Ploche ONE: protinádorové účinky príslušníkmi Sirtuin inhibítora, Tenovin-6, proti žalúdočnej nádorových buniek cez Death Receptor 5-Up Regulation

abstraktné

Up-regulované Sirtuin 1 (SIRT1), čo je NAD ^{+ -dependentní trieda III Histon Deacetylase, deacetylates p53 a inhibuje jeho transkripčný aktivitu, čo vedie k prežitiu. SIRT1 nadmerná expresia bola označená predvídať zlé prežitie u niektorých malignít vrátane karcinómu žalúdka. Avšak, protinádorový účinok inhibícia SIRT1 stále uniká v karcinómu žalúdka. Tu sme skúmali protinádorové mechanizmy inhibítora Sirtuin, tenovin-6, v siedmich rakovina žalúdka u ľudí bunkových líniách (štyri bunkové línie divokého typu TP53
, dva s mutantný typ TP53
, a jeden s nulovým TP53
). Je zaujímavé, že tenovin-6 indukovanú apoptózu u všetkých bunkových línií, a to nielen tých s divokým typom TP53,
ale tiež mutant typu a verzie null, sprevádzané up-regulácia smrti receptora 5 (Dr5). V KatoIII bunkové línie ( TP53
-null), Dr5 umlčanie značne oslabený tenovin-6-indukovanú apoptózu, čo naznačuje, že kľúčový mechanizmus za svojimi protirakovinových účinkov je založený na aktiváciu signálnej dráhy receptora smrti. Hoci ergastoplazma stres spôsobený Sirtuin inhibítory bola hlásená indukcia Dr5 up-regulácia v iných nádorových bunkových líniách, ale nemohli sme nájsť výrazné aktiváciu jej prepojených molekúl, ako je napríklad ATF6, Perk a kotleta, v rakovinových bunkách žalúdka liečených tenovin- 6. Tenovin-6 v kombinácii s docetaxelom alebo SN-38 pôsobí mierne až stredne synergický cytotoxicitu buniek karcinómu žalúdka. Záverom možno povedať, tenovin-6 má silnú protinádorovú aktivitu proti ľudským buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom Dr5 up-regulácia. Naše výsledky by mali byť užitočné pre budúci klinický vývoj inhibítorov Sirtuin}

Citácia :. Hirai S, S Endo, Saito R, Hirose M, Ueno T, Suzuki H, et al. (2014) protinádorové účinky príslušníkmi Sirtuin inhibítora Tenovin-6, proti žalúdočnej nádorových buniek cez Death Receptor 5 up-regulácia. PLoS ONE 9 (7): e102831. doi: 10,1371 /journal.pone.0102831

Editor: Andrei L. gartel, University of Illinois v Chicagu, Spojené štáty |

Prijaté: 28. októbra 2013; Prijaté: 23. júna 2014; Uverejnené: 17.července 2014

Copyright: © 2014 Hirai et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený granty-v-pomoc od Ministerstva školstva, kultúry, športu, vedy a technológie z Japonska (až H). Žiadny ďalší externé financovanie bol prijatý pre túto štúdiu. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka je jednou z hlavných príčin úmrtí na rakovinu po celom svete [1], [2]. Hoci boli vyvinuté rôzne chemoterapie pre pokročilých rakoviny žalúdka, prognóza je stále je potrebná chudobné a nové protirakovinové lieky na rakovinu žalúdka. Karcinómu žalúdka je biologicky a geneticky heterogénne rakoviny zahrňujúci mnoho genetickej mutácie a epigenetické striedanie [3]. Medzi tieto abnormality TP53
nádorový supresorový gén hrajú dôležitú úlohu pri vzniku nádorov [4], [5]. Približne 30% pacientov s rakovinou žalúdka mať TP53
mutácie [6]. Dokonca aj v nádorových bunkách divokého typu (WT) TP53
, bolo popísané, že funkcia TP53
je potlačená negatívna reguláciu, vrátane ubikvitinace metylácie a deacetyláciou [7], [8]. V tejto súvislosti by bolo sľubná stratégie predpokladať, že inhibícia týchto negatívnych regulátorov má za následok zvýšenie protirakovinových účinkov pri aktivácii p53 v hm TP53
rakoviny. Myšou double minute 2 (MDM2) je hlavný fyziologický antagonista p53 [7]. Máme už bolo skôr oznámené, že inhibítor MDM2, nutlin-3, preukázali silné protinádorové účinky proti rakovinovým bunkám žalúdka cez aktiváciu dráhy p53 [9]

