Proteome analýza ľudského kardio adenokarcinómu laserom capture microdissection

Proteome analýzu ľudského kardio adenokarcinómu pomocou laserového záchytu mikrodisekcii
abstraktné
pozadia
The výskytu žalúdočné srdcovej adenokarcinóm (GCA) rastie v posledných dvoch desaťročiach v Číne, ale molekulárne zmeny týkajúce sa karcinogenézy neboli dobre známe. Metódy
v tejto štúdii sme použili porovnávacie proteomickou prístup k analýze malígny a nemalígna kardia epiteliálne bunky izolované od navigovať laser zachytávanie mikrodisekcii ( LCM) z párových chirurgických vzoriek ľudskej GCA.
Výsledky
dvadsať sedem bodov zodpovedajúcich 23 proteínov boli dôsledne rozdielne regulované. Pätnásť proteíny boli preukázané, že sú up-regulované, zatiaľ čo osem proteíny bolo preukázané, že je down-regulovaná v malígnych bunkách v porovnaní s nemalígna cylindrických epiteliálnych buniek. Zistené proteíny zdalo byť zapojený do metabolizmu, garde, Antioxidácia-, prenos signálov, apoptózy, bunkovej proliferácie a diferenciácie. Okrem toho, výrazy hsp27, 60, a PRX-2 v GCA vzoriek boli ďalej potvrdené imunohistochemickým a western blot.
Záver
Tieto dáta ukazujú, že kombinácia navigovať LCM s 2-DE poskytuje účinnú stratégiu pre objavovanie proteíny, ktoré sú rozdielne exprimované v GCA. Tieto proteíny môžu prispieť objasneniu molekulárnych mechanizmov GCA rakoviny. Okrem toho kombinácia poskytuje potenciálny klinické biomarkery, ktoré pomáhajú pri včasnom odhalení a poskytnúť potenciálnym terapeutických cieľov.
Pozadie
rôzne analýzy výskytu rakoviny dát vytriedený od západných krajín odhalili rýchlo rastúce sadzby adenokarcinóm pažeráka a kardia v posledných niekoľko desaťročí v porovnaní s stabilné a klesajúcich sadzieb za pažeráka spinocelulárneho karcinómu (SCC) a distálnej adenokarcinómom žalúdka (DGA) [1-3]. Tento jav je zrejmý v Číne, okrem toho, že zvyšujúci sa výskyt kardio adenokarcinómu (GCA) sa objaví podstatne vyššia, než je výskyt rakoviny pažeráka. Dôkazov vyplýva, že GCA je zreteľným klinická entita ako je jej patogenézy a rizikové faktory sú úplne odlišné od DGA. Z tohto dôvodu, GCA je oveľa rozšírenejšie, s vyšším výskytom metastáz do lymfatických uzlín a horšiu prognózu než DGA [4]. Ročná incidencia GCA je 50 /100,000, a môže byť dokonca vyššia ako 190 /100,000 v niekoľkých oblastiach Číny [5]. Relatívne asymptomatická prírode v skorých štádiách ochorenia a nedostatok vhodných skríningových testov majú za následok väčšiny pacientov diagnostikovaných GCA byť v už pokročilom štádiu choroby. Tak, že je nutné pochopiť molekulárnej mechanizmus karcinogenézy a pre identifikáciu biomarkerov pre včasnú diagnózu a účinnú liečbu ľudského GCA.
V poslednej dobe, Proteome sa ukázal ako zložky komplementu genómu. Predpoklad je, že by mohli výrazne pomôcť rozpletení biochemické a fyziologické mechanizmy komplexné viacrozmerné ochorení na funkčné molekulárnej úrovni. Aj keď genetické mutácie a /alebo errant génovej expresie môže byť základom ochorenie, biochemické základy pre väčšinu ochorení je spôsobené defekty proteínov. Preto analýza celosvetového množstva bielkovín v ľudských nádoroch, volal rakovina proteomiky, by mohla ponúknuť veľa príležitostí a výziev v identifikácii nových nádorových markerov a terapeutických cieľov, ako aj v pochopení patogenézy nádoru. V súčasnej dobe, dvojrozmerná gélová elektroforéza (2-DE) a hmotnostnej spektrometrie (MS) sú najčastejšie používaná prostriedky pre separáciu a identifikáciu proteínov. Avšak, heterogenita je vždy problémom v štúdiách ľudskej nádorovom tkanive. Aj keď pre bunkové kultúry je jednou možnosťou, ako prekonať tento problém, nemusí presne reprezentujú molekulárnej udalosti, ku ktorým dochádza v skutočnom tkanive, z ktorej boli odvodené [6]. Porovnanie medzi bunkových línií ľudskej prostaty a nádorových buniek z týchto pacientov ukázali, že 20% z profilov proteínov boli zmenené [7]. Laser zachytenie mikrodisekcii (LCM) je nedávny vývoj, ktorý môže byť použitý na nákup veľmi reprezentatívne subpopulácie buniek z heterogénne komplexných vzoriek tkanív [8]. Táto technológia sa používa veľmi úspešne v rozmanité spektrum štúdie s následnú analýzu na DNA a hladiny RNA, vrátane globálnej génovej expresie profilovanie [9] a analýzy proteomu prostaty [7], hrubého čreva [10], hepatocelulárny [11 ], prsníka [12], a pankreasu [13]. Avšak kombinácia 2-DE a MS nebola nikdy použitá k štúdiu ľudského GCA.
