PLoS ONE: Anti-Tumor-Wirkung eines Sirtuin-Inhibitor, Tenovin-6, gegen Magenkrebszellen über Todesrezeptor 5 Up-Verordnung

Abstrakt

hochreguliert Sirtuin 1 (SIRT1), eine NAD ^{+ - abhängige Klasse III-Histon-Deacetylase, deacetyliert p53 und hemmt seine Transkriptionsaktivität, was das Überleben der Zelle. SIRT1-Überexpression wurde berichtet, dass schlechte Überleben in einigen malignen Erkrankungen vorherzusagen, einschließlich Magenkrebs. Allerdings bleibt die Antitumorwirkung von SIRT1 Hemmung schwer im Magen-Krebs. Hier haben wir die Anti-Tumor-Mechanismen eines Sirtuin-Inhibitor untersucht, tenovin-6, in sieben menschlichen Magenkrebszelllinien (vier Zelllinien mit dem Wildtyp TP53
, zwei mit Mutanten-Typs TP53
, und eine mit null TP53
). Interessanterweise tenovin-6 Apoptose in allen Zelllinien induziert werden, nicht nur diejenigen, die mit Wildtyp TP53,
aber auch Mutanten-Typs und null Versionen, begleitet von Hochregulation der Todesrezeptor 5 (DR5). In der KatoIII Zelllinie ( TP53
-null), Silencing DR5 tenovin-6-induzierte Apoptose deutlich abgeschwächt, was darauf hindeutet, dass der Schwenkmechanismus hinter seinen antitumorale Wirkungen auf die Aktivierung des Todesrezeptor-Signalweg beruht. Obwohl endoplasmatischen von Sirtuin-Inhibitoren verursachten Retikulum Stress berichtet wurde DR5 Hochregulation in anderen Krebszelllinien zu induzieren, konnten wir nicht deutliche Aktivierung seiner verwandter Moleküle zu finden, wie ATF6, PERK und CHOP, in Zellen Magenkrebs mit tenovin- behandelt 6. Tenovin-6 in Kombination mit Docetaxel oder SN-38 übte eine geringe synergistische Zytotoxizität gegen Magenkrebszellen zu moderieren. Im Ergebnis hat tenovin-6 potente Antitumor-Aktivität gegen menschlichen Magenkrebszellen über DR5 Hochregulierung. Unsere Ergebnisse sollten für die weitere klinische Entwicklung von Sirtuin-Inhibitoren nützlich sein}

Citation. Hirai S, Endo S, Saito R, Hirose M, Ueno T, Suzuki H, et al. (2014) Anti-Tumor-Wirkung von einem Sirtuin-Inhibitor, Tenovin-6, gegen Magenkrebszellen über Todesrezeptor 5 Up-Verordnung. PLoS ONE 9 (7): e102831. doi: 10.1371 /journal.pone.0102831

Editor: Andrei L. Gartel, University of Illinois in Chicago, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 28. Oktober 2013; Akzeptiert: 23. Juni 2014; Veröffentlicht am: 17. Juli 2014

Copyright: © 2014 Hirai et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit von Grants-in-Aid wurde aus dem Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie von Japan (IH) unterstützt. Keine zusätzliche externe Finanzierung wurde für diese Studie aufgenommen. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist eine der wichtigsten Ursachen von Krebs Tod auf der ganzen Welt [1], [2]. Obwohl verschiedene Chemotherapien für fortgeschrittenem Magenkrebs entwickelt wurden, ist die Prognose immer noch schlecht und neuartige Krebsmedikamente für Magenkrebs sind erforderlich. Magenkrebs ist ein biologisch und genetisch heterogene Krebs zahlreiche genetische Mutationen und epigenetische Abwechslungen beteiligt sind [3]. Unter diesen Anomalien der TP53
Tumor-Suppressor-Gen eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung spielen [4], [5]. Etwa 30% der Patienten mit Magenkrebs haben TP53
Mutation [6]. Auch in Krebszellen mit Wildtyp (wt) TP53
, wurde berichtet, dass die Funktion von TP53 und Videos negative Regulation einschließlich Ubiquitinierung, Methylierung, und Deacetylierung unterdrückt wird [7], [8]. In diesem Zusammenhang wäre es eine vielversprechende Strategie sein, dass die Hemmung dieser negativen Regula Ergebnisse in Verstärkung der Antitumor-Wirkung durch Aktivierung von p53 in wt anzunehmen TP53
Krebs. Murine double minute 2 (MDM2) ist ein wichtiger physiologischer Antagonist von p53 [7]. Wir bereits berichtet, dass ein MDM2 Inhibitor, Nutlin-3, potente Antitumor-Wirkung gegen Magenkrebszellen durch die Aktivierung des p53-Signalweg nachgewiesen [9]

