PLoS ONE: Электроакупунктура на ST36 опорожнение желудка Улучшает и выручает Сетей интерстициальных клеток Кахалем в желудках Диабетическая Rats

Абстрактный
<р> Истощение интерстициальных клеток Кахалем (МТП) сертифицирована в желудке больных сахарным диабетом , Хотя электроакупунктура (EA) в ST36 является эффективной терапией для регулирования моторики желудка, механизмы EA в ST36 на опорожнение желудка и сетей МУС еще предстоит выяснить. Целью данного исследования было изучение влияния ЕА на опорожнение желудка и об изменениях сетей ICC. Крысы были рандомизированы в контроле, диабетических крыс (DM), диабетических крыс с мнимым EA (DM + SEA), диабетических крыс с низкой частотой EA (DM + LEA) и диабетических крыс с группами EA высокочастотных (DM + HEA). Экспрессия с-комплекта в каждом слое стенки желудка оценивали с помощью вестерн-блоттинга. Распространение МУС был идентифицирован иммунноокрашивания с-набора и Ki67 как апоптоз ICC исследовали TUNEL окрашивания. Результаты были следующими: (1) Опорожнение желудка была сильно задерживается в группе DM, но ускоряется в группе LEA и УВО, особенно в группе LEA. (2) Экспрессия с-комплекта в каждом слое было сокращено, по-видимому, в группе DM, но и повышающей регуляции в группе LEA и УВО. (3) Обильное распространение ICC (с-Kit + /Ki67 +), образуя густые сети с С-Kit + клеток наблюдались в группе LEA и УВО, в то время как апоптотических клеток (с-Kit + /TUNEL +) были едва захвачены в группе LEA и УВО , В совокупности с низкой и высокой частоты EA на ST36 спасти поврежденные сети МУС путем ингибирования апоптоза и повышения пролиферации в желудке крыс, страдающих диабетом, что приводит к улучшению опорожнением желудка
<р> Образец цитирования:. Чэнь У, Сюй JJ Лю S, Хоу XH (2013) Электроакупунктура на ST36 опорожнение желудка Улучшает и выручает сетей интерстициальных клеток Кахалем в желудке крыс, страдающих диабетом. PLoS ONE 8 (12): e83904. DOI: 10.1371 /journal.pone.0083904
<р> Редактор: Иветт Tache, Калифорнийский университет, Лос-Анджелес, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 9 августа 2013 г.; Принято: 8 ноября 2013 года; Опубликовано: 31 декабря 2013
<р> Copyright: © 2013 Чен и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Работа была частично поддержана грантами от Национального фонда естественных наук Китая (№ 30670775, № 81270458). Никакого дополнительного внешнего финансирования не получил для этого исследования. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> Виды желудочно-кишечных расстройств моторики, начиная от функциональной диспепсии до гастропарезу серьезно влияет на качество жизни пациентов с десятилетиями сахарного диабета [1]. Гастропарез, характеризуется замедленным опорожнением желудка, происходит до 30% людей с диабетом 1 типа [2]. Хотя различные терапевтические вмешательства, включая медикаментозное лечение и некоторые немедикаментозного лечения были испробованы, лечебные эффекты для гастропарезу остаются неудовлетворительными.
<Р> Иглоукалывание эмпирически используется для лечения желудочно-кишечных расстройств в восточных странах в течение тысяч лет. Электроакупунктура (EA), который является модификацией традиционной акупунктуры, является более подходящим для клинических и фундаментальных исследований для настройки его воспроизводимости. Zusanli
(ST36) является общим Acupoint часто используется для лечения желудочно-кишечных заболеваний. В последние годы, последствия EA в ST36 на двигательную функцию желудка, были оценены в многочисленных исследованиях. Для животных, ЕА при ST36 значительно увеличилась моторики желудка в сознании крыс и улучшенное замедленное опорожнение желудка у крыс с сахарным диабетом STZ-индуцированный [3], [4]. Кроме того, у людей, EA в ST36 ускоренное опорожнение желудка и облегчение симптомов диспепсии в функциональных больных диспепсией и индивидуумов, страдающих диабетом с гастропарезу [5], [6]. Хотя в этих исследованиях был принят только слабый EA частота, высокая частота EA также сообщалось содействовать пищевода и дистального моторику толстой кишки у животных [7], [8]. Таким образом, эффекты различной частоты EA на моторику желудка и основные механизмы привлечь внимание людей.
<Р> интерстициальных клеток Кахалем (МТП), хорошо зарекомендовавшие себя как кардиостимуляторы, порождающих и распространяющихся медленные волны, приобрели значение в регуляции желудочно-кишечного тракта подвижность в течение нескольких десятилетий [9]. Три подтипа МТП, включая внутримышечные ICC (ICC-IM), ICC мышечной оболочки кишечника (ICC-MY) и подслизистого ICC (ICC-SM) форме неповрежденные сети в стенке желудка [10]. Сети МУС не являются статичными даже в физиологических условиях; Апоптоз и трансдифференцировка приводят к потере ICC, а также ICC может быть восстановлена ​​путем пролиферации, пополнение из стволовых клеток и увеличение выживаемости [11], [12]. Обширные исследования показали, что потеря и повреждение МУС вызвало неупорядоченное моторику желудочно на животных моделях и у пациентов с сахарным диабетом [13] - [15]. В последнее время, дальнейшие исследования сообщили, что EA способствовало увеличение ободочной МУС в медленных крыс каловых и крыс после энтероэнтеростомия [16], [17]. Наше недавнее исследование также показало, что EA в ST36 может восстановить нарушенную ICC в толстой кишке крыс, страдающих диабетом [18]. В то же время, он обеспокоен тем, что ЕА способствует пролиферации и ингибирует апоптоз клеток мозга в гиппокампе [19], [20]. Тем не менее, есть пробел о влиянии EA в ST36 на МКК в диабетической гастропарезу и механизме ли вовлечены пролиферацию и апоптоз ICC
<р> Таким образом, цели этого исследования заключались в следующем:. 1) оценить эффекты различной частоты EA на опорожнение желудка; 2) исследовать влияние ЕА на ST36 в сетях ICC в диабетических крыс; 3) удостоверить, были ли вовлечены апоптоз и пролиферацию МУС.