Táto štúdia si kladie za cieľ načrtnúť karcinogenéze GCA a identifikovať GCA-špecifické proteíny choroby spojené s klinickými ako potenciálny biomarkery na skorú detekciu a nové terapeutické ciele. Vykonali sme navigoval LCM obohatiť ako malígnych a nemalígna žalúdočné epitel buniek srdcového z párových chirurgických vzoriek ľudskej GCA. Bielkoviny získané z týchto buniek boli oddelené 2-DE. Diferenciálnej proteínové škvrny boli identifikované mapovaním peptidovej hmoty odtlačku prsta (PMF) na matrix-assisted laserovej desorpcie /ionizácie time-of-flight hmotnostná spektrometria (MALDI-TOF MS) a rešerší. Platnosť týchto zistení bola potvrdená imunohistochemických a western-blot.
Metódy
Materiály
IPG prúžky (pH 3-10 nelineárne) a IPG tlmivé roztoky (pH 3-10 nelineárne) boli získané od Amersham Pharmacia Biotech (APB, Švédsko). DTT, močovina, tiomočovina, Tris báza, TX-100, CHAPS, glycín, akrylamid, metylén, SDS, TEMED, persíran amónny, dusičnan strieborný, Trypsín (sekvenčné čistoty), ACN a TFA boli získané od firmy Sigma (St. Louis, MO, USA). Konečne, kompletný koktail inhibítora proteázy bol od Roche (Lewes, UK). Milli-Q čistej vody bola použitá pre všetky riešenia.
GCA vzorky
deviatimi pármi ľudskej žalúdočnej kardio adenokarcinómu a ich priľahlé nontumourous CARDIA tkaniva boli získané počas 30 minút po chirurgickej resekcii na druhom pridružená nemocnice Xi ' University Jiaotong v roku 2005 (tabuľka 1). Aby sa zabránilo zjavné oblasti vredu alebo nekróza, vzorky boli nadobudnuté od okrajov nádoru. Ktoré boli okamžite zmrazený v kvapalnom dusíku a skladované pri -80 ° C až do použitia. Informovaný súhlas boli získané od všetkých pacientov. Medzitým dvaja skúsení patológovia hodnotila nádoru triedenie podľa mikroskopické vyšetrenie samples.Table 1 klinickej aj histologické údajov o pacientoch nádorových vzoriek na
Case

Age

Gender

Locationa)

Size(cm)

Grade

1
58
M
Within 2 cm ġej
1,5 x 2
Stredne diferencovaný
2
63
M
Počas 2 cm ġej
5 x 6
stredne diferencovaný Sims 3
46
M
Do 2 cm ġej
4 × 5
stredne diferencovaný
4
60
M
Do 2 cm ġej
2 x 2,5
Dobre diferencovaný
5
73
M
Počas 2 cm ġej Sims 3 × 1
Dobre diferencovaný
6
70
M
Vnútri 2 cm ġej
2 × 1
Dobre diferencovaný
7
55
M
Do 2 cm ġej
2 x 3
Zle diferencované
8
51
M
do 2 cm ġej
4 × 6
zle diferencované
9
63
M
do 2 cm z ġej Sims 3 × 2,5
zle diferencované
) Miesto: epicentrum nádorové tkanivá
príprava vzoriek pre LCM
oddielov (8 um hrubé) boli znížené na sklíčka (predčistený za použitia pracieho prostriedku, premyje sa deionizovanou vodou a ponorí do etanolu) za použitia Leica CM 1900 kryostatu (komora teplota -28 ° C). Rezy boli buď skladované pri -80 ° C, alebo aby boli v kryostatu komore pred LCM. Hematoxylin farbenie bolo vykonané iba pre monitorovanie tkanivových rezov a nebol použitý v spojení s LCM. Rezy boli stanovené (70% etanol počas 1 min), hematoxylín zafarbia a dehydrovaná (70% etanol počas 45 s, 95% etanol na 45s, 2 x 100% etanolu po dobu 30, a následne xylénu 2 x 5 min). Medzitým boli použité nefarebnou sekcie pre LCM. Boli stanovené (70% etanol počas 30), premytá v deionizovanej vode na 10 sekúnd, a dehydratácii (70% etanol pre 15 s, 95% etanolu po dobu 15 s, 2 x 100% etanolu po dobu 15 s, a následne xylénu 2 x 1 min ). Kompletné kokteilom inhibítorov proteázy tablety boli
navigoval LCM