Sirtuin 1 (SIRT1), eine NAD ^{+ -. Abhängig Histon-Deacetylase (HDAC), verfügt über eine Vielzahl von Funktionen in Chromatin Silencing beteiligt, Langlebigkeit und Stabilität des Genoms. Es wird in den Zellkern und wirkt als Sensor der Zellstoffwechsellage in Überleben und Seneszenz unter genotoxischen und oxidativer Stress [10], [11] zu finden. Neben Histondeacetylierung hängen diese Funktionen teilweise auf der Deacetylierung von verschiedenen Nicht-Histon-Proteine, die Transkriptionsfaktoren sind: p53, forkhead Kasten (FOXO) -Familie Proteine, nuclear factor &kgr; B, c-myc, N-MYC, E2F1 und Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktoren (HIF) 1α /2α; Chromatin-verwandte Enzyme: Histon-Acetyltransferase, p300, DNA-abhängige Kinase-Untereinheit Ku80 und TIP60; DNA-Reparatur-Elemente: Ku70, RAD51 und NBS1; und Zell-Signalfaktoren: STAT3, β-Catenin und Smad7 [11] - [13]. SIRT1 interagiert mit physiologisch p53 und dämpft Funktionen durch Deacetylierung an seinem C-terminalen Rest Lys382 [12]. Überexpression von SIRT1 wurde in vielen Krebsarten, wie Magen und Dickdarm [10], [14], und berichtet, um als Tumor-Promotor gefunden. SIRT2 ist einer der cytoplasmatischen NAD + - abhängigen Histon-Deacetylasen und deacetyliert Histon H3 Lysin 56 (H3K56) und α-Tubulin. Er teilt auch Nicht-Histon-Substrate von FOXO1, FOXO3 und p53 mit SIRT1 [11]. Allerdings bleibt die genaue Rolle von SIRT2 schwer in der Krebsbiologie.}

Vor diesem Hintergrund untersuchten wir, ob tenovin-6, ein kleinmolekularer Verbindung, die SIRT1 und SIRT2 Funktionen hemmt [15], [16], ausgeübt Anti-Tumor-Wirkung durch die Aktivierung des p53-Signalweg in Magenkrebszellen. Vor kurzem wurde berichtet, dass SIRT-Inhibitoren die Todesrezeptors 5 (DR5), ein Mitglied der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Familie, in einigen Krebsarten hochreguliert [17], [18]. Wir untersuchten zusätzlich die Beteiligung dieses Rezeptors in der Antitumor-Aktivität von tenovin-6 für Magenkrebs. Darüber hinaus haben wir die Synergie von tenovin-6 mit herkömmlichen Zytostatika für die Zukunft der klinischen Entwicklung bei Magenkrebs untersucht.

Materialien und Methoden

Zelllinien

Sieben Magenkrebs Linien wurden verwendet: vier Zellinien mit wt TP53
(MKN-45, NUGC-4, STKM-2, SNU-1), zwei Zelllinien mit Mutanttyp (MT) TP53
(NUGC-3, STKM-1), und eine Zelllinie mit null TP53
(KatoIII) [19] - [21]. Zellinien, die mit wt TP53
(MCF-7 Brustkrebs, HEK293 menschliche embryonale Nierenzellen) und MRC-5 normale humane Fibroblasten wurden als Kontrollen in die Studie einbezogen. MKN-45, NUGC-4, KatoIII und MRC-5-Zelllinien wurden von RIKEN BRC Cell Bank (Tsukuba, Japan) erhalten. SNU-1 und MCF-7-Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erworben. NUGC-3 und HEK293-Zelllinien wurden von Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan) erhalten. STKM-1 und STKM-2-Zelllinien wurden von Dr. Shunsuke Yanoma (Yokohama City University, School of Medicine, Japan) zur Verfügung gestellt.