Sirtuin 1 (SIRT1), čo NAD ^{+ -. Závislý histondeacetylasy (HDAC), má celý rad funkcií podieľajúcich sa na chromatínu umlčanie, dlhovekosti a stability genómu. Že sa nachádza v jadre a pôsobí ako senzor bunkovej metabolickej stavu v prežitie a starnutie za genotoxický a oxidačného stresu [10], [11]. Okrem histónov deacetyláciou, tieto funkcie sú čiastočne závislé na deacetyláciou rôznych non-histonové proteíny, ktoré obsahujú transkripčné faktory: p53, Forkhead box (FOXO) proteínov rodiny, faktor kB nukleárnej, c-myc, N-myc, E2F1, a hypoxiou indukovateľných transkripčné faktory (HIF) 1α /2α; chromatín v súvislosti s enzýmami: Histon acetyltransferázy, P300, DNA-dependentnej kinázy podjednotka Ku80 a TIP60; opravy DNA prvky: Ku70, Rad51 a NBS1; a bunkovej signalizáciu faktory: STAT3, β-katenin, a Smad7 [11] - [13]. SIRT1 fyziologicky interaguje s p53 a zoslabuje jeho funkcie prostredníctvom deacetyláciou na svojom C-terminálnom zvyšku Lys382 [12]. Nadmerná expresia SIRT1 bol nájdený v mnohých druhov rakoviny, ako je napríklad žalúdka a hrubého čreva [10], [14], a hlásené fungovať ako promótor nádoru. SIRT2 je jedným z cytoplazmatickej NAD + - závislých histondeacetyláz a deacetylates Histon H3 lyzín 56 (H3K56) a a-tubulínu. Je tiež zdieľa non-histónov substráty FOXO1, FOXO3 a p53 s SIRT1 [11]. Avšak, presné role SIRT2 stále uniká v biológii rakoviny.}

Na základe týchto skutočností sme skúmali, či tenovin-6, malá molekula zlúčenina, ktorá inhibuje SIRT1 a SIRT2 funkcie [15], [16], pôsobiace protinádorové účinky prostredníctvom aktivácie p53 v nádorových bunkách žalúdka. V poslednej dobe bolo popísané, že inhibítory SIRT up-regulované smrteľnú receptora 5 (Dr5), člen rodiny receptorov faktora nekrotizujúceho nádory, v niektorých druhov rakoviny [17], [18]. Ďalej sme študovali zapojenie tohto receptora v protinádorovej aktivity tenovin-6 pre rakovinu žalúdka. Ďalej sme sa zaoberali synergizmu tenovin-6 s bežnými cytotoxickými liekmi pre budúci klinický vývoj rakoviny žalúdka.

materiáloch a metódach

Bunkové línie

Seven žalúdočné karcinóm boli použité línie: štyri bunkové línie s hm TP53
(MKN-45, NUGC-4, STKM-2, SNU-1), dve bunkové línie s mutantný typu (mT) TP53
(NUGC-3, STKM-1), a jedna bunková línia s null TP53
(KatoIII) [19] - [21]. Bunkové línie s hm TP53
(rakovina prsníka MCF-7, HEK293, ľudské embryonálne obličkové bunky) a MRC-5 normálne ľudské fibroblasty boli zahrnuté ako kontrola v tejto štúdii. MKN-45, NUGC-4, KatoIII a MRC-5 bunkové línie boli získané z Riken BRC Cell Bank (Tsukuba, Japonsko). SNU-1 a MCF-7 bunkové línie boli získané od American Type Culture Collection (Rockville, MD). bunkové línie NUGC-3 a HEK293 boli získané z Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japonsko). STKM-1 a STKM-2 bunkové línie boli láskavo poskytol Dr. Shunsuke Yanomami (Yokohama City University, School of Medicine, Japonsko).

Chemikálie

Tenovin-6 bol zakúpený od Cayman Chemical Firma (Ann Arbor, MI). Docetaxel, SN-38, cisplatina, 5-fluorouracil (5-FU), doxorubicín a thapsigargin boli získané od Wako (Osaka, Japonsko). Boli rozpustené v dimetylsulfoxidu (DMSO) na koncentráciu 20 mM a alikvótne boli skladované pri -20 ° C. Zásobné roztoky sa zriedia na požadovanú konečnú koncentráciu s rastovým médiom pred použitím.

