Hlboká sekvenovania karcinómu žalúdka odhaľuje somatické mutácie sú relevantné pre personalizované medicine

hlboko sekvenovania karcinómu žalúdka odhaľuje somatické mutácie sú relevantné pre personalizované medicíny
abstraktné
pozadia
Globálne, rakovina žalúdka je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na nádorové ochorenia , s väčšinou zdravotné záťaž nesená menej ekonomicky rozvinutých krajín.
Methods
Tu sme správu genetickú charakterizáciu 50 vzoriek adenokarcinóme žalúdka za použitia Affymetrix SNP poľa a Illumina mRNA polia, ako aj Illumina sekvenovania od kódujúcich oblastí 384 génov, ktoré patria do rôznych dráh známe, že sa zmení v ďalších typov rakoviny.
Výsledky
Genetické zmeny boli pozorované v WNT, ježko, bunkového cyklu, poškodenie DNA a epiteliálne-to-mezenchýme-prechod dráh závery.
údaje poukazujú na cielenú terapiou schválené alebo v klinickom vývoji pre karcinómu žalúdka by byť prínosom pre ~ 22% pacientov študovaný. Okrem toho, že nové mutácie tu zistené, je pravdepodobné, že vplyv na klinickej odpovede a navrhnúť nové ciele pre vývoj nových liekov.
Pozadie
Napriek nedávnemu poklesu miery úmrtnosti na rakovinu žalúdka v Severnej Amerike a vo väčšine severnej a západnej Európy , rakovina žalúdka zostáva jednou z hlavných príčin úmrtí na celom svete a je obyčajný v Japonsku, Kórei, Chile, Kostarike, Ruskej federácie a ďalších krajín bývalého sovietskeho zväzu [1]. Napriek zlepšeniu v liečbe a skríningu, prognóza pacientov s adenokarcinómom žalúdka zostáva chudobný [2]. Pre pochopenie patogenézy a pre vývoj nových terapeutických stratégií, je nevyhnutné, aby rozobrať molekulárne mechanizmy, ktoré regulujú progresie rakoviny žalúdka. Najmä onkogénne mechanizmy, ktoré môžu byť cieľom personalizované medicíne.
Termín "onkogén závislosť" popisovať rakovinové bunky vysoko závislé na danej onkogén alebo onkogénne dráhy bola zavedená Weinstein [3, 4]. Koncepcia podčiarkuje vývoj cielených terapií, ktoré sa snažia inaktiváciu onkogén, rozhodujúce pre prežitie nádorových buniek, zatiaľ čo šetrí normálne bunky, ktoré nie sú podobne závislých.
Niekoľko onkogény aktivovanej pri vysokej frekvencii v iných zhubných nádorov bolo tiež preukázané, že mutovaný u rakoviny žalúdka. Z toho vyplýva, že liečivá, uvádzané na trh cielenie týchto onkogénov sa účinne liečiť podiel žalúdočných karcinómov, buď ako jednotlivými agens alebo v kombinácii. V januári 2010 bol schválený trastuzumab v kombinácii s chemoterapiou na liečbu prvej línie ErbB2
-pozitívne pokročilého a metastatického karcinómu žalúdka. Trastuzumab je prvá zacilující činidlo má byť schválený na liečbu karcinómu žalúdka a zvýšenie 12,8% v rýchlosti reakcie bola pozorovaná po pridaní trastuzumabu k chemoterapii v ErbB2
pozitívny adenokarcinóme žalúdka [5, 6]. Odhaduje sa, že 2-27% z karcinómov žalúdka prístavu erbB2
amplifikácie a môžu byť liečené inhibítory erbB2 [7, 8]. Podobne, zvýšená expresia iného receptor tyrozín kinázy (RTK) EGFR
, bolo uvedené v žalúdku rakoviny a mnohých štúdiách EGFR
inhibítorov v tomto type rakoviny prebiehajú (prehľad viď [9, 10]). Okrem toho niektoré druhy rakoviny žalúdka prístav amplifikácie DNA alebo nadmerná expresia RTK MET
[11, 12] a jeho paralogue MST1R
[13], a môžu byť liečené o THZ
alebo inhibítory MST1R
[14-20 ]. A konečne, FGFR2
Nadmerná expresie a amplifikácia bola pozorovaná u malého počtu karcinómov žalúdka (scirrhous) [21] a inhibítory preukázali určitú účinnosť v klinike [22].