Материалы и методы исследования

Этика заявление
<р> Крысы получали человеческую заботу, и это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями, содержащимися в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных национальных институтов здравоохранения, со всеми операциями, утвержденных этических принципов от животных по уходу и использованию комитета Тунцзи медицинского колледжа, Хуажонге университета науки и техники. <бр>

Животные
<р> Самцов крыс Sprague-Dawley весил 250-300 г были выбраны в настоящем исследовании. Крысы были получены из эксперимента центра животных Тунцзи медицинского колледжа (Хуажонге университет науки и технологии, Ухань, Китай) и выдерживают при нормальных лабораторных условиях (22 ° C, 12/12 ч цикла свет-темнота) со свободным доступом к пище и стерильную воду. Через неделю адаптивного кормления животных были официально приняты в наших экспериментах.

Диабетическая модель
<р> После голодания в течение ночи, но свободный доступ к воде, модели были созданы с одной внутрибрюшинной инъекции стрептозотоцина в крысы (STZ, 60 мг /кг, то есть 1 мл /100 г массы тела; Алексис биопрепаратов, San Diego, CA, США), свеже растворяют в 20 мМ цитратном буферном растворе (рН 4,5; Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) , Контрольную группу инъецировали с равным объемом буфера цитрата. Все крысы были размещены в том же состоянии, с водной депривации в течение 4 ч, но вволю
кормления. Через одну неделю после инъекции, диабет был подтвержден в разное время путем измерения уровня глюкозы в капле цельной крови, полученной путем прокалывания кончика хвоста судна. Уровень глюкозы в крови ≥16.7 ммоль /л был взят в качестве стандарта для успешной модели. Содержание глюкозы в крови подвергали скринингу пунктуально до инъекции и 1-й, 4-й и 8-й недели после инъекции. Кроме того, потеря веса, полидипсия и полиурия были проведены дополнительные показатели доказательств успешного склонение диабетической крысы.