Po pripevnení a dehydratácia, nefarebnou rezy sa suší vzduchom a microdissected používanie systému Arcturus PixCellα (Arcturus, Mountain View, CA, USA). LCM mikroskop zobrazený na Hematoxylín postriekané časť priliehajúca k jednej zo záujmu. Tento obrázok bol zobrazený na obrazovke počítača je možné použiť LCM LCM analýzu obrazu softvér (Arcturus, USA) a bol použitý ako mapu, ktorá oddeľuje oblasť pre disekciu na susednom nefarebnou časti. Rezy potom boli zachytené s použitím 15 um priemer laserového lúča typicky na 50-80 mV sily trvajúce pulzu 3-10 ms v režime guľomet a s laserovou napaľovací frekvenciou 1 strely za 500 ms. V priemere, medzi 10,000-12,000 zábery boli nadobudnuté na viečku, a približne 25,000-30,000 bunky boli získané za uzáverom. Každý uzáver bol zachytený počas jednej hodiny. Po dôkladnom preskúmaní histologických sekcií na základe každej preparácie sa odhaduje, že obsahuje ≥ 95% požadovaných buniek.
Mikrodisekcii uzávery boli vložené do 0,5 ml mikrocentrifugačných skúmaviek obsahujúcich 50 ul lyzačného pufra (7 M močovina, 2 M tiomočovina, 4% w /v CHAPS, 65 mM DTT, 0,5% v /VTX-100, 40 mMTris-Base, a kompletné koktail inhibítorov proteázy). Potom boli bunky solubilizovány inverziou rúrok s následným vír miešanie po dobu 1 minúty a krátky pulz-odstredenia pri 12 000 x g ,. Potom, tkaniva z viacerých uzávery (asi 800.000 ~ 1000000 bunky) boli extrahované do rovnakého pufra pre lýzu, kým nebolo zhromaždilo dostatočné množstvo materiálu. Vzorky boli centrifugovány pri 40000 x g počas 1 hodiny pri teplote 4 ° C. Tam, kde je to potrebné, supernatanty boli uložené pri -80 ° C do ďalšieho použitia. Koncentrácia proteínu bola stanovená metódou Bradford.
2-DE
Prvý trojrozmerný izoelektrický sústreďovacie (IEF) bola vykonaná na Pharmacia Immobiline DryStrip IPG systému (Uppsala, Švédsko). Pre prvý rozmer elektroforézy sa vzorky obsahujúce 60 ug proteínu pre analýzu gélov bolo nariedené na 250 ul roztokom rehydratácia (7 M močovina, 2% hmotnosť /objem CHAPS, 50 mM DTT, 0,5% v /v IPG pufri (pH 3-10 nelineárne), a stopové brómfenolovej modrej modrá) pred vložením do 13 cm IPG prúžky (pH3-10 nelineárnych). IEF sa potom vykonáva za použitia IPGphor elektroforézne zariadenie v súlade s pokynmi výrobcu. Potom boli prúžky v rovnovážnom stave s roztokom (6 M močoviny, 30% objem /objem glycerolu, 2% hmotnosť /objem SDS, a 50 mM Tris-HCl, pH 8,8), znižuje s 1% w /v DTT počas 15 minút , a alkyluje 2,5% w /v jodacetamidu po dobu 15 minút. Pásy boli potom opláchnuté v pufri pre elektroforézu (25 mM Tris bázy, 192 mM glycínu a 0,1% hmotnosť /objem SDS), aplikuje sa na 11% akrylamidovém gélu, a utesnené roztaveným Agarose (0,5% hmotnosť /objem Agarose v pufri pre elektroforézu, ktorý obsahuje stopa brómfenolovej modro). SDS-PAGE bola vykonávaná s použitím Hoefer SE 600 vertikálne komory a Tris-glycínovom pufra (25 mM Tris a 192 mM glycín), obsahujúci 0,1% hmotnosť /objem SDS, s počiatočným oddelenia pri konštantnej 10 mA /gél po dobu 30 minút s následným 20 mA /gél. Druhý-dimenzionální SDS-PAGE bol vyvinutý, kým sa nedosiahne Brómfenolová modrá značka spodnej časti gélu. Celková doba priebehu typicky 4 až 4,5 hodiny. Gély boli fixované v 10% v /v kyseline octovej, 40% v /v etanolu pred senzibilizáciou po dobu 30 minút v pufri, ktorý obsahuje 30% v /v etanole, 0,2% hmotnosť /objem tiosíranu sodného a 0,83 M octan sodný. Potom nasledovali tri premývania 15 min v deionizovanej vode. Proteíny boli potom zafarbené 0,1% w /v dusičnanu strieborného po dobu 20 minút, dvakrát premyté deionizovanou vodou po dobu 1 minúty, a vytvoril v 2,5% hmotnosť /objem uhličitanu sodného, ​​obsahujúceho 0,04% v /v formaldehyd (37% roztok). Vývoj bol zastavený 1% v /v kyseline octovej, a gély boli trikrát premyté vodou.