Chemikalien

Tenovin-6 wurde von Cayman Chemical gekauft Company (Ann Arbor, MI). Docetaxel, SN-38, Cisplatin, 5-Fluorouracil (5-FU), Doxorubicin und Thapsigargin wurden von Wako (Osaka, Japan) erhalten. Sie wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) bei einer Konzentration von 20 mM gelöst und Aliquots wurden bei -20 ° C gelagert. Stammlösungen wurden auf die gewünschten Endkonzentrationen mit Wachstumsmedium verdünnt, vor Gebrauch.

Antikörper und Western Blot-Analyse

SDS-polyaclylamidegel Elektrophorese und Western-Blotting wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [22]. Die primären und sekundären Antikörper verwendet wurden, waren wie folgt. Kaninchen polyklonalen Antikörper gegen SIRT1 (D739), acetyliert (Ac) -p53 (Lys382), phosphoryliert (Phospho) -p53 (Ser15), Bcl-2, Ac-α-Tubulin (Lys40), Todesrezeptor 5 (DR5), Fas -assoziierten Todesdomäne (FADD), gespalten Poly (ADP) -Ribose Polymerase (PARP) (Asp214) und monoklonalen Maus-Antikörper gegen p21 ^{Waf /Cip1
(DCS60), Histon H3 (96C10) , β-Aktin (8H10D10), α Tubulin (DM1A) und C /EBP-Homolog Protein (CHOP) (L63F7) und Kaninchen monoklonale Antikörper gegen TRAIL (C92B9), Caspase-3 (8G10), Inosit erfordernden Enzym (IRE ) 1α (14C10) und phospho-RNA-abhängige Proteinkinase-like kinase endoplasmatischen Reticulum (PERK) (16F8) wurden von Cell Signaling Technology (Danvers, MA) erhalten. Maus monoklonaler Antikörper gegen p53 (BP53-12) wurde von Cell Science (Canton, MA), Anti-SIRT2 (4B11) monoklonaler Antikörper von Sigma-Aldrich war gekauft. (St. Louis, MO), und anti-aktivierenden Transkriptionsfaktor 6 (ATF6) monoklonalen Antikörper (70B1413.1) wurde von Enzo Life Science (Farmingdale, NY). Kaninchen-polyklonalen Antikörpers gegen Ac-Histon H3 (Lys18) stammte von Merck Millipore (Billerica, MA). Sowohl Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugiertem Anti-Maus-IgG und Schaf-anti-Kaninchen-IgG Esel Seren stammten von GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Die Antikörperbindung erkannt wurde eine ECL-Prime Western Blotting Detection System (GE Healthcare) verwendet, in Übereinstimmung mit dem Protokoll des Herstellers. Das Intensitätssignal wurde mit Ez-Capture-II Chemilumineszenz-Bildgebungssystem (Atto, Tokyo, Japan) quantifiziert.}

Real-time quantitative PCR für die Analyse von SIRT1
und SIRT2

Genexpression

RNA-Proben wurden aus Zelllysat extrahiert, um eine High Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nachdem die genomische DNA durch DNase entfernt wurde, wurde cDNA unter Verwendung einer High Capacity RNA-to-cDNA-Kits (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) hergestellt. Real-time quantitative PCR wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems 7500 durchgeführt Fast Real-Time PCR-System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Grundierungen und TaqMan-Sonde für SIRT1
und SIRT2
von Applied Biosystems (Assay-ID: Hs01009005 und Hs00247263 bezeichnet) erhalten wurden, und die für 18S ribosomale RNA (18S rRNA)
entwickelt und synthetisiert von Sigma-Aldrich waren wie folgt: 5'-AACCCGTTGAACCCCATTCG (vorwärts-Primer), 5'-CGGGCGGTGTGTACAAAGG (Reverse-Primer), 5'-AACGCAAGCTTATGACCCGCACTTACTGG (Sonde). Die Reaktionen wurden in dreifacher Ausfertigung unter Standard Thermozyklisierung Bedingungen unter Verwendung von 30 ng cDNA, 900 nM Primer, 250 nM Sonden und eine TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems), in Übereinstimmung mit dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.