Экспериментальные протоколы
<р> Крысы были разделены на пять групп (10 крыс в каждой группе), включая контроль , диабетическая группа (DM), диабетических крыс с мнимым группы EA (SEA, только иглоукалывание без электрического тока, 30 мин /сут), диабетических крыс с низкой частотой группы EA (LEA, 10 Гц, 1-3 мА, 30 мин /сут ) и диабетических крыс с высокой частотой группы EA (АЭМ, 100 Гц, 1-3 мА, 30 мин /сут). EA была реализована на Acupoint ST36 с электрическим стимулятором (G6805-2A; Shanghai Huayi Medical приборостроительный завод, Шанхай, Китай) каждый день в течение 8 недель. Электрический ток был создан в соответствии с слегка дрожащими нижних конечностей. Для достижения цели устранения влияния стресса, животные могли свободно двигаться в своем собственном корпусе во время процедуры EA.
<Р> После последовательного вмешательства в течение 8 недель, крысы в ​​каждой группе были испытаны на опорожнение желудка. Затем они были принесены в жертву, и были тщательно получены образцы антрума. Каждый образец был разделен на несколько частей, относительно небольшой хранили при -80 ° C для Вестерн-блоттинга анализа после того, как слои свеже обособленным и кусок был помещен в 2,5% глутаральдегида для электронной микроскопии, а остальные были зафиксированы в фиксаторе Zamboni (в 2 % параформальдегида и 1,5% насыщенного раствора пикриновой кислоты в 0,1 М фосфатном буферном растворе (PBS, рН 7,4) для иммунофлуоресцентного окрашивания.

Измерение опорожнения желудка
<р> опорожнение желудка проводили с помощью модификации, как описано ранее [21]. Пробный завтрак, содержащий фенол красный (0,5 мг /мл) в качестве индикатора и карбоксиметилцеллюлозы (15 мг /мл) постоянно перемешивают и выдерживают при 37 ° С. После того, как пища лишенной в течение ночи, были получены у крыс 2 мл фенола красный прием пищи вводят через зондового иглы. через тридцать минут животных быстро забивали путем смещени шейных позвонков. весь желудок был удален тщательно после перевязки в кардии и привратника, а затем желудок был открыт и его содержимое выливают в пробирку и промывают 40 мл дистиллированной воды. В конце эксперимента, раствор гидроксида натрия (20 мл, 1 М) добавл ли в каждую пробирку, чтобы развить максимальную интенсивность цвета. Оптическую плотность образца считывали при 560 нм с помощью спектрофотометра (Хитачи, U-2900) в том, чтобы отразить количество фенола красного, оставшегося в желудке. Скорость опорожнения желудка была рассчитана по следующей формуле: Опорожнение желудка (%) = 100 × (1 - X /Y), Х представляет собой оптическую плотность фенола красного, собранных из желудка животных, умерщвленных через 30 мин после пробного приема пищи. Y представляет собой поглощение фенолового красного извлекают из желудка контрольного животного убит сразу же после введения пробного завтрака.

вестерн-блоттинга
<р> Свежие образцы желудочного антрума были прижаты к блюду Sylgard и каждый слой тщательно отделяют путем резкого рассечения после удаления слизистой оболочки. С помощью тонких однонаправленным щипцов и микрохирургических ножницами под микроскопом рассекает, были получены слои ICC-SM, ICC-IM и ICC-MY. Все манипуляции были сделаны на льду, чтобы избежать потери белка. А затем образцы ICC-SM, ICC-IM и ICC-MY хранили при -80 ° С.
<Р> свежемороженые образцы измельчали ​​в суспензию клеток и гомогенизируют в RIPA буфере (Upstate, Temecula, CA , США) с ингибитором протеазы (Sigma Chemical Co., Сент-Луис, штат Миссури, США). Смесь центрифугировали при 12000 г в течение 10 мин при 4 ° С, и надосадочную жидкость собирали в виде общего белка. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда. Впоследствии эквивалентами 50 мг экстрагированных белков постепенно разделяют 10% додецилсульфата натрия электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и переносили на PVDF мембрану (Millipore, Bedford, MA, США). Далее следуют блокирующий неспецифического связывания пятна с 5% обезжиренным сухим молоком в Трис-буферном солевом растворе, содержащем 0,1% Tween 20 (TBST) при комнатной температуре в течение 1 ч, эти мембраны инкубировали с первичным антителом к ​​анти-с-кит (1:200, Santa Cruz Biotechnology, Inc) в течение ночи при 4 ° с вместе с кроличьей анти-мыши актина (1:400, Santa Cruz Biotechnology, Inc) служил в качестве внутреннего контроля. После трех промывок TBST, мембраны инкубировали с HRP-сшитый вторичным антителом (HRP-сшитый кролика против козьего и ПХ-сшитый козы к антигенам мыши, 1:5000) в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее следуют с тремя промывками TBST, полосы визуализируют с помощью химической реакции с усиленной хемилюминесценции агентом (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) и блот подвергали авторадиографии. Анализ Денситометрию осуществляется по количеству одного программного обеспечения (Bio-Rad Технический отдел обслуживания, версия 4.6.2).