Po prúde od RTK, KRAS
zosilnenie divokého typu a mutácie bola tiež nájdená v asi 9-15% z karcinómov žalúdka [23, 24], a môžu byť účinne liečené inhibítory MEK [25, 26]. Aktivácia mTOR PI3K /Akt /bolo tiež vidieť v 4-16% rakoviny žalúdka [27-30], a tak môžu byť citlivé na inhibítory PI3K [31-34]. Podobne, bunkový cyklus kináza AURKA
bolo preukázané, že je aktivovaný v karcinómu žalúdka [35, 36] a inhibítory AURKA vo fáze klinického vývoja [37] môže mať klinický prínos.
Správy o početnosti rôznych typov onkogénne aktivácia a ich čo-výskyt sú obmedzené. Na rozdiel od gastrointestinonal stromálne tumory (GIST), ktoré sa vyznačujú vysokou frekvenciou KIT stroje a PDGFRA
aktivácia [38] a tým účinne liečiť vo väčšine u imitanib a sunitinib [39, 40], sa objaví adenokarcinóme žalúdka byť molekulárne heterogénne ochorenie bez vysokofrekvenčné onkogénne perturbace doteraz objavené. To je zrejmé z nedávneho prieskumu somatické mutácie v kinázovej kódujúcich génov v 14 žalúdočných nádorových bunkových línií a tromi žalúdočné rakovinové tkanive, ktorá objavené viac ako 300 noviel kinázy jednotlivé varianty nukleotidových a kinázy súvisiace konštrukčné varianty. Avšak, žiadne veľmi často recidivujúce mutácie alebo mutovaná Kinase bola odkrytá [41].
S cieľom objasnenia potenciál pre liečbu karcinómu žalúdka sa cielených terapií buď na trhu, alebo pri vývoji, aby sa objavil, sme vyznačujúci sa klinické vzorky žalúdočné karcinóm k detekcii onkogénu aktivácie.
vzali sme globálny prístup testovaním vzoriek na Affymetrix SNP polí a Illumina expresie mRNA polí. Tieto technológie sú dobre validované pre detekciu genotypu, DNA variácií v počte kópií a expresia mRNA profil. Sú prístupní heterogénnych klinických vzoriek. Vzorky boli tiež vypočúval druhej generácie (Illumina) sekvenovania. Relatívne nové druhej generácie sekvenovania nové technológie schopné ponúknuť aj vyššiu priepustnosť a hlboké sekvenčné kapacitu. Tá je obzvlášť dôležité pre charakterizáciu vzoriek rakoviny, ktoré majú sklon k zahŕňajú zmes bunkových typov vrátane infiltrujúcich normálne bunky, cievne a nádorové bunky rôznych genotypov. V tejto štúdii sme použili cieľovej obohatenie a radenie technológiu Illumina k sekvencii kódujúce regióny 384 génov. Rozhodli sme sa uprednostňujú hĺbky pokrytia cez širšie pokrytie s cieľom zachytiť prítomnosť mutácií v subpopuláciách v nádoroch. Nedávne štúdie ukázali, nádory majú tendenciu skrývať mnoho mutácií v menšom počte signálnych dráh [42, 43], a preto sme sa zamerali na gény v týchto dráh. Tiež sme zaradili génov kódujúcich proteíny už skôr preukázali, že ovplyvňujú odpoveď na cielenej liečby a zvyšuje sa pravdepodobnosť, že budú úspešne terčom malé molekuly intervencie, ako je naším cieľom nájsť účinnejšie a nové spôsoby liečby rakoviny žalúdka.
