются неясными и требуют наше дальнейшее расследование. Циклин D1 является прото-онкоген, который принадлежит к семейству G <подразделам> 1 циклинов, и играет важную роль в клеточном цикле G <югу> 1 с переходом S путем связывания своим партнерам циклин зависимой киназы 4 и 6 фосфорилировать и инактивировать РБ белка [21]. Избыточная экспрессия циклин D1 является ранним событием в канцерогенезе в человеческих колоректальных, пищевода и желчного пузыря рака [39], и является прогностическим показателем, связанный с плохой выживаемостью пищевода, молочной железы и рака мочевого [39]. Циклин D1 избыточная экспрессия в злокачественных опухолях человека поясняется несколькими механизмами, в том числе геномных изменений, после регуляции транскрипции и пост-трансляционной стабилизации белка [39]. Последние данные показывают, что микроРНК-16-1 репрессирует экспрессию D1 циклин на пост-транскрипционном уровне путем связывания его 3'-UTR в мантии клеточной лимфомы [40]. В настоящем исследовании, наши исследования показали, что микроРНК-9-опосредованная ингибирование клеточного цикла прогрессии и клеточной пролиферации был спасен путем восстановления экспрессии D1 циклин в желудочном раковых клеток, что свидетельствует о том, что идентификация циклин D1 в качестве целевого гена микроРНК-9, может объяснить, по крайней мере частично, почему избыточная экспрессия микроРНК-9 подавляло пролиферацию клеток рака желудка.
<р> Ets1, член семейства ETS транскрипционных факторов, связывается со специфическими последовательностями ДНК, содержащими GGAA /T сердечника мотив [22], а также участвует в опухолевой инвазии и метастазирования через регуляции транскрипции нескольких генов, ответственных за ремоделировании внеклеточного матрикса, миграции и вторжения, такие как матрицы металлопротеиназы и активатора плазминогена урокиназы [22]. На сегодняшний день все большее количество клинических исследований показали важные роли Ets1 в развитии и прогрессии опухоли различных солидных опухолей [23], [24]. Предыдущие исследования указывают на то, что выражение Ets1 связано с клинико-патологическими особенностями рака желудка, в том числе инфильтрации опухоли и лимфатических узлов или дистальной метастаз, что говорит о его решающую роль в инвазии и метастазирования рака желудка [41]. Однако механизмы, лежащие в основе Ets1 избыточная экспрессия в развитии рака желудка до сих пор остается в значительной степени неизвестны. Недавние исследования показывают пост-транскрипционной регуляции Ets1 по MIR-125b в клетках рака молочной железы [42], и микроРНК-200b в эндотелиальных клетках [43]. В этом исследовании мы показали, что в качестве прямой цели MIR-9, Ets1 был повышающей регуляции при раке желудка и способствует миграции и инвазии раковых клеток. Нокдаун Ets1 частично phenocopied эффекты MIR-9 избыточная экспрессия в желудочном линиях раковых клеток, в то время как восстановление экспрессии Ets1 спасенного раковые клетки от микроРНК-9-опосредованного ингибирования по миграции и вторжения, раскрыв новый пост-транскрипционный механизм регулирования из Ets1 по MIR-9 и его клинических потенциалов при раке желудка.
<р> Таким образом, мы показали, в первый раз, что микроРНК-9 репрессирует экспрессию циклина D1 и Ets1 через непосредственно нацеливание их 3' -UTR, тем самым ингибируя пролиферацию, инвазию и метастазирование раковых клеток желудка. Это исследование расширяет наши знания о регуляции циклин D1 и Ets1 на пост-транскрипционном уровне микроРНК, и предполагает, что микроРНК-9 может быть потенциальных значений в качестве новой терапевтической мишени для рака желудка.
Материалы и Методы
<р> Разрешение на проведение этого исследования было получено от Совета по институциональному обзору Тунцзи медицинского колледжа (номер официального утверждения: 2010-S003). Парафиновые и свежие образцы 86 первичных случаев рака желудка были получены из отделения хирургии, Юнион больницы Тунцзи медицинского колледжа. Их патологический диагноз был доказан по крайней мере двумя патологоанатомов. Демографические и клинико-патологические данные всех пациентов были обобщены в таблице S1. Прилегающие слизистой оболочки желудка, что не содержали макроскопический опухоль была также получена, и неопухолевых области были впоследствии проверены микроскопической гистологии. Свежие образцы опухолей и прилегающих к ним неопухолевых слизистой оболочкой, собирали и хранили при -80 ° С до использования.