исследования иммунофлюоресценции
<р> Для целом монтажа препаратов окрашивания, был открыт желудок и промытые несколько раза с PBS. Желудочный Антрум был прижат к блюду Sylgard и растягивается до 150% от их первоначального размера, а затем фиксировали с закрепителем Zamboni в течение 24 ч при комнатной температуре. Фиксированные ткани промывали PBS, а затем слизистая удаляли острым рассечение. ICC-SM размещение на подслизистом поверхности кругового мышечного слоя, ICC-IM смешиваясь среди гладкомышечных клеток и ICC-MY вместе с нервным сплетением мышечной оболочки кишечника были тщательно подготовлены с использованием тонкой остроконечные щипцов и микрохирургические ножницы под рассекает микроскопом.
<р> процедуры иммуногистохимическое обнаружения сетей ICC и распространения были описаны ранее [22]. Ki67, ядерный белок, экспрессируется во всех активных фазах клетки и исчезла в состоянии покоя клетки, был применен для обнаружения пролиферативную ICC [23]. После промывания шесть раз PBS в течение 1 ч, ткани, инкубировали с 5% сыворотки нормальной бычьей в PBS, содержащем 0,3% Тритон Х-100 (PBST) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем инкубировали с первичным антителом с-набора (1:100; Санта Круз, Калифорния, США) и Ki67 (1:100; Abcam, Кембридж, Соединенное Королевство) в течение ночи при температуре 4 ° С. После промывки в PBST в течение 30 мин, иммунореактивность была обнаружена с помощью Alexa Fluor 594-конъюгированные вторичные антитела (осле анти-козий IgG, 1:100) и Alexa Fluor 488-конъюгированные вторичные антитела (анти-осле Rabit IgG, 1:100) при 37 ° с в течение 1 ч, с последующей промывкой в ​​PBS три раза в течение 30 мин, и инкубировали с DAPI (0,1 мг /мл, Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) в течение 30 мин в качестве противовеса пятно ядерного. Ополаскивали в PBS дважды, ткани развернутый на слайд. Конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Nikon, Япония) был использован для изучения immunolabeled тканей. Для того чтобы включить все уровни положительно окрашенных клеток и процессов, оптимальная Z укладка конфокальных изображений была установлена ​​с интервалом 5 мкм.
<Р> Апоптоз ICC были обнаружены с TUNEL маркировки, комплект для обнаружения апоптоза (Roche, Германия). Препараты целом монтажа инкубировали с первичным антителом с-Kit (1:100, Санта Круз, Калифорния, США) в течение ночи при температуре 4 ° С и вторичного антитела (Alexa Fluor 594 осла против IgG козьего, 1:100) при 37 ° C в течение 30 мин. Под увлажненной и темной обстоятельстве, ткани инкубировали с TUNEL реакционного буфера (маркировка раствора: раствор фермента = 9:1) при 37 ° С в течение 1 ч. После того, как три раза промывали в течение 30 мин для удаления неподключенный флуоресцеином дУТФ и инкубировали с DAPI в качестве противовеса пятно ядерного, наблюдались при конфокальной лазерной сканирующей микроскопии образцов.

С помощью электронной микроскопии
<р> После того, как слизистая оболочка удалена, образцы антральном были погружены в Фиксирующий раствор 2,5% глутарового альдегида при температуре 4 ° с в течение 2 ч. Затем их промывали 0,1 М PBS дважды в течение 20 мин, фиксировали в 1% OSO <суб> 4 (рН 7,4) в течение 1 ч, обезвоживают с градуированными спиртом, разъяснен в окись пропилена и заливали в Epon с использованием плоских форм. Ультратонкие срезы были получены с ультрамикротоме (Leica ULTRACUTU, Германия), и окрашивали цитратом свинца в течение 10 мин перед просмотром с помощью просвечивающего электронного микроскопа (Tecnai G 212, ФЕИ, Нидерланды).