Protilátky a Western blot analýza

SDS-elektroforéza polyaclylamidegel a Western blot boli vykonávané ako bolo opísané skôr [22]. Primárne a sekundárne protilátky boli použité nasledovné. Králičie polyklonálne protilátky proti SIRT1 (D739), acetylovaný (Ac) -p53 (Lys382), fosforylovaná (fosfo) -p53 (Ser15), Bcl-2, Ac-α-tubulín (Lys40), death receptor 5 (Dr5), Fas -associated smrť domén (FADD), štiepi poly (ADP) -ribose polymerázy (PARP) (Asp214) a myší monoklonálne protilátky proti p21 ^{WAF /Cip1
(DCS60), histónov H3 (96C10) , p-aktínu (8H10D10), α-tubulínu (DM1A) a C /EBP homológnej proteín (chop) (L63F7) a králičie monoklonálne protilátky proti TRAIL (C92B9), kaspázy-3 (8G10), inositol-vyžadujúce enzýmu (IRE ) 1α (14C10), a fosfo-RNA-dependentnej proteín kinázy ako je endoplazmatické retikulum kináza (PERK) (16F8) boli získané od firmy Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Myšia monoklonálna protilátka proti p53 (BP53-12) bol zakúpený od firmy Cell Science (Canton, MA), anti-SIRT2 (4B11) monoklonálna protilátka bola od firmy Sigma-Aldrich. (St. Louis, MO) a anti-aktivačný transkripčný faktor 6 (ATF6) monoklonálne protilátky (70B1413.1) bol od Enzo Life Science (Farmingdale, NY). Králičie polyklonálne protilátka proti Ac-Histon H3 (Lys18) bol od spoločnosti Merck Millipore (Billerica, MA). A to ako s chrenovou peroxidázou (HRP) konjugovanou anti-myšou IgG ovce a anti-králičie IgG somárov sérum bolo od GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Väzba protilátky bola detekovaná pomocou Prime Western blotting ECL detekčný systém (GE Healthcare), v súlade s protokolom výrobcu. Intenzita signálu bola kvantifikovaná za použitia EZ-capture II chemiluminiscenčného zobrazovací systém (Atto, Tokyo, Japonsko).}

Real-time kvantitatívnej PCR pre analýzu SIRT1 stroje a SIRT2
génovej expresie

RNA vzorky boli odobraté z bunkového lyzátu za použitia High Pure RNA Isolation kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Nemecko), v súlade s pokynmi výrobcu. Po genomická DNA bola odstránená DNázy, cDNA bola pripravená za použitia Veľkokapacitné RNA-to-cDNA kit (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Real-time kvantitatívne PCR bola vykonaná za použitia Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Primery a TaqMan sondy na SIRT1 stroje a SIRT2
boli získané od firmy Applied Biosystems (Test ID: Hs01009005 a Hs00247263, v uvedenom poradí), a tými, pre 18S ribozomálnej RNA (18S rRNA)
navrhnuté a syntetizované Sigma-Aldrich, boli nasledujúce: 5'-AACCCGTTGAACCCCATTCG (dopredný primer), 5'-CGGGCGGTGTGTACAAAGG (reverzný primer), 5'-AACGCAAGCTTATGACCCGCACTTACTGG (sondy). Reakcie boli vykonávané v triplikátech za štandardných podmienok termocyklingu za použitia 30 ng cDNA, 900 nm, 250 nm priméry, sondy a TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems), v súlade s protokolom výrobcu.

RNA extrahovaná z bunky boli analyzované na relatívnych množstvách cieľového génu ( SIRT1,
SIRT2) a referenčný gén (
18S rRNA), kvantitatívne PCR v reálnom čase.

WST-8 životaschopnosť buniek testy

WST-8 kolorimetrické testy boli vykonané za použitia Cell počítanie Kit-8 (Dojin Laboratories, Kumamoto, Japonsko), v súlade s protokolom výrobcu. Bunky boli schovať do 96-jamkových doštičiek v hustote 5 x 10 ^{3 buniek na jamku v 100 ul kultivačného média po dobu 24 hodín, spracuje sa tenovin-6 po dobu 72 hodín, inkubované v prítomnosti WST-8, a potom analyzované s iMark mikrodoštičiek (Bio-Rad, Hercules, CA).}