RNAs extrahiert von Zellen wurden die relativen Mengen des Zielgens ( SIRT1, SIRT2
) und dem Referenz-Gen ( 18S rRNA
) durch quantitative Echtzeit-PCR.

analysiert WST-8-Zellen-Lebensfähigkeitstests

WST-8 kolorimetrische Tests wurden durchgeführt unter Verwendung eines Zellzählung Kit-8 (Dojin Laboratories, Kumamoto, Japan), in Übereinstimmung mit dem Protokoll des Herstellers. bei einer Dichte von 10 5 × in 96-well Platten ausgesät ^{3 Zellen pro Vertiefung mit 100 &mgr; l Kulturmedium wurden die Zellen für 24 h, versetzt mit tenovin-6 für 72 h inkubiert, in Gegenwart von WST-8, und dann mit einem IMARK Mikrotiterplatten-Lesegerät (Bio-Rad, Hercules, CA) analysiert.}

Die Analyse der Apoptose mittels Durchflusszytometrie

Die Zellen in 60-mm-Schalen in einer Dichte von 5 × ausgesät 10 ^{5 pro Schale. Nach Inkubation mit tenovin-6 (10 &mgr; M) oder einer äquivalenten Menge DMSO für 72 h wurden die Zellen vorsichtig mit Accutase (US Biotechnologies, Parker Ford, PA) bei Raumtemperatur für 10 min angehoben. Die Zellen wurden dann einmal gewaschen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. Apoptotische Zellen wurden durch Doppelfärbung mit Propidiumiodid (PI) detektiert und Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) -markiertem Annexin V mit einem Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Beckman Coulter, Brea, CA), in Übereinstimmung mit dem Protokoll des Herstellers. Die durchflusszytometrische Analyse wurde dann mit einem FACS Calibur Strömung braucht Zytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) und Cellquest-Software (BD Biosciences).}

siRNA Targeting DR5

siRNA Targeting DR5 wurde mit entworfen siDirect Software (http://sidirect2.rnai.jp/), wie früher berichtet [22]. siRNA-Transfektion wurde unter Verwendung von Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers. Kontroll-siRNA war eine künstliche Sequenz entwickelt, um die am wenigsten Homologie zu humanen und murinen Gene zu haben. Die Sense- und Antisense-Stränge von siRNA in dieser Studie verwendet wurden, waren wie folgt: DR5, 5'-CCGUUUGUGCGUACUUUGAGA-3 '(sense), 5'-UCAAAGUACGCACAAACGGAA-3' (antisense); Kontroll-siRNA, 5'-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3 '(sense), 5'-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3' (Antisense).

Für die Analyse der Wirkung von siRNA auf das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit wurden die Zellen bei einer niedrigen plattierten Dichte (1 x 10 ^{3 Zellen pro Vertiefung) in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen 100 &mgr; l RPMI1640-Medium mit 10% fötalem Kalbsserum (Sigma-Aldrich) enthielt. Die Lebensfähigkeit von transfizierten Zellen wurde 72 und 120 Stunden nach der Transfektion von WST-8-Test bewertet.}

Kombinationsindex

Um zu bestimmen, ob tenovin-6, um die Anti-Tumor-Wirkung von herkömmlichen chemotherapeutischen Mitteln zu verbessern, können wir einen Kombinationsindex (CI) verwendet und eine Isobologramms CalcuSyn Software (Cambridge, UK) berechnet, in Übereinstimmung mit der Chou und Talalay Median-Effekt-Prinzip [23]. In dieser Analyse CI > 1,3 zeigt an Antagonismus; CI = 1,1-1,3 moderate Antagonismus; CI = 0,9-1,1 additive Wirkung; CI = 0,8-0,9 leichte synergistische Wirkung; CI = 0,6-0,8 moderate Synergismus; CI = 0,4-0,6 Synergismus; und CI = 0,2-0,4 starken Synergismus.

Die statistische Analyse

Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt und wurden mindestens dreimal wiederholt. Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Die Signifikanz der Unterschiede wurde durch den Student-t-Test und Dunnett-Test bestimmt. p
-Werten < 0,05 wurden als signifikant angesehen

Ergebnisse

• PLoS ONE: Snail-Regulated MiR-375 Hemmt Migration und Invasion von Magenkrebszellen durch JAK2
• PLoS ONE: Eine modifizierte Delta-Shaped Gastro in Totally laparoskopische Distal Gastrektomie für Magenkrebs: Eine sichere und durchführbare Technique