Статистический анализ
<р> Для анализа иммунофлюоресценции окрашивания, желудка Антрум от каждого подопытного животного отбирали в том же месте желудка. МТП была признана C-набора иммунореактивности и наличием обильной клеточных процессов. Пролиферирующих и апоптическая МТП были определены с-комплект иммунореактивности и Ki67 /TUNEL окрашенного ядра, охватывающему с C-набора положительный мембранных структур. Десять случайных полей (× 200-кратном увеличении, 0,2607 мм ^{2) в целом монтажа подготовки были взяты для фотографий с-Kit-позитивных клеток, с-Kit + /+ Ki67 и с-Kit + /TUNEL + меченых клеток. Эти фотографии были также использованы для оценки толщины слоев в каждой стопке с помощью DAPI меченых ядер в качестве маркера верхнего и нижнего пределов слоев. Числа с-набора положительных клеток, с-набор /Ki67 и с-кит /TUNEL двойной меченые клетки подсчитывали с изображением-ProPlus 5.0 (Media кибернетика). Все данные выражали в виде среднего значения ± SEM. По крайней мере, десять видения были взяты у каждого животного. Анализ дисперсии (ANOVA) и Т-тест Стьюдента использовали для сравнения различий между различными группами. P значение меньше 0,05 было принято как статистически значимой разницы.}

Результаты

Вес тела и уровень глюкозы в крови
<р> После 8 недель, случайная смерть произошла в группе DM (два крысы) и в группе SEA (одна крыса). Крыс подвергали скринингу на той же исходной массы тела между группами (таблица 1). В конце 1, 4 и 8 недель, масса тела группы DM значительно снизился по сравнению с контролем ( P
= 0,009, 0,000 и 0,000). Там не было никаких существенных различий между SEA и DM группы ( P
> 0,05). Тем не менее, в отличие от группы DM, вес тела был повышен в группе LEA через 8 недель ( P
&л; 0,001) и группа УВО через 4 и 8 недель ( P =
0,003, P
≪. 0,001 отдельно)
<р> Как показано в таблице 2, никаких различий не было отмечено в уровне глюкозы в крови базовый уровень среди групп. Диабетические модели были успешно установлены с высоким уровнем глюкозы в крови в группе DM по сравнению с контролем в конце 1, 4 и 8 недель (все P
< 0,001). Между тем, уровень глюкозы в крови в море, LEA и HEA группы были существенно не изменились по сравнению с группой DM (все P
> 0,05).

Эффекты ЕА на опорожнение желудка

на рис.1 показано влияние ЕА на ST36 на опорожнение желудка у различных групп. Опорожнение желудка группы СД резко задерживается в отличие от контроля ( P
= 0,012). По сравнению с группой DM, SEA не оказало существенного влияния на опорожнение желудка ( P
= 0,338), но LEA и АЭМ заметно ускорили замедленное опорожнение желудка от 43,96 ± 5,02% до 69,72 ± 3,02% и к 59.06 ± 3,70% ( P
&л; 0,001 и P
= 0,013, соответственно). Сравнение между группой LEA и УВО, статистическая значимость была достигнута ( P
= 0,04), представляющий, что действие LEA явно превышала АЭМ.