Analýza obrazu a štatistické analýzy
Umax ImageScanner (Amersham Biosciences) bol použitý pre skenovanie gélov, zatiaľ čo hlavný obraz ™ bol použitý software 2D Platinum Version 5.0 (Amersham Biosciences) pre detekciu bodové, kvantifikáciu a párovanie. Intenzita každého miesta boli kvantifikovaná% obj. Dáta boli potom analyzovaná pomocou SPSS 11.5 pre Windows a Excel. Študent je t
-test bol použitý na analýzu rozdielov v úrovni proteínov medzi GCA a nenádorových vzoriek s úrovňou spoľahlivosti 95%.
MALDI-TOF-MS a vyhľadávanie v databáze
konzistentne a významne odlišná škvrny vybrané pre analýzu MALDI-TOF MS. Proteínové škvrny boli vyrezané záujmu a mleté ​​na malé kúsky s následnou odfarbenie a premytím deionizovanou vodou niekoľkokrát, kým žltá farba zmizla. Kusy gélu potom boli opláchnuté 25 mM hydrogénuhličitanu amónneho, dehydruje ACN, a suší sa vo vákuovej odstredivke. Potom, proteíny v géle boli štiepené s 0,02 ug /ul trypsínu cez noc pri teplote 37 ° C. Tryptické peptidy boli potom znova rozpustený v roztoku, ktorý obsahuje 50% v /v ACN a 0,2% v /v TFA. A 2 ul alikvotná časť sa nanesie na vzorku dosku s 4 ul matrice riešenia CHCA (a-kyano-4-hydroxcinnamic kyseliny, 10 mg /ml v 50% v /v ACN, 0,2% v /v TFA) a nechá sa vzduchom suché. Vysušené škvrny sa potom analyzujú na Voyager DE MALDI-TOF MS (Framingham, MA, USA). Toto bolo nasledované spustením spektrometra v pozitívnom iontovom módu a v režime reflektora s nasledujúcimi parametrami: urýchľovací napätie 20 kV; Gride napätie, 94%; vodiaci drôt napätie, 0,01%; a meškanie 200 ns. Spektra bola získaná ručne s intenzitou laserom nastaveným na 3200 s 80 snímok za spektre. Potom sa hmota rozpätie bolo stanovené rozmedzie m /z
500 a m /z
5000. Vnútorné kalibrácia bola aplikovaná pomocou angiotenzínu II a B inzulínu vrcholy reťazca na 912.08 Da a 3495.95 Da, resp.
Proteíny boli identifikované mapovaním peptidovej hmoty pomocou vyhľadávacieho programu Alden [14], sa použijú tieto parametre vyhľadávania: SWISS-PROT a Tremble boli použité ako databáz proteínových sekvencií; hmotnostná tolerancia 100 ppm a jedného neúplného štiepenia bolo povolené; carboxyamidomethylation, oxidované metionín, a fosforylácie boli považované za prípadné úpravy; minimálny počet zhodných peptidov bol 4; a peptid bol ion [M + H] +.