Иммуногистохимия
<р> Иммуногистохимическое окрашивание проводили, как описано ранее [44], с антителами, специфичными к циклин D1, Ets1, MMP-9 и CD31 (Abcam Inc, Кембридж, Массачусетс, 1: 200 разбавление). Отрицательные контроли включают параллельные секции, обработанные пропуском первичного антитела, в дополнение к смежной секции того же блока, в котором первичное антитело был заменен кроличьего поликлонального IgG (Abcam Inc) в качестве контроля изотипа. Степень реактивности оценивали по крайней мере, двух патологов без знания клинико-патологическими особенности опухолей. Степень позитивности первоначально был классифицирован в соответствии с процентом положительных раковых клеток, как: (-) &л; 5% клеток положительно, (1+) 6-25% клеток положительных, (2+) 26-50% клеток положительно и (3 +) > 50% клеток, положительным. Слайды с умеренно позитивное (2+) или сильной положительной (3+) реактивности были классифицированы как имеющие "высокое выражение", в то время как слайды с отрицательной (-) или слабый положительный (1+) реактивности были классифицированы как имеющие "низкую экспрессию" .
<р> клеточный белок экстрагировали 1 × буфера для лизиса клеток (Promega, Madison, WI). Белок (50 мкг) от каждой пробы подвергали 4-20% Сборный полиакриламидном геле (Bio-Rad, Hercules, CA), электрофореза и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Bio-Rad). Для циклин D1, Ets1, ММР-9, PRB и β-актина (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) обнаружения, первичные разведений антител были 1:500, 1:500, 1:500, 1:500 и 1: 1000, соответственно, с последующим 1:3000 разбавлением козьего анти-кроличьего с пероксидазой хрена, меченым антителом (Bio-Rad). Комплект усиленной хемилюминесценции субстрат (Amersham, Piscataway, NJ) использовали для обнаружения chemiluminscent сигналов с авторадиографии пленкой (Amersham).
<р> Общая РНК выделяли с RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA). Обратные реакции транскрипции были проведены с Transcriptor первой цепи кДНК Синтез Kit (Roche, Indianapolis, IN). ПЦР-праймеры для циклин D1, Ets1, MMP-9 и бета-актина были разработаны Premier Primer 5.0 программного обеспечения (Таблица S2). ОТ-ПЦР проводили, как описано ранее [44]. В режиме реального времени количественного ОТ-ПЦР с SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), проводили с использованием ABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems). Флуоресцентные сигналы были собраны во время фазы расширения, были вычислены значения Ct образцов, а также уровни транскриптов циклин D1, Ets1 и MMP-9 были нормализованы таковым бета-актина на 2 -ΔΔCt метода.
<р> уровни зрелого MIR-9 в первичных тканей и клеточных линий определяли с использованием выпирать-Loop ™ микроРНК КПЦР Primer Set (RiboBio Co. Ltd, Гуанчжоу, Китай). После того, как кДНК синтезировали с праймером стволовой петли микроРНК-специфический, количественный ПЦР проводили с использованием специфических праймеров (Таблица S2). Уровни микроРНК-9 были нормализованы таковым U6 мяРНК.
микроРНК целевой прогноз
Культура клеток и трансфекция
<р> желудка человека раковых клеток линии (SGC-7901 и MKN-74) и SV40-трансформированные, нормальные и не онкогенные желудочные эпителиальные ГЭС-1 клетки [20] были получены из коллекции типовых культур китайской академии наук (Шанхай, Китай). Человек Линия клеток желудка AGS (CRL-1739) была приобретена форма Американской коллекции типовых культур (Rockville, MD). Клетки выращивали в среде RPMI 1640 (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (Life Technologies, Inc.), пенициллином (100 ед /мл) и стрептомицина (100 мкг /мл). Клетки выдерживали при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO <суб> 2.
Новый метод компьютерного моделирования предсказывает, как микробы кишечника меняются с течением времени
Молодая кровь восстанавливает жизненные силы у пожилых людей
Обычный грибок, обнаруженный на коже, может вызвать воспалительное заболевание кишечника.
Этот пепто, вероятно, не поможет вашей язве
Растительная пища может передавать человеку устойчивые к антибиотикам супербактерии
Микробы легких могут помочь предсказать исходы у тяжелобольных
Что древние фекалии могут рассказать нам об эволюции микробиома кишечника человека?
Информация о древней микробиоте представляет собой жизненно важный ресурс для изучения эволюции бактерий и изучения биологического распространения хронических заболеваний на протяжении всей истории че
Микробиом кишечника также присутствует в жизни плода.
Исследование, опубликованное в Журнал клинических исследований показывает, что и у мышей, и у людей кишечник плода имеет свой микробиом, который, вероятно, происходит прямо из материнского организма
Некоторые виды бактерий могут увеличить риск заражения ВИЧ у женщин,
находит новое исследование Недавнее исследование, опубликованное в Ланцетные инфекционные болезни, описывает семь видов вагинальных бактерий, которые могут значительно повысить риск заражения ВИЧ у