Эффекты ЕА на экспрессию C -kit
<р> из рис.2, оценивали экспрессию с-набора в каждом слое стенки желудка. В ICC-IM, C-набора в группе DM, очевидно, уменьшилась по сравнению с контролем (0,47 ± 0,04 против 0,69 ± 0,05, <ЕМ> P
= 0,001). С другой стороны, LEA и УВО значительно усиливал экспрессию с-набора по сравнению с группой DM (0,65 ± 0,04 против 0,47 ± 0,04, P
= 0,004; 0,66 ± 0,03 против 0,47 ± 0,04, P
= 0,002, соответственно). В ICC-MY, экспрессия с-набора была значительно уменьшена в группе DM, в отличие от контроля (0,57 ± 0,04 против 0,83 ± 0,05, P
&л; 0,001). Но существенная разница была достигнута как в группе LEA и УВО по сравнению с группой DM (0,78 ± 0,05 против 0,57 ± 0,04, P
= 0,002; 0,76 ± 0,04 &Amp; 0,57 ± 0,04, P <бр> = 0,004, соответственно). В ICC-SM, с-набор группы ДМ, очевидно, уменьшило на основе нормального уровня (0,56 ± 0,03 против 0,77 ± 0,04, P
= 0,001). Последовательно, LEA и УВО, очевидно, усиливает экспрессию с-набора по сравнению с группой DM ( P
= 0,003 и P
= 0,007). Тем не менее, никаких существенных различий не было обнаружено между SEA и DM группой в ICC-IM, ICC-MY и ICC-SM ( P
= 0,597, P
= 0,853 и P
= 0,172).

эффекты EA в сетях ICC
отображались <р> Чередование сетей МТП особенно МТП морфологии и плотности на рис.3. Там не было никакого существенного различия толщины слоев между группами. Связанный с клетками гладких мышц, C-комплект иммунореактивности для ICC-ИМ наблюдалось в мышечных слоев, показывая, что ICC-ИМ было два полярных процессов формирования сотовой сети, в контрольной группе. В группе DM, длинные процессы ICC-IM была нарушена, по-видимому, и плотность C-набора позитивных клеток была снижена примерно до 50% от нормального контроля ( P
≪ 0,001). По сравнению с группой DM, никаких существенных изменений не было отмечено в группе СЭО. Тем не менее, почти нетронутым сотовая сеть визуализировали в группе LEA и УВО, а плотность C-набора положительного ICC-IM почти восстанавливается до нормального уровня (и P
&ЛТ; 0,001 по сравнению с группой, Д.М. ).
<р> ICC-MY обмотки вокруг сплетении мышечной оболочки кишечника были расположены между продольными и круговыми слоями гладких мышц. Многополярного МТП-МОИ с многочисленными ответвлениями формирования интактной сотовой сети были четко показали, как в контрольной группе. В группе DM, с-Kit + клетки появились с тонкими клеточными телами и трещиноватых процессов, а плотность ICC-MY явно снизился ( P
&л; 0,001). В группе SEA, плотность ICC-MY были существенно не изменяется по сравнению с группой DM ( P
= 0,762). Тем не менее, почти нетронутыми сотовая сеть существовала вокруг сплетении мышечной оболочки кишечника и ICC-МОЕ плотности частично восстановленной в группе LEA и УВО (оба P
< 0,001, по сравнению с группой DM)
<. h3> Влияние EA на апоптоз ICC
<р> апоптоз МТП была обнаружена маркировка TUNEL, чтобы определить, был ли апоптоз участвует в дефиците МТП при диабете (рис.4). Из целых монтажа препаратов контроля, несколько ядер МТП окрашивали методом TUNEL в мышечный слой, слой мышечной оболочки кишечника и подслизистой слоя. Много с-Kit + /TUNEL + ICC-IM, ICC-MY и ICC-СМ наблюдались в группе DM (18,48 ± 1,88 мм ^{-2, 26.51 ± 1.87 мм -2 и 12,03 ± 1,27 мм -2, соответственно). С-Kit + сотовые сети были неполными и апоптическая МТП представлены в виде укороченных процессов с меньшим количеством ветвей. Большое количество с-Kit + /+ TUNEL клетки были также затопить во всем слое группы СЭО. В рамках реализации LEA и УВО, апоптотических Kit + клетки почти не встречались в ICC-IM (1,79 ± 0,33 мм -2 и 2,05 ± 0,30 мм -2), ICC-MY (2,24 ± 0,40 мм -2 и 2,48 ± 0,40 мм -2) и ICC-SM (1,09 ± 0,25 мм -2 и 1,39 ± 0,20 мм -2). Сети сотовой связи, выявленные с-комплект иммунным окрашиванием показали высокую плотность и толщину клеточных процессов в группе LEA и УВО.}