Metódy
vzorky tkaniva
DNA a RNA vzorky boli získané z nemocníc v Rusku a Vietname podľa IRB schválené protokoly a IRB schválený súhlasu formulárov pre molekulárnu a genetickej analýzy. Tieto zdravotné strediská sami majú tiež vnútorné etické výbory prehodnotenému protokolu a koeficientov stavu infraštruktúry. Vzorky boli získavané prostredníctvom Tkanivové riešenie Ltd http: //www. HODVÁBNY riešenie com /.. Pre výberové charakteristiky pozri ďalší súbor 1 Tabuľka S1
poľa
genotypov a počet kópií profily boli vytvorené pre každú vzorku pomocou 1 ug DNA behu na Affymetrix SNP V6 polí pomocou Affymetrix protokoly. Variácií v počte kópií dáta boli analyzované v softvérovom http ArrayStudio: //www. Omicsoft com .. Dáta bola normalizovaná za použitia Affymetrix algoritmu a segmentová pomocou CBS. Profil Prepis bolo vytvorené pre každú vzorku pomocou 1 ug celkovej RNA behu na Illumnia HG-12 RNA expresných polí týchto protokolov Illumina. Dáta boli analyzované v softvérovom http Illumina GenomeStudio: .. //Www Illumina com /softvér /genomestudio_ softvér ilmn .. Ako postup údaje predspracovanie, sada sonda zostala zachovaná len v prípade, že má "darček" (tj dve štandardné odchýlky nad pozadím) volanie aspoň v jednom zo vzoriek. hodnota signálu zvyšných sád sond boli transformované do 2 založené na logaritmickej stupnici a kvantil normalizácia bola vykonaná. DNA kopírovanie a hladiny expresie RNA boli integrované na úrovni génov v rámci softvérového http ArrayStudio: //www. Omicsoft com .. Pathway analýza obohatenie bola vykonaná v rámci GeneGO analýza metacore vlastné http: //www. Genego com /.. Všetky dáta poľa z tejto štúdie je k dispozícii v GEO http: //www NCBI NLM NIH gov /GEO /pod číslom série pristúpení GSE29999
Cielená hlboké sekvenovania DNA
5 ..... ug DNA bolo PCR-obohatené pre kódujúcich exónov akéhokoľvek známeho transkriptov 384 génov (ďalší súbor 2 tabuľka S2) s použitím platformy http Raindance: ... //www raindancetechnol nológií com /
výslednej cieľovej knižnice boli sekvenované s použitím Illumnia Gaii pri čítaní dĺžke 54 nt. Sekvencia číta boli mapované do referenčného genómu (hg18) pomocou programu BWA [44]. Základne mimo cieľových regiónoch boli pri zhrnutí štatistík pokrytia a variantné hovory ignorované. SAMtools bol použitý na analýzu na vyrovnanie a aby genotyp volania [45], a každý hovor, ktorý sa odchyľuje od referenčnej stav bol považovaný za potenciálny varianty. Balíček SAMtools vytvára kvalitné konsenzus a kvalitné variant odhady pre charakterizovanie genotypu hovory. Presnosť genotypov hovorov bola odhadnutá číslom genotypovej volanie z Affymetrix 6.0 SNP čipu. Konkordancia matice vzoriek založených na oboch SNP a sekvenčných dát boli vytvorené pre kontrolu vzorky zlého označenia (ďalší súbor 3 postavou S1). Zhoda a množstvo genotypov hovory boli do tabuľky prahy kvality konsenzu, kvality variante a hĺbku. Konečný súbor variantných hovory boli identifikované pomocou kvalitu konsenzu väčší alebo rovnajúcu sa 50 a kvality variantu väčšie ako 0. Ak chcete výlučne identifikáciu somatické zmeny, iba mutácie prítomné vo vzorke rakoviny a nebola detekovaná v žiadnom z normálnych vzoriek boli zachované. Ako ďalší filter pre zárodočnej línie varianty, všetky varianty prítomné v dbSNP a 1000 genómu polymorfizmus dátovej sady boli odstránené.
Q-PCR
Q-PCR bolo vykonané za použitia štandardného protokolu Fluidigm 48 * 48 dynamické pole. Po prvé, validácia bol vykonávaný pokus za použitia zmesových ovládacieho RNA z troch vzoriek. Štyri vstupné RNA sumy boli testované (125 ng, 250 ng, 375 ng a 500 ng). Trojmo dátové body boli získané pre následne 10-point riedením za každé z podmienok v jednom teste. Najlepšie celkové výsledky boli pri 250 alebo 500 ng, čo prinieslo hodnoty účinnosti ~ 85%. Preto 250 ng vstup čiastka za experimentálnych vzoriek. Dáta bola vyrobená v troch vyhotoveniach a znamenajú dohromady. Hodnoty Ct boli prevedené na hojnosti s použitím štandardného vzorca hojnosť = 10 (40-CT /3,5). Test Data bola normalizovaná gazdiná za použitia analýzy kovariancie spôsobom, pričom oba gazdiná (GAPDH a beta-aktínu) boli použité na výpočet robustného skóre a skóre bol použitý ako kovariancie pre nastavenie ďalších génov. Analýza dát bola vykonaná v softvéri Arraystudio.
Sangerovo sekvenovania
genómovej DNA PCR priméry boli objednané od IDT (Integrated DNA Technologies Inc, Coralville, Iowa). PCR reakcie boli vykonané za použitia Invitrogen Platnium polymerázy (Invitrogen, Carlsbad, CA). 50 ng genómovej DNA bola amplifikovaná 35 cyklov pri 94 ° C počas 30 sekúnd, 58 ° C počas 30 sekúnd a 68 ° C počas 45 sekúnd. PCR produkty boli čistené s použitím Agencourt AmPure (Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA). Priame sekvenovanie purifikovaných PCR produktov s sekvenačnej primerov boli vykonané s AB v3.1 BigDye-terminátor sekvenovania cyklu kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) a sekvenčné reakcie boli purifikované s použitím Agencourt CleanSeq (Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA). Tieto sekvenčné reakcie boli analyzované pomocou Genetic Analyzer 3730XL (Applied Biosystems, Foster City, CA). Všetky dáta výsledky sekvencie boli zostavené a analyzované pomocou kodóne kódu Aligner (CodonCode Corporation, Dedham, MA).