Imunohistochemické a western blot analýzy
Pre potvrdenie expresie vzory troch proteínov v GCA tkanivách, imunohistochemické vyšetrenie bola vykonaná za použitia formalínom fixovaných a parafínu zaliate tkaniva vzorky, ktoré boli zladené so vzorkami 2-DE. Odvoskované 5 um hrubé rezy boli ošetrené 0,3% vodíka s peroxidáze počas 3 min a s blokujúce protilátky po dobu 30 minút. Po získaní antigénu tepelne sprostredkované boli rezy inkubované s primárnou protilátkou pri 4 ° C cez noc takto: hsp27 (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1: 500; HSP60 (Santa Cruz, America), 1: 300; a PRX-2 (Santa Cruz, America), 1: 150. Rezy potom boli inkubované s protilátkou peroxidázou značené (1: 500)., Ktorý bol vyvinutý s diaminobenzine, a kontrastne hematoxylínom
Pre Western blot analýzu boli vzorky proteínu (30 ug), používané v 2-DE boli vykonávané na 12% SDS-PAGE, prenesené na PVDF membrány a potom blokované s PBS /5% odstredené mlieko /0,01% Tween po dobu 2-4 hodín pri teplote miestnosti. Primárna protilátka bola zriedená v blokujúcom pufri a bolo pridané nasledujúce: hsp27, 1: 200; HSP60, 1: 300; a PRX-2, 1: 200. Potom sa vykoná inkubácia s chrenovou peroxidázou (HRP) konjugovanou sekundárnej protilátky a HRP-konjugovaný anti-GAPDH /beta-aktínu protilátky pre potvrdenie rovný zaťaženie proteínu v každej dráhe po dobu 1-2 hodín pri teplote 37 ° C alebo izbovej teplote. Vzorky boli umyté a detekované so zvýšenou chemiluminiscencie po dobu 30-60 sekúnd (Minipore).
Výsledky
Profil rozdiely medzi vzorkami navigácie LCM a celých undissected kryostatových tkanív
Pre vyhodnotenie účinkov navigovať LCM na profiloch tkanivo proteín, sme vykonali 2-de proteínové profily celých undissected kryostatových tkanív a LCM-vzoriek GCA. Obrázok 1 zobrazuje príklad procesu navigovať LCM. Väčšina škvrny, detekované v pitvaných nenádorových a nádorové tkanivo bolo možné pozorovať v celých undissected kryostatových tkanív, s výnimkou niekoľkých miestach. Avšak, stále ešte existujú niektoré miesta nachádzajú v celom undissected kryostatu tkaniva, ktorý nemohol byť pozorovaný u oboch vzoriek LCM. Preto je táto technológia by mohla obohatiť nielen nenádorových a nádorové epitelové bunky, ale by mohla znížiť aj kontaminácie v tkanivách, ako je hemoglobín [10, 11]. Okrem toho navigovať proces LCM mohla eliminovať dopady škvrny na separáciu proteínu 2-DE [15]. Tak, naše údaje potvrdzujú potrebu vykonávať navigovaná LCM v proteomických štúdiách GCA tkanív. Obrázok 1 navigovanej laser zachytenie mikrodisekcii nádorového tkaniva. (A) Hematoxylín postriekané kardia adenokarcinóm; (B) unstained GCA tkanivo; (C) nádoru tkaniva po mikrodisekcii; (D) Zachytené nádorových buniek na LCM filmu.
Profil rozdiely v expresiu proteínov medzi GCA tkanív a okolitých normálnom tkanive
sme vykonali navigovať LCM a 2-DE za spárovaných nádorových tkanív a okolité non nádorového tkaniva od pacientov GCA. Približne 800-1,000 proteínové škvrny boli detekované farbením striebrom. Pre meranie reprodukovateľnosti, každú vzorku podstúpil experimentu trikrát. Tam bolo 905 ± 74 a 867 ± 51 proteínové miesta v mape GCA a nenádorových žalúdočné srdcového tkaniva, resp. Krytej škvrny boli 799 ± 29 a 727 ± 34 oddelene, a príslušná priemerná miera zhody bol 88,2% a 83,8%. Okrem toho je priemerná odchýlka polohy zhodných miest bol 1,031 ± 0,205 mm a 1,44 ± 0,11 mm v IEF a SDS-PAGE smere, resp. Hoci analýza snímok ukázal, že tieto 2-DE mapy boli reprodukovateľné, boli malé rozdiely v intenzite a počte miest. Avšak, analýza ukázala, gélov 27 proteínové škvrny, ktorých intenzita sa výrazne líšila a trvalo medzi nenádorových a nádorových tkanivách (obr. 2). Boli vypočítané pomery normalizovanej intenzity mieste rakoviny, paraneoplasis tkanív pre každú z proteínov záujmu. boli vybrané, škvrny, ukazujúci rozdiel dvojnásobný a štatisticky významne (p 0,05 <). Tri z výsledkov 2-DE bola potvrdená imunohistochemicky a western blot analýzy. Obrázok 2 2-DE mapa malígny a nemalígna žalúdočnej kardio tkaniva. Všetky zobrazené mapy sa pripraví z rovnakého pacienta. (A) 2-DE satelitné celých undissected kryostatových tkaniva; (B) 2-DE mapa non-nádorového tkaniva po LCM; (C) 2-DE mapa GCA tkaniva po LCM. Identifikácia