Влияние EA на пролиферацию
ICC

Учитывая увеличение числа ICC в LEA и группа УВО, Ki67-положительных ICC был обнаружен для выявления распространения ICC в трех слоях (рис.5). В контрольной группе, ряд с-набора /наблюдались Ki67 двойной меченые клетки в БЦХ-IM (8,82 ± 1,02 мм ^{-2), ICC-MY (10,64 ± 0,92 мм -2) и ICC -SM (4,67 ± 0,96 мм -2). Число МТП с сломанных ветвей была значительно снижена и сети были очень скудны с несколькими пролиферирующих клеток как в DM и SEA группы. Тем не менее, в группе LEA и УВО, C-Kit /Ki67 двойной меченые клетки в ICC-IM характеризовались тесно прилегающих клеточных тел и относительно биполярных процессов и средней плотности достигло 18,37 ± 1,60 мм -2 и 15,27 ± 1,81 мм -2 (оба P
&л; 0,001). Кроме того, обильные с-Kit + /Ki67 + ICC-MY в группе LEA и УВО (оба P
&л; 0,001) формирование неповрежденные сетей с с-Kit + клетки выполнены круглое тело клетки и длинные процессы тонкие. В ICC-СМ, сопровождающееся неповрежденной сети МУС, плотность пролиферирующих клеток в группе LEA и УВО были относительно выше, в отличие от группы DM ( P
= 0,016 и P <бр> = 0,003).}

Влияние EA на ультраструктурных изменений МТП
<р> Типичные ультраструктурные характеристики ICC были выявлены с помощью просвечивающей электронной микроскопии (рис.6). В контрольной группе, ICC-IM и ICC-мой богатый хорошо развитые клеточные органеллы расширены длинные процессы, содержащие митохондрии и шероховатой и гладкой эндоплазматической сети. Полиморфные ICC-SM расположен в подслизистом поверхности кругового мышечного слоя показал высокую электронно-плотные цитоплазму, многочисленные митохондрии и эндоплазматический ретикулум. В группе DM, к ощутимой уменьшение числа КВК с поврежденными ультраструктурных особенностей исследовали с помощью электронной микроскопии. Эти клетки с набухшей митохондрии, нарушенного cristaed и конденсированного хроматина показала неполное мембрану и сократить процессы. Эти изменения были также замечены в группе СЭО. В группе LEA и УВО, количество МКК было значимо возрастал, и они тесно связаны с нервными волокнами и клетками гладких мышц, образующих синаптические структуры и щелевые контакты. Ясно митохондрии гребень, упорядоченно распределены шероховатой эндоплазматической сети и рибосом частицы считались классическими чертами ICC-IM, IM-MY и ICC-SM.