Analýza apoptózy pomocou prietokovej cytometrie

Bunky boli nasadené na 60mm misiek v hustote 5 x 10 ^{5 na misku. Po inkubácii s tenovin-6 (10 uM) alebo ekvivalentné množstvo DMSO po dobu 72 hodín, bunky boli jemne zdvihnúť Accutase (US Biotechnologies, Parker Ford, PA) sa pri teplote miestnosti po dobu 10 minút. Bunky potom boli raz premyté fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom. Apoptotické bunky boli detekované dvojitým farbením propidium jodidom (PI) a fluorescein isothiokyanátem (FITC) značeného annexinu V za použitia annexinu V-FITC apoptózu Detection Kit (Beckman Coulter, Brea, CA), podľa návodu výrobcu. Analýza prietokovej cytometrie Potom bola vykonaná s prietokom FACS Calibur cytometra (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) a CellQuest softvéru (BD Biosciences).}

cielenie siRNA Dr5

siRNA cielenie Dr5 bol navrhnutý s použitím softvéru siDirect (http://sidirect2.rnai.jp/), ako bola opísaná skôr [22]. siRNA transfekcia bola vykonaná s použitím Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), podľa návodu výrobcu. Kontrolný siRNA bola umelá sekvencia navrhnutý tak, aby čo najmenej homológie s ľudským a myšiach génov. Sense a antisencie vlákna siRNA použité v tejto štúdii boli nasledujúce: Dr5, 5'-CCGUUUGUGCGUACUUUGAGA-3 '(sense), 5'-UCAAAGUACGCACAAACGGAA-3' (antisencie); kontrolné siRNA, 5'-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3 '(sense), 5'-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3' (antisencie).

Pre analýzu účinkov siRNA na rast buniek a životaschopnosť boli bunky schovať s nízkou hustota (1 x 10 ^{3 buniek na jamku) do 96-jamkových doštičiek obsahujúcich 100 ul média RPMI1640 s 10% fetálnym teľacím sérom (Sigma-Aldrich). Životaschopnosť transfekciou buniek stanovený po 72 a 120 hodín po transfekciu WST-8 testu.}

index kombinácie

Na určenie, či tenovin-6 môže zvýšiť protinádorové účinky konvenčných chemoterapeutických činidiel, sme používal kombinačného indexu (CI) a isobologramu vypočítaný CalcuSyn softvér (Cambridge, UK), v súlade s princípom strednej účinok Chou a Talalay [23]. V tejto analýze, CI > 1,3 indikuje antagonizmus; CI = 1 /1-3 /01 mierny antagonizmus; CI = 0,9-1,1 aditívny efekt; CI = 0,8 - 0,9 mierne synergizmus; CI = 0,6-0,8 mierne synergizmus; CI = 0,4 - 0,6 synergizmus; a CI = 0,2-0,4 silný synergizmus.

Štatistická analýza

Všetky experimenty boli vykonané v troch opakovaniach a boli opakovať najmenej trikrát. Všetky údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Významnosť rozdielov bola stanovená pomocou Studentovho t-testu a Dunnettovým testom. p
-hodnoty < 0,05 boli považované za významné

Výsledky

Vyjadrenie SIRT1, SIRT2, a acetylovaný (Ac) -p53 v žalúdočných nádorových bunkových línií
.

Najprv sme skúmali expresných hladín SIRT1, SIRT2 a Ac-p53 v siedmich žalúdočných nádorových bunkových línií. Použili sme HEK293 buniek pre pozitívnu kontrolu SIRT1 /2, a MCF-7 buniek ošetrených doxorubicínom pre pozitívnu kontrolu Ac-p53 [24]. Všetky žalúdočné rakovina bunkové línie s výnimkou NUGC-4 a buniek STKM-1 exprimovaný vo vysokej miere SIRT1 proteínu a hladiny expresie boli nízke SIRT2 vo všetkých bunkových líniách okrem MKN-45 bunkách (obrázok 1A). Hladiny expresie Ac-p53 boli vo všetkých žalúdočných rakovinových bunkových línií s hm TP53
.

veľmi nízka Analyzovali sme génovej expresie SIRT1 stroje a SIRT2
v reálnom čase kvantitatívne PCR. MKN-45 bunky vykazovali SIRT1
génovej expresie, ktorá bola približne 2,5-krát vyššie ako u fibroblastov, ale ďalšie žalúdočné rakovina bunkové línie nie (obrázok 1B). V NUGC-4 buniek, hladiny génovej expresie SIRT1
bola nízka, rovnako ako SIRT1 proteín. MKN-45 bunky vykazovali mierne zvýšený SIRT2
génová expresia, zatiaľ čo ostatné bunkové línie vykazovali pomerne nízkej úrovne expresie.