Výsledky
DNA a amplifikácia RNA vzory cez vzorky sú v súlade s predchádzajúcou štúdie
V súlade s väčšinou ostatných ľudských nádorov, počtu kópií zmenám došlo po celej genómy 50 vzoriek karcinómu žalúdka v porovnaní so zodpovedajúcimi normálnymi vzorkami (obrázok 1). Veľké oblasti častého amplifikácie boli nájdené na chromozomálne regiónoch 8Q, 13q, 20Q a 20p. Známe onkogény MYC stroje a CCNE1
sú umiestnené v 8Q a 20P amplikónov, v uvedenom poradí a pravdepodobne prispeje k rastu výhodu získanú zosilnenie. Tieto amplifikácie boli pozorované v predchádzajúcich štúdiách u karcinómu žalúdka spolu s zosilnenie 20p, pre ktoré ZNF217 stroje a TNFRSF6B
boli navrhnuté ako kandidát vodič gény [46]. Obrázok 1 Pohľad na CNV aberácií naprieč všetkými 50 vzoriek karcinómu žalúdka, pre každú autosome. Os y zodpovedá súčtu počtu kladných alebo záporných zmien na určitý segment s pomerom log2 tých zmien. Oblasti s číslom zvýšená alebo znížená kópie konzistentné po všetkých analyzovaných vzoriek alebo veľmi veľké zmeny v niekoľkých vzorkách ukáže veľké kladné a záporné veľkosti zmeny. Každý bod alebo segment na obrázku sa zafarbí vzorky. Farebný kód je ľubovoľný s každým z karcinómov 50 je priradená farbu. Zosilnené segmenty zahŕňajú chromozómov 8Q, 20Q, 20p, 3Q, 7P a 1Q.
Zhoda medzi počtu kópií génov zisk a RNA expresie medzi vzorkami s nádorovým ochoreniam bola a top 200 gény obsiahnuté v oblasti častého high DNA kópie v vzorky s rakovinou a ktoré mali vysoké hladiny mRNA (v porovnaní so zodpovedajúcimi normálneho tkaniva) sú uvedené v tabuľke na ďalšej súbor 4 tabuľka S3. Väčšina génov na tomto zozname sú od chromozomálnych regiónov 20Q a 8Q, čo naznačuje, že tieto amplifikácie majú najväčší vplyv na hladiny mRNA, v menšine sú gény pre 20 pencí, 3Q, 7P a 1Q. Obrázok 2 ukazuje RNA profily namerané Q-PCR z príkladom génu z každého regiónu, zobrazujúci všeobecné nadmernú expresiu v karcinómu žalúdka, a to najmä v niektorých vzorkách. Okrem MYC stroje a CCNE1
existuje viac génov v týchto oblastiach, ktoré by mohli prispieť k rastu výhode pre rakovinové bunky. Biologické cesty najvýraznejšie obohatené pre zosilnené a nadmerne vystavený génov sa podieľajú na regulácii preklade (p = 0.000015) a opravy poškodenia DNA (p = 0,003). Vzorky s amplifikácie v týchto oblastiach genómu sú komentovaný na obrázku 3. Neexistuje zrejmé tendencie amplifikácie v týchto regiónoch ku spolupráci sa vyskytujú alebo ako byť exkluzívne. V súlade s predchádzajúcou štúdiu [47], v PERLD1
locus bol zosilnený (v rámci ErbB2
amplikónu) na vzorke 08280 a MMP9
bol nadmerne vystavený, nie však znateľne zosilnený. Aj v obrázku sú označené 3 fokálnej DNA amplifikácie sa zhoduje RNA expresiu génov, ktoré môžu ovplyvniť odpoveď na cielenej liečby, napríklad podkladové údaje viď ďalší obrázok 5 Obrázok S2. Obrázok 2 Expresia génov napríklad z každej amplifikovanej chromozomálne oblasť celej štúdie vzoriek potvrdenej Q-PCR. Červené bodky označujú vzorky s rakovinou a biele bodky označujú normálne vzorky. Os y označuje hojnosť mRNA.