Protein
obaja celok vzoriek undissected kryostatových a LCM-vzoriek boli použité na identifikáciu proteínov. Dvadsať sedem rôzne proteínové škvrny medzi GCA tkanív a okolité nenádorových tkanív boli vyrezané. Avšak, iba 23 proteíny boli identifikované pomocou MALDI-TOF-MS (tabuľka 2). Tento jav je pravdepodobne kvôli posttranslačních modifikácií, ako je peroxiredoxin 1 (PRX-1), ktorý bol prítomný v dvoch susedných miestach (viď obr. 2, na mieste 11). Tieto proteíny boli rozdelené do niektorého z nasledujúcich možností: proliferácie a diferenciácie buniek (ANXA2, ANXA4, hnRNPA2 /B1), apoptóza (PRX-1, PRX-2, GSTP, VDAC, ETFB), metabolizmus (ADH1C, AKR1C3, CA2, GATM ), proteázy súvisiacich (CTSD, PACSIN1), cystoskeleton (Actin 1, keratín 8), chaperony (hsp27, 60, 70, PDIA3), a RNA väzby a transkripcie (hnRNPH3, PCBP1, ENO1). Obrázok 3 ukazuje mapy PMF z HSP60.Table 2 proteínov s rozdielnu expresiu medzi GCA nádorového tkaniva a priľahlých párových normálnom tkanive boli identifikované MALDI-TOF MS
Up-regulácia proteíny
Spot č
proteín
prístupovej No.a)
MR /PIB)
zápasu
COV (%) c)
T-test
Pomer (tumor /nenádorových) Prostriedky ± SD
1
heat-shock proteín beta-1 (hsp27) *
P04792
23 /6,0
9
54
0,0040
3,4279 ± 2,0727
2
Heat shock proteín 70 kDa 5 (HSP70)
P11021
70 /5,0
22
42
0,0030
3,2597 ± 1,5314 Sims 3
60 kDa proteín tepelného šoku (HSP60) *
P10809
58 /5,2
12
37
0.0001
2,8308 ± 1,1426
4
proteín disulfidovou izomerázy A3 (PDIA3) *
P30101
54 /5,6
13
41
0,0280 4,2105
± 2.7294
5
annexinu A4 (ANXA4)
P09525
36 /5,8
10
34
0,0140
4,7153 ± 7,3434
6
annexin A2 (ANXA2)
P07335
38 /7,5
7
26
0,0150
6,0722 ± 5,5431
7
Heterogénne jadrová ribonukleoproteiny A2 /B1 (hnRNP A2 /B1 ) *
P22626
37 /9,0
16
43
0,0050
10,7775 ± 9,5547
8
katepsin D ťažkého reťazca (CTSD)
P07339
27 /5,6
12
61
0,0012
4,3552 ± 3,7703
9
proteín kinázy C a kazeín kináza substrát v neurónoch proteín 1 (PACSIN1)
Q9BY11
51 /5,1
5
24
0,0028
2,6026 ± 1,2147
10
Glutatión S- transferázy P (GSTP) *
P09211
23 /5,4
5
44
0,0026
3,8757 ± 2,2198
11
Peroxiredoxin-1 (PRX-1) *
Q06830
22 /8,3
8
59
0,0140
4,2744 ± 4,1568
12
Poly (rC) viažuci protein1 (PCBP1) *
Q15360
37 /6,7
12
63
0,0070
2,7401 ± 0,5321
13
Aldo-keto reduktázy rodinného 1member C3 (AKR1C3)
P42330
37 /8,1
7
25
0,0040
2,7762 ± 1,1820
14
Glycineamidinotransferase (GATM)
P50440
44 /6,4
8
23
0,0390
2,7839 ± 0,4680
15
Keratin, typ II cytoskeletu 8 (Keratin 8) *
P05787
54 /5,5
9
25
0,0020
3,5063 ± 0,6423
down-regulácia proteíny
16
aktínu , cytoplazmatických 1 (aktínu 1) *
P60709
42 /5,3
6
30
0,0160
0,2603 ± 0,1539
17
Heterogénne jadrová ribonukleoproteiny H3 (hnRNPH3)
P31942
37 /6,4
5
28
0,0015
0,6028 ± 0,6229
18
Peroxiredoxin-2 (PRX-2) *
P32119
22 /5,7
6
24
0,0250
0,2376 ± 0,1202
19
uhličitý anhydrase2 (CA2) *
P00918
29 /6,8
6
33
0,0130
0,3675 ± 0,1270
20
Alpha-enoláza * (ENO1)
P06733
47 /7,0
16
42
0,0030
0,2898 ± 0,1340
21
alkoholdehydrogenázou 1C (ADH1C)
P00326
40 /8,6
7
49
0,0280
0,2287 ± 0,1680
22
Electron Transfer flavoproteínov podjednotku b (ETFB)
P38117
28 /8,3
6
26
0,0240
0,2655 ± 0,1415
23
napätie závislé na anión -selective kanál (VDAC) *
P21796
31 /8,6
7
39
0,0120
0,4474 ± ​​0,0297
) Swiss-Prot prírastkové č.
b ) Teoretická hodnota
c) sekvencie pokrytie%
* proteíny boli nájdené u karcinómu žalúdka skôr.