Tenovin-6 potlačil rast rakovinových buniek žalúdočnej

Aby pre potvrdenie tenovin-6 aktivity, sme študovali, či-6 tenovin vplyv acetylácia Histon H3 a a-tubulínu. Tenovin-6 zvyšuje acetyláciu Histon v troch (MKN-45, NUGC-4, a KatoIII) zo štyroch karcinómu žalúdka testovaných bunkových línií, čo ukazuje inhibíciu SIRT1 deacetyláciou aktivity (obrázok 2A). Ac-α-tubulín sa zvýšil iba v jednej bunkovej línii (MKN-45) liečených tenovin-6, a teda inhibícia deacetyláciou SIRT2 činnosti nemôže byť jednoznačne uvedené v buniek karcinómu žalúdka.

Ďalej sme vyhodnotili potenciál protinádorový účinok tenovin-6 proti buniek karcinómu žalúdka. Každá bunková línia karcinómu žalúdka bola kultivovaná v prítomnosti tenovin-6 (0,2, 1, 5, 10, 20, a 50 uM) počas troch dní. inhibícia rastu závislá od dávky bola pozorovaná u všetkých bunkových línií, a to nielen tie, ktoré s TP53 hm
, ale aj mt a null verzia (Obrázok 2B). Ich _{50 Hodnoty IC pohybovali v rozmedzí od 2,34 do 4,28 uM. Okrem toho, WST-8 test bol vykonávaný v fibroblastov ľudskej bunkovej línii MRC-5 (IC 50: 6,09 uM) pre porovnanie toxicitu tenovin-6 voči žalúdočným nádorových bunkových línií. Životaschopnosť NUGC-4 buniek ošetrených tenovin-6 bola významne nižšia ako u buniek MRC-5, ako je znázornené na obrázku 2C.}

Tenovin-6 indukovanú proapoptotický smrť buniek u buniek karcinómu žalúdka

Ako je znázornené na obrázku 3A a S1, tenovin-6 ošetrenie zvýšilo expresiu p53 a p21 v hm TP53
bunky (MKN45 a NUGC-4). Up-regulácia Ac-p53 bol uvedený v MKN-45 bunkách, ale nie v NUGC-4 buniek. Zvýšená expresia p21 sa pozoroval aj u mt TP53
bunky (NUGC-3). Naproti tomu, bcl-2 výraz sa nezmenil takmer vo všetkých štyroch bunkových línií karcinómu žalúdka. Nárasty Dr5 a expresiu štiepené PARP boli pozorované vo všetkých testovaných bunkových líniách. Hladiny expresie TRAIL, ktoré pôsobia ako ligand v signalizácii spojka smrti, bola mierne zvýšila u všetkých bunkových línií, hoci expresia FADD, významného adaptéra, nebola ovplyvnená tenovin-6.

preskúmať, či tenovin-6 znížil životaschopnosť buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom indukcie apoptotické bunkovej smrti. Rakovinové bunky boli vystavené na neho pri koncentrácii 10 uM, alebo ekvivalentné množstvo kontrolným vehikulom (DMSO) po dobu 72 hodín, a potom farbené FITC-annexin V a PI. Ktoré boli analyzované pomocou prietokovej cytometrie: bunky negatívny pre annexinu V a PI boli považované za non-apoptotické bunky pozitívne na annexinu V iba boli považované za zavčas proapoptotický a bunky pozitívne na annexin V a PI boli považované za neskoré apoptotické alebo nekrotická. Expozícia MKN-45 bunkách na tenovin-6 zvýšila frakcie skoré a neskoré fázy apoptózy od 2,8% do 52,1%, a od 1,8% do 18,5%, v danom poradí (obrázok 3B). Podobné zvýšenie populácie v skorej a neskorej fáze apoptózy boli pozorované v iných bunkových líniách (NUGC-4, NUGC-3, a KatoIII). Tenovin-6 indukovanú apoptózu u všetkých testovaných bunkových línií, bez ohľadu na TP53
stav.

Vplyv Dr5
porazený na tenovin-6-indukovanej apoptózy

Ďalej, aby overil, či Dr5
tlmenie hluku ovplyvnená tenovin-6-indukovanú apoptózu, bunkovú životaschopnosť a proapoptotický rýchlosť boli analyzované pomocou WST-8 testu a prietokovej cytometrie, v tomto poradí, v TP53
-null KatoIII buniek. Inhibícia Dr5 expresie špecifickej siRNA (Obrázok 4A) významne znižuje tenovin-6-indukovanú bunkovú smrť a apoptózu v bunkách KatoIII (obrázok 4B a 4C). Použili sme tri rôzne siRNA v našich predbežných experimentoch, a dostali sme podobné výsledky s akýmikoľvek siRNA.