Обсуждение
<р> В настоящем исследовании мы обнаружили, что и с низкой и высокой частоты ЕА на ST36 подавил апоптозу КВК и активировал пролиферацию МУС в желудке крыс, страдающих диабетом STZ-индуцированный. В результате, спасение сетей ICC было связано с предотвращающей воздействие на замедленным желудочным опорожнением.
<Р> В качестве эффективной процедуры с меньшим количеством побочных эффектов, EA в сочетании с акупунктурой и электрической стимуляции тока вместо ручных манипуляций постепенно принимается Западные страны. ST36 является одним из наиболее часто используемых точек для лечения желудочно-кишечных расстройств, в том числе с указанием: боли в эпигастральной области, тошнота, рвота, плохой аппетит и вздутие живота. В то же время наше предыдущее исследование показало EA в ST36 может увеличить ободочной пропульсивной движение, но не наблюдается в группе с EA в не-акупунктурных. Задержка опорожнения желудка является распространенным характер больных сахарным диабетом с гастропарезу, а также одним из основных факторов, способствующих симптомов гастропарезу. В течение последних десятилетий, эксперименты в сознании крыс показали, что низкая частота EA (10 Гц) значительно ускоряется опорожнение желудка [3], [24], [25]. Кроме того, 100 Гц EA была эффективной, чтобы вызвать высвобождение dinorphin и серотонина, чтобы вызвать обезболивание [26]. Хотя высокая частота EA (100 Гц) Также сообщалось, способствовать дистального пищевода и моторику толстой кишки у животных [7], [8], эффекты 100 Гц EA на моторику желудка у мало исследована. Таким образом, параметры (10 и 100 Гц) ЕА были выбраны в соответствии с предварительными экспериментами, указавших стимулирующее действие желудочно-кишечного. Наши результаты показали, что как низкий Э.А. частоты (10 Гц) и высокочастотная ЭА (100 Гц) в ST36 значительно улучшилось замедленное опорожнение желудка у крыс, страдающих диабетом, и результат также показали, что эффект низкой частоты EA был более резким, чем у высоких частота EA.
<р> Многочисленные исследования показали, что МУС играет важную роль в регуляции перистальтики желудка, основным фактором, определяющим опорожнения желудка [27], [28]. Поскольку существует ICC в различных слоях желудочного антрума в виде сетей В естественных условиях
, которые полноценно рассматривать изменения сетей ICC. Сокращение числа и морфологических изменений ICC-MY и ICC-IM в желудке мышей с диабетом было продемонстрировано в предыдущем исследовании [14]. Кроме того, наблюдалось заметное потеря ICC-IM и ICC-SM в антральном из STZ-индуцированных диабетических крыс, но ICC-MY существенно не влияет на потерю связей с нервных структур [15], за исключением. Эти различия результатов в этих двух исследованиях, вероятно, были связаны с видами животных. Из исследования 28 пациентов с гастропарезу, сокращение числа ICC был найден в сплетении мышечной оболочки кишечника путем полной толщины антральных биопсий [29]. Наши результаты показали, что ICC-IM, ICC-MY и ICC-SM в антральном крыс с диабетом STZ-индуцированных были резко сократилось на основе методики вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции окрашивания, а в дальнейшем поврежденную структуру МТП был показан с помощью просвечивающей электронной микроскопии , К счастью, он сообщил, что низкая частота EA улучшает экспрессию МУС в толстой кишке медленных крыс транзита запора [17]. Кроме того, наше предыдущее исследование предположил, что низкой и высокой частоты EA восстанавливает экспрессию МУС в толстой кишке крыс, страдающих диабетом [18]. Тем не менее, в этих исследованиях, они исследуют изменение МУС в целом и воздействие различных частот EA на МУС в желудке не были выяснены. Таким образом, эффекты различной частоты EA на трех подтипов МУС в желудке, включая ICC-IM, ICC-MY и ICC-СМ были в центре внимания данного исследования. Наши результаты показали, что экспрессия МУС в трех слоях были явно спасена низкой и высокой частоты EA, предполагая, что низкие и высокие частоты EA отремонтированы сети ICC-IM, ICC-MY и ICC-SM и в дальнейшем может способствовать восстановленную опорожнение желудка.
<р> Следует отметить, что баланс сетей ICC в основном определяется путем апоптоза и пролиферации ICC [11], [12]. Таким образом, возможный механизм на моторику желудка и воздействие на ICC сетей EA в ST36 были исследованы путем выявления изменений пролиферации и апоптоза ICC. В последнее время апоптотической гибели клеток, как сообщается, непрерывный процесс сетей ICC и уровня апоптоза в здоровой толстой кишки указывает на то, что эти клетки должны постоянно регенерируется для поддержания нетронутыми сетей [12]. Кроме того, результаты взрослых морских свинок показали, что кишечная ишемия и реперфузионного повреждения привели к уменьшению числа ICC путем апоптоза, которые могут внести свой вклад в желудочно-кишечной активности [30]. Кроме того, недавний отчет показал, что EA терапия снижала апоптический процент клеток черной субстанции в паркинсонизмом крыс [31]. Настоящее исследование четко сформулировано, что апоптическая ICC обнаружены методами TUNEL были наводнения в ICC сетях диабетической желудка крысы и предположил, что истощение сетей ICC может также привести к нарушения двигательной функции желудка. Но благодаря вмешательству низких и высоких частот стимуляции EA, TUNEL + ядро ​​было тяжело найти, предполагая апоптоз ICC были снижены до низкого уровня в обычном режиме.
<Р> Пролиферация также еще один главный регулятор для поддержания сетей ICC. Предыдущие результаты показали, что распространение участвовал в восстановлении МУС, как только он был потерян у взрослых животных [32], [33].

• PLoS ONE: самоотчетам в расстройству желудка путешественников на круиз-Based и наземных праздников пакет
• PLoS ONE: Никотин Аттенюирует Активация ткани резидентными макрофагами в желудке мышей через β 2 никотиновых а…