Obrázok 3 identifikáciu MALDI-TOF MS mieste 3 v GCA. Imunohistochemické stroje a western blot analýza pre HSP 27, 60, a-2 PRX v GCA
ďalej šetriť, či hsp27, 60, a PRX-2 sú exprimované v tkanivách, a určiť, ktoré bunky exprimujú tieto proteíny, imunohistochemická analýza bola vykonaná za použitia formalínom pevnej a paraffin- vložené vzorky tkaniva, ktoré boli zladené so vzorkami 2-DE. Expresie hsp27 a 60 mohol byť videný vo všetkých cytoplazme karcinómu buniek, pričom by bolo možné vidieť v niektorých cytoplazme stĺpcovom epitelového (Obr. 4A-D) v nenádorových tkanív. Na rozdiel od toho PRX-2 bol takmer nie je zistené, že je exprimovaný v bunkách karcinómu, ale skôr v niektorých cytoplazme cylindrických epitelových buniek (obr. 4E, F). Preskúmať tieto hladiny expresie proteínu, western blot analýza bola tiež vykonaná za použitia rovnakých tkanív (viď obr. 5). Ako sa dalo očakávať, hsp27 a 60 bolo zistené, že trvalo vysoko exprimovaný v nádorovom tkanive, zatiaľ čo PRX-2 bola potlačená. Obrázok 4 Imunohistochemické analýza pre hsp27, 60, a PRX-2 v ľudskom normálne žalúdočnej kardio a GCA. Výrazom hsp27 (A), 60 (C), a PRX-2 (E) boli v cytoplazme nádorových buniek; Výrazom hsp27 (B), 60 (D) a PRX-2 (F) boli nájdené v cytoplazme normálnych cylindrických epitelových buniek; Zväčšenie: A-F x 40, kontrastne hematoxylínom
Obrázok 5 Western blot analýza pre overenie zvýšenej expresie hsp27, 60, a znížená expresia PRX-2 v GCA tkanivách .. . GAPDH a β-aktínu boli použité ako referencia
Diskusia
Cardia je anatomická pomedzí medzi pažerákom a žalúdkom; Z toho dôvodu je konštantná diskusie týkajúce sa ich vzťah z hľadiska epidemiológie, klinického obrazu a klasifikácie u adenokarcinóme pažeráka (EA), GCA a DGA. Ak chcete porovnať svoje proteínové profily, sme hľadali literatúru nájsť tieto proteíny. Trinásť z 23 proteíny boli nájdené v DGA skôr (tabuľka 2). Medzi nimi, hsp27, 60, 70, PDIA3 a CA2 majú rovnakú expresný vzor v GCA a DGA. Na rozdiel od toho expresie nízkoúrovňové z hsp27 bol nájdený v EA [16-20]. Preto je tumorogenézy GCA sa líši od EA a DGA, a tak GCA by malo byť zreteľné patologický subjekt.
Cellular heterogenita je významnou prekážkou na molekulárnej analýzu normálnych a chorých tkanív. Prvýkrát opísal Emmert-Buck et al. v roku 1996, laser zachytenie mikrodisekcii je silný a presný postup použitý na štúdium zmien proteínov v určitej podskupine buniek nízkymi nárokmi na údržbu systému, ktorý možno ľahko ovládať [8]. Ako obvykle, rôzne histochemické škvrny bunkových kultúrach sa používajú pre vedenie procesu disekcia. Avšak, niekoľko prípadov ukázali mierne až dramatické dôsledky škvrny na separáciu proteínov o 2-DE [21, 22]. Na odstránenie škvŕn ako potenciálny škodlivé účinky navigovaná LCM bol nedávno vyvinutý. Využíva postriekané úsek pre vedenie preparáciu nefarbených priľahlých vzorky [23]. Táto technika bola úspešne použitá v štúdii mozgových vzoriek [15]. Okrem toho, vzhľadom k typickej morfologické charakteristiky žalúdočné srdcové povrchné stĺpcovom bunky a srdcové žľazy, sú ľahko identifikovať na dehydrované časti bez škvŕn. Preto navigovať LCM stal optický stratégie v našej proteomiky prístupe. V tomto výskume, počty LCM odvodených nemalígna a malígnych buniek značne líšila a často malá v porovnaní s celými undissected kryostatových tkanív, bez ohľadu na profiloch, ktoré boli veľmi podobné medzi vzorkami LCM a tie undissected. To ukazuje, že navigovať LCM môže byť vykonateľný postup pre štúdium žalúdočné srdcového tkaniva, a že je kompatibilný s 2-DE a MALDI-TOF MS.