Sledovali sme aktiváciu ER (ER) stresové dráhy, ktorý je spojený s up-regulácia Dr5, ako bolo predtým hlásených [17]. CHOP je jedným z najviac silného induktora Dr5 a pred apoptózy, a často uvoľňuje v ER stres. Ako je znázornené na obrázku 5A a 5B, keď CHOP bol mierne up-regulovaný pomocou tenovin-6 liečby vo všetkých štyroch žalúdočné rakovinové bunkové línie, zvýšené hladiny boli výrazne nižšie ako u kontrolných buniek ošetrených thapsigargin, čo je selektívny inhibítor sarkoplazmatického /ER Ca ^{2 + - ATPázy a široko používaný ako mobilný ER stresor [25], [26]. Na druhej ruky, IRE1, ktorý je ER stres senzor a nachádza sa pred CHOP, bol mierne up-regulovaný pomocou tenovin-6 spracovanie vo všetkých bunkových líniách, ale nie fosforylovaný zdvihnúť a ATF6. [27], [28]. Zdalo sa, že nepravdepodobné, že tenovin-6 spôsobené ER stres, čo vedie k indukcii Dr5 v našich buniek karcinómu žalúdka.}

protinádorového účinku tenovin-6 v kombinácii s chemoterapeutikami

Nakoniec sme skúmali, či tenovin- 6 podporil protirakovinový účinkov chemoterapeutických činidiel, vrátane docetaxelu, SN-38, cisplatiny a 5-FU, v žalúdočnej nádorových bunkových línií. Štyri bunkové línie s hm TP53
(MKN-45, NUGC-4), mt TP53
(NUGC-3), a null TP53
(KatoIII) boli ošetrené samotnými alebo v kombinácii s dvoma dávkami (2 a 5 um) z tenovin-6 týchto látok. Koncentrácia bola 0,25 nM docetaxel, 1 nM SN-38, 0,5 alebo 1 uM cisplatiny a 0,25 uM 5-FU. Ako je uvedené v tabuľke 1 (a obrázok S2), docetaxel a SN-38 došlo k miernemu až stredne synergický účinok na tenovin-6 spracovanie v troch bunkových líniách, a cisplatiny s tenovin-6 vykazoval mierny synergický účinok v dvoch bunkových línií, zatiaľ čo 5-FU v kombinácii s tenovin-6 vykazovali nižší účinok ako ostatné prostriedky. Skúmali sme výrazov Dr5 po podaní tenovin-6 s chemoterapeutikami. Dr5 up-regulácia tenovin-6 bol obohatený o kombináciu docetaxelu v MKN-45 bunkách (obrázok S3).

Diskusia

Preukázali sme, že tenovin-6 vykazovali silnú protinádorovú aktivitu sprevádzané proapoptotický bunkovú smrť u ľudských buniek karcinómu žalúdka s hm TP53
, rovnako ako tie, ktoré sa mt TP53
. Niektoré špecifické inhibítory sirtuins, ako je sirtinol, suraminu, salermide a thiobarbiturates, boli hlásené pre inhibíciu bunkového rastu u rôznych typov rakoviny [29]. Väčšina výskumných pracovníkov popísal protinádorové účinky Sirtuin inhibítorov v bunkových líniách s hm TP53
[15], [29] - [31], a to pripočítať k aktivácii apoptózy pomocou acetylácie p53. Medzitým niekoľko správ boli publikované v posledných rokoch, ktoré ukazovali na protinádorovej aktivity inhibítorov Sirtuin v bunkových líniách s mt TP53
prostredníctvom p53-nezávislé dráh [17], [18]. Ukázali sme, že Dr5 porazený zmiernila protinádorové účinky tenovin-6 vo TP53
-null rakovinové bunky žalúdočnej. Aktivácia signálnej dráhy receptora smrti prostredníctvom up-regulácia Dr5 hrá kľúčovú úlohu v bunkovej smrti tenovin-6 indukovanej, ako je uvedené v ďalších správach o Sirtuin inhibítorov.