Obrázok 3 mutačné profil vzoriek. Vzorky tkaniva sú zobrazené cez hornú a anotácií ktoré sa ich týkajú, sú v stĺpcoch nižšie. Červené boxy označujú DNA amplifikácie a zhodné mRNA nadmerná expresia, oranžová krabice naznačovať RNA zvýšenú expresiu bez známok amplifikácie DNA, červené bodky označujú stratu DNA. Modré boxy označujú somatická mutácia nonsynonymous potvrdený Sangerovo sekvenovanie a fialovej boxy označujú nonsynonymous somatické mutácie, pozorované v dátach Illumina so žiadnym pokusom potvrdiť Sangerovo sekvenovania. Zmeny aminokyseliny sú uvedené v rámčekoch a zmien vedúcich k strate alebo zisku Kodona sú označené červeným textom.
Sekvenovanie údaje vykazuje vysokú zhodu s genotype
Sekvenovanie príprava knižnica zlyhalo pre šesť z pôvodných 50 vzoriek s rakovinou a štrnástich pôvodných spárovaných vzoriek normálne. Z tohto dôvodu boli pridané ďalšie dva párované páry na analýzu, čo má za následok dátovom súbore 44 vzoriek s rakovinou, 36 s párových normálnych párov (ďalší súbor 1 tabuľka S1). Cielené región zahrnuté 3,28 MB cez 6,547 unikátnych exónov v génoch 384 (ďalší súbor 2 tabuľka S2). Stredná pokrytie vo všetkých vzoriek bola 88,3% a klesla na 74%, pri požiadavke na minimálne pokrytie 20. Všetky sekvencovania bolo vykonané na najmenej 110x priemerného pokrytie čítanie cez obohatených oblastiach genómu pre každú vzorku. Číta boli vyrovnané proti ľudským genómom a variantov od referenčnej genóm bol nazývaný. Ako kontrola, analýza pre porovnanie genotypizácia volanie z uvedených radov Affymetrix V6 SNP a sekvenovanie bolo vykonané Illumina. Kraje cielené pre sekvencovanie obsahovala 1005 loci, ktoré sa vzťahuje na poli Affymetrix V6 SNP. Bez filtrácie varianty sekvenčného požaduje meranie kvality, sa stredná dohoda medzi genotypu a výsledkov sekvenace bol 97,8% s radom 65-99% (ďalšie oblasti 6a, obr S3A). Surové Celkovým genotyp volanie zhoda bola 96,8%. Kvalitné metriky boli vybrané s cieľom maximalizovať dohodu medzi genotypu a sekvenčných hovory a zároveň minimalizuje falošne negatívny. Najviac informatívny metrika bola kvalita konsenzus a cut-off ≥ 50 viedlo k strate asi 10% zo zdieľaných genotypov, ale celkovým zvýšením o 2% v zhode s 98,7% (ďalších súborov 6b, obr S3B). Variantné genotypov hovory boli izolované pre ďalšiu analýzu porovnávacie. V tejto sade, ak prahová hodnota kvality variant > 0 zvýšená presnosť variantných genotypov hovorov na 98,9% (ďalších súborov 6c, obr S3C). Keď boli obe prahové hodnoty kvality použil medián vzorky zhodu je 99,5% (doplnkový súbor 6D, obr S3D), ktorý je v rámci regiónu chyby genotypu poľa. Šesť vzoriek (08362T1, 08373T2, 336MHAXA, 08337T1, 89362T2, DV41BNOH) mala zhoda < 98% a dvaja z nich (08393T2 a DV41BNOH) mal zhodu 82% a 88%, resp. Preto s kvalitným konsenzus ≥ 50 a kvalitou varianta > 0, falošná pozitivita bola 0,5% a 1,6% pre referenčné genotypov a variantov genotypov, resp (ďalší súbor 6e obr S3E).