Sme získali profil proteínu GCA porovnaním zmeny v proteínu profily okolité nenádorových tkanív. Ak chcete znížiť individuálne rozdiely, vzorky tkaniva boli získané od rovnakého pacienta, čo nám umožňuje študovať diferenciálnej expresie proteínu pod podobným genómovej pozadia. Podľa nášho najlepšieho vedomia, sme zverejnili prvé proteomickou analýzu GCA. Z 27 vybraných proteínových škvŕn, 23 proteínov v molekulárnej hmotnostnej rozmedzí od 15 do 75 kDa a s izoelektrický bod medzi 3 a 10 boli identifikované 2-DE a MALDI-TOF MS. Väčšina z týchto proteínov boli predtým opísané ako rozdielne exprimované buď na úrovni mRNA alebo na úrovni proteínu v iných typov rakoviny u človeka.
HSP sú skupina stresových proteínov vyvolaných rôznymi typmi životného prostredia a patofyziologických urážky. V tejto štúdii, čo-up-predpisy hsp27, 70, a 60 boli nájdené v žalúdku srdcových nádorových tkanivách. Ako chaperony, hsp27 a HSP70 môže inhibovať apoptózu interakcií s apoptosome a kaspázy aktivačný komplexu [24], sú základom pre ich úloha v progresii nádoru a rezistenciu voči liečbe [25]. Početné štúdie ukazujú, že hsp27 a hsp70 overexpressions signalizujú zlú prognózu a predpovedať zlú reakciu na chemoterapiu. HSP60 sa zdá byť kľúčovou endogénne zápalový mediátor a je pravdepodobne prepustený poškodených buniek. Okrem toho, spolu s HSP70, HSP60 sa podieľa na prezentácii antigénu na malígnych ochorení [26]. HSP sú nadmerne exprimované v prsníka, hrubého čreva, žalúdka, prostaty a karcinómy [10, 25]. Preto, že nadmerná expresia hsp27, 70 a 60 môžu byť užitočné pre biomarkery karcinogenéze v GCA a môže byť spojená so stupňom diferenciácie a prognóza GCA.
Z identifikovaných proteínov, dva proteíny sa podieľajú na regulácii transkripcie a expresie génov nádorom spojených. PCBP1, up-regulované v GCA, je RNA gardedáma post-transkripčný regulátor. Bolo preukázané, že PCBP1, spolu s PTB-1 a hnRNPK, ovláda niekoľko preto-onkogén génov a apoptózu v súvislosti s génmi expresie, ako je taška-1, c-myc,
Apafi-1, XIAP, a DAP5, stimuláciou aktivity vnútorného vstupu ribozómu (IRES) segmentu. PCBP1 je potrebné na otvorenie RNA v regióne, ktorý obsahuje vstupné okno ribozómu, zatiaľ čo PTB-1 môže byť požadované pre ribozómov nábor [27, 28]. V poslednej dobe sa Pickering, B. M. et al. opisuje, že glykanové časti PCBP1 môže byť v súvislosti s metastatickým schopnosťou a môže hrať úlohu v hepatocelulárneho karcinómu metastáz [27]. Potom up-regulácia PCBP1 môže regulovať cap-nezávislý mechanizmus iniciácie translácie srdcových génov s nádorom spojených vo vývoji GCA. Ako nádorový supresor, Alpha-enoláza môžu regulovať aktivitu promótorom c-myc vo forme väzobný proteín c-myc (MBP-1). MBP-1, potom sa môže viazať na P2 elementu v promótorom c-myc a súťažiť s TATA-box väzbového proteínu (TBP) pre potlačenie transkripcie c-myc [29, 30]. Na druhej strane, down-reguláciu Alpha-enoláza, je v súlade s prácou Chang YS et al.

• Klinický význam paliatívnej gastrektómii na prežitie pacientov s nevyliečiteľnou pokročilým karcinómom žalúdka: systematický prehľad a metaanalýza
• MicroRNA-645, up-regulované v ľudskom adencarcinoma žalúdočnej pažeráka križovatky, inhibuje apoptózu zameraním nádorového supresor IFIT2