Bolo zistené, že salermide zvýšená expresia Dr5 a indukované apoptózy v ľudských non-small-cell buniek pľúcneho karcinómu nesúci mt TP53
[17]. V tejto správe simultánne umlčanie SIRT1 stroje a SIRT2
rovnako ako salermide up-regulované Dr5, sprevádzaný up-regulácia ER bielkovín súvisiacich so stresom, ako je napríklad ATF4 a CHOP. Tieto výsledky naznačujú, že ER stres bol zapojený do tejto indukcie Dr5. špekulovalo, že sme tenovin-6 tiež viedlo k zvýšeniu expresie Dr5 aktiváciou ER stres sprostredkovaných Perk, IRE1, ATF6 a CHOP. Avšak v rozpore s očakávaním, signál dráha ER stresom aktivovanú tenovin-6 nebol zjavne zistený. Avšak, tam bol jasný dôkaz, že Dr5 bola vyvolaná tenovin-6. Existujú aj iné cesty rezanky sprostredkovanej Dr5 up-regulácia: reaktívnych foriem kyslíka (ROS), na c-Jun NH _{2-terminálny Kinase (JNK) dráhy, p38 mitogénom aktivovanej proteín kinázy, a tak ďalej [ ,,,0],32] - [38]. Avšak, sme nemali skúmať tieto cesty sem, pretože sme neboli schopní určiť aktiváciu CHOP v našej štúdii. Naše výsledky naznačujú, že ďalšie p53- a CHOP-nezávislé cesty zúčastniť tenovin-6 indukovanej Dr5 expresie v nádorových bunkách žalúdka.}

Preukázali sme, že tenovin-6 indukovanú proapoptotický smrť buniek prostredníctvom aktivácie Dr5 dráhy. Avšak, p53 a preháňajú cesty sa zdalo nepravdepodobné, že bude zapojený do tohto indukcie Dr5, a mechanizmus Dr5 up-regulácia zostáva nejasný. Máme v poslednej dobe vyšetrovaný protinádorové účinky tenovin-6 v niekoľkých bunkových líniách rakoviny hrubého čreva, a našiel jeho silnú protinádorovú aktivitu proti väčšine z nich s up-regulácia Dr5 rovnako [39]. Avšak v CaCo2 rakovinových buniek hrubého čreva (mt TP53
), apoptotické bunkovej smrti u tenovin-6 bol menej zrejmý a Dr5 expresie nebola silne up-regulované. CaCo2 buniek boli opísané pre expresiu vysokej úrovne shock proteíny tepla, známych ako supresor Dr5 [40] - [43]. Tento vzťah by sa mal ďalej študoval v budúcnosti. SIRT1 môže deacetylate histónov H4 lyzín 16 (H4K16), ako aj H3K9, H3K14 a H1K26, ktoré sú úzko súvisí s umlčanie génov [11]. Okrem toho, že má veľa zodpovedajúce non-histónov substráty: transkripčné faktory, opravy DNA stroje prvky, jadrové receptory, histónov modifikujúce enzýmy a molekuly bunkovej signalizácie, ako je popísané na inom mieste [11] - [13]. Tieto početné a komplikované združenia SIRT1 činnosti sa zúčastňujú rôznych biologických funkcií, ako je regulácia génovej expresie a oprava poškodenia DNA. Rakovinové bunky majú tendenciu požadovať, aby tieto funkcie SIRT1, aby prežil, rozmnožovať, a opravovať katastrofálne genómovej škody. Nedávne štúdie identifikovali schopnosť tenovin-6 indukovať diferenciáciu a inhibíciu autofagie v rámci svojich protinádorových účinkov v leukemických buniek [44], [45]. To môže závisieť od správania rakovinových buniek, ako tenovin-6 ovplyvňuje neoplastickou aktivitu. Ďalšie štúdie sú potrebné objasniť vzťah medzi tenovin-6-sprostredkovanú smrť dráhy a zložité úlohy SIRT1.

Skúmali sme účinky kombináciou docetaxel, SN-38, cisplatiny a 5-FU s tenovin -6, pretože sa široko používa na liečbu pacientov s pokročilým karcinómom žalúdka [46], [47]. Mierne až stredne synergické účinky docetaxelu a SN-38 s tenovin-6 v rakovinových bunkových líniách žalúdka, bez ohľadu na TP53
stav, sa nenašli.

Hoci liečba zahŕňajúca kombinácie docetaxelu a Sirtuin inhibítory neboli hlásené, kombinácia docetaxelu a ďalšie inhibítory HDAC, ako je trichostatin a a suberoylanilid hydroxamové kyseliny (SAHA) boli hlásené mať synergické účinky spojené s kaspázy aktiváciu alebo tubulínu acetylácia v rôznych nádorových bunkových línií [48] - [50] , V našej štúdii, nie je jasné, v prípade, že tubulín acetylácii tenovin-6 vždy vplyv na protinádorový účinok, pretože tubulín acetalizácie bol zobrazený len na jednej bunkovej línii. SN-38 (aktívna forma irinotekanu) je DNA inhibítor topoizomerázy I, ktoré pôsobia iba vo fáze S a interferuje s replikáciou DNA a delenie buniek [51], [52]. Inhibítory HDAC indukujú acetylácii histónov a uvoľniť štruktúru chromatínu, v rámci ktorého môžu inhibítor topoizomerázy ľahšie pristupovať DNA, čo uľahčuje poškodenie DNA [51], [53]. Okrem toho je pozoruhodné zvýšenie ROS generácia bola hlásená u malých buniek buniek rakoviny pľúc pri súčasnom vystavení SAHA a topotekan (derivát kamptothecinu) [51]. Zvýšená účinnosť liečby kombináciou tenovin-6 a SN-38 by mohli byť spôsobené kooperatívny regulácia odpovede na poškodenie DNA.