Zo všetkých jednotlivých zmien nukleotidových prechádzajú vyššie uvedené prahy, všetky varianty prítomné v ktoromkoľvek z normálnych vzoriek alebo v polymorfizmu databázach dbSNP (V130) alebo 1000 genómov sa predpokladá, že zárodočné variantov a odloží. Varianty prítomné iba v exónov karcinómov boli považované za somatické a zachovaná. 18,549 somatické varianty boli zistené celkom v rámci všetkých 44 vzoriek (ďalší súbor 7 Tabuľka S4), 3357 bolo odhadované na exonic a nonsynonymous. Uprednostniť mutácií s funkčnou nárazu sa zameriame všetci ďalším analýzam na nonsynonymous mutácií a zvýraznených mutácií vedúcich k strate alebo zisku stop kodónov. Použili sme algoritmus preosiať [48] pre predvídanie zmien aminokyselín, ktoré nie sú tolerované v evolúcii, a tak sú viac pravdepodobné, že vplyv na funkciu proteínu, 1509 somatické mutácie nonsynonymous mať preosiať skóre < 0.05. Miera mutácií prachotesné skóre < 0,05 génu, korigovaná na CDS dĺžka bola vypočítaná (4). Obrázok 4 ukazuje, že gény s najvyššou koncentráciou bodovania mutácií nízka preosiať boli S1PR2
, LPAR2
, SSTR1
, TP53
, GPR78 stroje a RET
, s S1PR2 byť najviac extrémne. Existuje pätnásť mutácie prachotesné skóre < 0,05 naprieč 353A CDS S1PR2
sústredená v deviatich vzoriek. S1PR2
tiež známy ako EDG5
kódy pre G-proteín receptora spriahnutého S1P a aktivuje RhoGEF, larg
[49]. Málo je známe o jeho úlohe v nádorových a somatických mutácií neboli pozorované v 44 tkanivách sekvenovaných pre S1PR2
v kozmickom databáze [50]. Obrázok 4 stĺpcový graf rýchlosti škodlivých mutácií génu naprieč sekvenované. Gény sekvenované sú uvedené na osi x. Počet zhubných somatických mutácií nonsynonymous pozorovaných v každom géne /počet aminokyselín v jednotlivých CDS v vynesená.
Sequencing dát je potvrdená sekvenovaním Sanger
boli vybrané Niektoré nonsynonymous somatické mutácie, ktoré majú byť potvrdené sekvenovaním Sanger. Všetky mutácie uvedené v modrej na obrázku 3 boli potvrdené sekvenovaním Sanger a bol tiež potvrdené, že somatické sekvencovanie divokého typu sekvencie krytej normálne tkanive (pozri ďalší súbor 8 Obrázok S4 napríklad sekvencovania stopy). Hoci 74%, potvrdilo niektoré mutácie detekovanej v sekvenovania Illumnia neboli potvrdené ako somatické mutácie Sanger sekvenovania. Šestnásť z 68 (24%) mutácií, sme sa pokúsili potvrdiť, boli prítomné v normálnych a nádorových vzoriek, to sú zárodočné mutácie, ale nie je v žiadnom z normálnych vzoriek detekovaná Illumina sekvenovanie, a tiež nie je zastúpený v dbSNP alebo 1000 genómov dát. Päť z šestnástich zárodočnej mutácie na boli zo vzoriek s nádorovým ochorením a bez uzavreté normálne tkaniva obsiahnuté v dátovom súbore, ostatné jedenásť prišli zo vzoriek s nádorovým ochorením a uzavreté normálne sekvencie tkaniva obsiahnuté v dátovom súbore. To dokazuje mieru zárodočnej kontaminácie nie je eliminovaný spárovaných bežných kontrol alebo porovnaní so známymi databázami polymorfizmus. Môže sa stať, že pokrytie substitúciou v normálnej tkanive sa stane byť nižšia ako vo vzorke rakoviny, a tak niektoré zárodočnej mutácie zostávajú cez somatických filtre. Dvaja z 68 (3%) mutácií, sme sa pokúsili potvrdiť, neboli prítomné v normálnom alebo rakoviny vzorky Sanger-om a sekvenovaním. Jednou z príčin môže byť falošne pozitívnych v dátach Illumnia v dôsledku artefaktu; Avšak ďalší súbor 6 Obr S3 ukazuje mieru falošne pozitívnych výsledkov za nízku aspoň u tých variantov zastúpených na poliach Affymetrix V6. Ďalšou možnosťou je, že sú prítomné v podmnožine vzorky pod citlivosti metódy Sanger, ale detekuje sekvenovania Illumina. Preto mutácie hlásené v sekvenovania Illumina sú hlásené tiež fialovou farbou na obrázku 3, niektoré je potrebná opatrnosť pri interpretácii týchto výsledkov, pretože môžu byť zárodočné polymorfizmy alebo prítomný iba v podmnožine vzorke nádoru.