Výhodou kombinovanej liečby tenovin-6 a cisplatinou alebo 5-FU bol menší než s ostatnými látkami v buniek karcinómu žalúdka, aj keď niekoľko správ preukázali zvýšenie apoptózy pri kombinovanej liečbe s cisplatinou alebo 5-FU a iné inhibítory HDAC v iných nádorov [54] -. [57]

Čo sa týka vyhodnotenie toxicity tenovin-6, sme použili fibroblastov bunkové línie ako alternatíva netumorogenní buniek predpovedať toxicitu voči normálnym bunkám odkazujúcich na predchádzajúce správy [15], [18]. Bolo ťažké nájsť vhodný normálne ovládanie porovnávacích štúdií, a je preto s konečnou platnosťou potreba na štúdium toxicity tenovin-6 (v kombinácii s liekmi proti rakovine) in vivo
, s použitím živočíšnych xenoimplantátových modelov.

na záver, inhibítor Sirtuin, tenovin-6, vykazovali silný protinádorový účinok proti ľudských buniek karcinómu žalúdka. To bol nezávislý na TP53
stave a bola indukovaná pomocou up-regulácie Dr5. Ďalšie štúdie je potreba objasniť mechanizmus, ktorým tenovin-6 reguluje Dr5 expresie. Tenovin-6 v kombinácii s docetaxelom a SN-38 má malú výhodu pre inhibíciu žalúdočné proliferácie nádorových buniek, ktorá by mohla poskytnúť novú stratégiu pre liečbu pokročilého karcinómu žalúdka.

podporné informácie
obr S1.
Relatívna intenzita expresie proteínov "je znázornené na obrázku 3A. Semikvantifikaci Western blot denzitometria zapojených do normalizácie beta-aktínu úrovne
DOI :. 10.1371 /journal.pone.0102831.s001
(TIF)
Obrázok S2.
cytotoxických účinkov chemoterapeutických liečiv v kombinácii s tenovin-6. Cytotoxických účinkov chemoterapeutických liečiv, vrátane docetaxelu, SN-38, cisplatiny a 5-FU, a ich zvýšenie účinkov tenovin-6 v žalúdku rakovinových buniek buniek karcinómu žalúdka. Bunky boli kultivované po dobu 72 hodín s uvedenými koncentráciami tenovin-6 a chemoterapeutikami. A: Docetaxel (0,25 nM), B: SN-38 (1 nM), C: cisplatina (1 alebo 0,5 uM; NUGC-3 sa nechá reagovať s 0,5 uM cisplatiny), a D: 5-FU (0,25 uM) bola daná v kombinácii s tenovin-6. Štatistická významnosť rozdielov medzi skupinami bola hodnotená s použitím Dunnettova testu. * p Hotel < 0,01; ** p Hotel < 0,05. DOC: docetaxel, CDDP :. CISPLATIN
doi: 10,1371 /journal.pone.0102831.s002
(TIF)
Obrázok S3.
Dr5 výrazy po podaní tenovin-6 s docetaxelom alebo SN-38 vo buniek karcinómu žalúdka (MKN-45 a KatoIII). Docetaxel, SN-38 a tenovin-6 bol podávaný v koncentrácii 0,25 nM, 1 nM a 2 um. Semikvantifikaci Western blotting denzitometria zúčastnené normalizácie na beta-aktínu úrovne. DOC :. Docetaxel
doi: 10,1371 /journal.pone.0102831.s003
(TIF)

• Ploche ONE: Snail-Regulované MIR-375 inhibuje migrácie a invázie na žalúdočné rakovinu buniek Targeting JAK2
• Ploche ONE: modifikovaná Delta-Shaped Gastroduodenostomy v Totally laparoskopických distálneho gastrektómia pre rakoviny žalúdka: Bezpečné a uskutočniteľné Technika