Zmeny v RAS /RAF /MEK /ERK
tri vzorky nádorové mal Kras
genetické zmeny (Obrázok 3), čo naznačuje terapeutickú možnosť liečby inhibítory MEK. Jeden z týchto zmien je G12D mutácie. Kras
G12D mutácie bolo preukázané, že začne karcinogenéze a nádoru prežitie [51]. Amplifikácia a nadmerná expresia divokého typu KRAS
bol pozorovaný v ďalších 2 vzoriek. Kras
amplifikácia bola predtým pozorovala u 5% primárnych karcinómov žalúdka. Žalúdočné rakovina bunkové línie s divokým typom KRAS
amplifikácie ukazujú konštitutívneho Kras
aktiváciu a citlivosť na Kras
RNAi smiešne nízke [24]. Bola tiež pozorovaná Román mutácie v géne KRAS
; . (Na vzorke 08393) funkčná dôsledkom je neznáma
PIK3CA
mutácie čo-sa vyskytujúce s KRAS
G12D, je známe, že ovplyvňuje citlivosť na inhibítory MEK [25]; Navyše, nové mutácie pozorované v tejto štúdii môže tiež mať vplyv na rovnakej triedy liečiv. Napríklad: KSR2
funguje ako molekulárne lešenia na podporu EKR signalizáciu [52, 53]. Z tohto dôvodu, mutácie v KSR2
, ako je vidieť na sedem vzoriek môže mať vplyv na citlivosť na inhibítory MEK. Druhým príkladom je ULK1
, čo pozitívne reguluje autofagie downstream mTOR [54] a je zmutovaný v štrnástich vzorkách. Autofagie sa zvyšuje spolu s EKR fosforylácie, keď sú rakovinové bunky žalúdka ošetrí inhibítora proteazómu [55], teda mutácia v ULK1
môžu ovplyvňovať citlivosť na liečbu inhibítory proteasomal, ako je bortezomib v monoterapii alebo v kombinácii s inhibítormi MEK.
Zmeny v PI3K /Akt dráhy
Značne sekvencie narušenie fosfoinositid-3-kinázy (PI3K) dráhy génov v sade vzoriek. Existuje celý rad PI3K /Akt /inhibítorov mTOR v klinickom vývoji a pacientov s aktivačný mutácie v dráhe sú kandidátmi pre liečbu [56]. PIK3CA
mutácie známe onkogenity boli nájdené štyri vzorky. To má za následok frekvenciu PIK3CA
hotspot mutácie 9%, o niečo vyššia ako predchádzajúce odhady 6% (12/185) [27] a 4,3% (4/94) [57]. Spoločné PIK3CA hotspotu mutácie známeho onkogenity (E545K a H1047R) [58] boli dvakrát pozorovaný. Ďalšie mutácie v PIK3CA
K111E, ktorá bola tiež predtým pozorovala u štyroch vzoriek v kozmickom, bol raz a prípadne nové somatické mutácie pozorované boli pozorované v ďalších dvoch vzoriek. Bolo pozorované
päť nonsynonymous AKT1
mutácie. Aj keď AKT1
mutácie sa nachádzajú v približne 2% všetkých rakovín, ktoré sa vyskytujú hlavne na aminokyseliny 15 a funkčné význam mutácií v iných miestach, je známy. Ďalšie nonsynonymous mutácie v Akt2
bol pozorovaný pri vzorke 08407. Akt2
mutácie sú oveľa vzácnejšie ako AKT1
mutácií, hoci
mutácie Akt2 bolo skôr pozorované u karcinómu žalúdka, pri frekvencii 2% [ ,,,0],59]. Nakoniec mutácie Ptení
alebo mTOR
môže ovplyvniť odpoveď na dráhe inhibítory. Niekoľko Ptení
mutácie sú zistené a mTOR
mutácie sú časté.
Zmeny v receptorové tyrozínkinázy
receptor tyrozínkinázy (RTK) a drogy sa zameriava na EGFR
ErbB2 stroje a stretol
boli amplifikovanej každý (log2 > 0,6) a nadmerne exprimovaný na úrovni RNA v jednej vzorke rakoviny. Z toho vyplýva, že nádory môžu byť citlivé na inhibítory amplifikovaných RTK. Okrem toho, niekoľko nonsynonymous mutácie sú pozorované v ich kódujúcich regiónov. Následní mutácie by sa očakávať, že vplyv na reakciu. Napríklad v Met
amplifikovaného vzorky Na orezávanie mutácie v Akt3
môže ovplyvniť citlivosť na inhibítory THP.
FGFR2
je zosilnený a RNA nadmerne vystavený v dvoch vzorkách, sú tu aj niekoľko mutácií v FGFR1
-4. Široký rozsah RTK inhibítory, ktoré sa zameriavajú na FGFR okrem iného kinázy, môže byť účinná u týchto pacientov [60, 61].
Zmeny v proteínov bunkového cyklu
vírusový onkogén homológov SRC
je mutované v štyroch z nádoru vzorky, dvaja z mutácií sa predpokladá, že majú škodlivý účinok, vrátane zavedenia stop kodónu. To môže čeliť-ukazovať inhibítorov SRC. THZ,
zosilnenie je tiež známy marker rezistencie k anti-SRC terapeutiká, ako dasatanib [62, 63]. Bunkový cyklus súvisiace kinázy, AURKA
bol amplifikovaný a zvýšene exprimovaný v jednej vzorke. Inhibítory AURKA sú vo vývoji u solídnych nádorov [37] a môžu byť uvedené v tomto prípade. CCNE1
bol amplifikovaný v dvoch vzoriek (08390 a 08357). Vysoké hladiny CCNE1
bolo preukázané, že sú často spojené s skorým rakovinou žalúdka a metastázy, ale expresných hladín nekorelujú s prežitím [64, 65]. High CCNE1
hladiny boli navrhnuté ako citlivosť marker pre pro-drug enzýmy aktivovanej terapia gény réžia [66]
aktivácia Wnt dráhy je bežné vo vzorkách karcinómu
Mutácie boli pozorované u APC
gén v 22 vzorkách. APC je nádorový supresor známe, že aktivuje CTNNB1 a Wnt signalizácie dráhy, okrem iného účinky [67]. Wnt dráha bola už skôr zistené, že je často aktivovaný v karcinómu žalúdka [68]. Použili sme transkripčný podpis, vytvorený zo skorších štúdií [69, 70] a k dispozícii v databáze Broad Institute MSigDB klasifikovať vzorky študijné ich WNT transkripčných podpisy. Obrázok 5A ukazuje mapu tepla z transkripčných úrovní podpisovým génov Wnt v dátových sad. Aktivácia tejto dráhy je vyššia takmer vo všetkých vzorkách s nádorovým ochorením v porovnaní s normálnymi vzorkami. Wnt inhibítory sú predmetom intenzívneho vyšetrovania vo farmaceutickom a akademického výskumu [71-73]. Tieto výsledky naznačujú, že budú mať indikáciu u karcinómu žalúdka, rovnako ako mnoho ďalších typov rakoviny. Obrázok 5 Transkripční podpisov naprieč vzorkami. Klastru teplotné mapa zobrazujúca expresiu génov Wnt podpisu a B ježko podpisových génov, cez vzoriek v štúdii. Všetky hodnoty sú expresné Zscore normalizované. Zscore < -1 sú modré, Z-skóre > 1 sú červené sfarbenie s odstupňovanou cez biely na 0. mená vzoriek sú na osi x, sú zlučované podľa expresného profilu a vzorky s vysokým skóre podpisu sú na pravej strane. Vzorky sa somatických nonsynonymous APC mutácií (a) alebo mutácií PTCH1 (B) a označené hviezdičkou nad teplotných mapách. WNT podpis gény (zhora nadol): FSTL1, DACT1, CD99, LMNA, SERPINE1, TNFAIP3, GNAI2, ID2, MVP, ACTN4, CAPN1, LUZP1, MTA1, RPS19, PTPRE, AXIN2, NKD2, SFRS6, CCND1, SCAP, CPSF4 , SENP2, DKK1, PRKCSH, SLC1A5, HDGF, CBX3, SCML1, PCNA, RPS11, SNRPA1, TGM2, LY6E, IFITM1, NSMAF, TCF20, BCAP31, AXIN1, AGRN, PLEKHA1, SLC2A1, CTNNB1, EIF5A, IMPDH2, GSK3B, PFN1 , UBE, MAP3K11, ARHGDIA, HNRPUL1, FLOT2, GYPC, NCOA3, CENTB1, SYK, POLR2A, KRT5, DHX36, ELF1, SMG2, FGD6, MAPKAP1, LOC389435, RPL27A, SRP19, RPL39L, SFRS2IP, FUSIP1
; Ježek podpis gény (zhora nadol) :. LRFN4, JAG2, RPL29, Wnt5a, SNAI2, FST, MYCN, BMP4, CCND1, BMI1, CFLAR, PRDM1, GREM1, FOXF1, CCND2, CD44
aktivácia ježko dráha je tiež obyčajný vo vzorkách karcinómu
PTCH1
je nádorový supresor a pôsobí ako receptor pre the hedgehog ligandov a inhibuje funkciu vyhladená. Pri vyhladená uvoľnené, znamená to, intracelulárne čo vedie k aktivácii GLI transkripčných faktorov [74]. Niekoľko somatické mutácie PTCH1
sú zaznamenané v kozmickom v súlade so svojimi nádorového supresor rolu.

• Downregulaci SPARC výrazu znižuje rakoviny žalúdka bunkovú inváziu a prežitie
• BRCAA1 monoklonálna protilátka konjugovaná fluorescenčné magnetických nanočastíc pre in vivo cielené magnetofluorescent zobrazovanie rakoviny žalúdka