Plos ONE: VEZT, roman Domnevna zaviralnih, Zavira rast in tumorogenosti želodčne Cancer

Povzetek

Vezatin (VEZT), adherens križišča transmembranski protein, je bilo ugotovljeno, da domnevni zaviralnih v naši prejšnji študija. Vendar pa je vloga VEZT v tumorigeneze še vedno nedosegljiva. Naš namen je, da pojasni svoje epigenetsko regulacijo in bioloških funkcij v rakom želodca. V tej študiji smo pokazali, da je raven izraz VEZT vključeni v limfnem metastaz, globina invazije raka in stopnji TNM pri 104 bolnikih z rakom želodca. Bisulfatna zaporedja verižno reakcijo s polimerazo (BSP) metode so pokazali, da je bila VEZT hypermethylated v tkivih in ustrezno krvi bolnikov z rakom želodca v primerjavi z zdravimi kontrolami. Helicobacter pylori
( H. Pylori
) okužba sproži metilacije in utišanje VEZT v celicah GES-1. Obnovitev VEZT izraz na raka želodca celice podjetja MKN-45 in NCI-N87 zavirajo rast, invazija in tumorigeneze in vitro in in vivo
. Globalna analiza mikromrež je bila uporabljena za analizo molekularne osnove bioloških funkcij VEZT po VEZT transfekciji kombinaciji s PCR v realnem času in kromatina imuno testom. G-proteinom sklopljen receptor 56 (GPR56), rast celic, celične delitve cikel 42 (CDC42), migracije /invazija in transkripcijski faktor 19 (TCF19), napredovanje celičnega ciklusa, so bili opredeljeni kot neposredni VEZT ciljnih genov. TCF19, nov cilj VEZT je funkcionalno potrjena. Čezmerno TCF19 v MKN-45 celic povečal napredek celičnega ciklusa in sposobnost rasti. Ta študija zagotavlja nov vpogled v ureditev gena VEZT, ki lahko predstavljajo potencialno tarčo za terapevtskih strategij za boj proti raku

Navedba. Miao R, Guo X, Zhi Q, Shi Y, Li L, Mao X, et al. (2013) VEZT, roman Domnevna zaviralnih, Zavira rast in tumorogenosti želodčnega raka. PLoS ONE 8 (9): e74409. doi: 10,1371 /journal.pone.0074409

Urednik: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japonska

Prejeto: 1. april, 2013; Sprejeto: 1. avgust 2013; Objavljeno: 17. september 2013

Copyright: © 2013 Miao et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprl delno z nepovratnimi sredstvi iz nacionalnega mladostne Science Foundation Kitajske (81101858), Naravoslovno Foundation province Shandong Kitajske (ZR2011HM041, Y2007C102, ZR2011HM076), Key raziskovalni projekt iz Shandong znanost in tehnologijo Komisije (2011GGB14158, 2007H2071), Mladostna Science Foundation province Shandong Kitajske (BS2010YY060). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je drugi najpogostejši vzrok smrti moškega, povezanih z rakom in tretji vodilni vzrok smrti žensk, povezanih z rakom na svetu [1]. To je velik problem javnega zdravja po vsem svetu [2]. Na Kitajskem so 400.000 novih primerov raka želodca in letno 300.000 smrti. Veliko primerov, ki so trpeli zaradi raka želodca so izgubili kurativno priložnost z izjemno slabim izidom [3]. Zato je razvoj novih in učinkovitih terapevtskih metod, je bistvenega pomena, da se zmanjša umrljivost zaradi raka želodca. Znano je, da je patogeneza želodca karcinomov več dejavnikov, ki vključujejo genetska predispozicija in okoljskih dejavnikov. Obstaja več genetskih Premene vključno zaviralnih genov, onkogeni, celičnih adhezijskih molekul in rastnih faktorjev [4].

Čeprav molekularne mehanizme želodca rakotvornosti ostajajo nejasne, epigenetsko utišanje, povezanih s tumorji genov promotor hypermethylation nedavno se je pojavilo kot pomemben mehanizem tumorigeneze. profil promotor hypermethylation razlikuje v vsaki vrsti raka in znotraj vsakega gena, ki zagotavlja tumorja tipa in genskih specifične profile hypermethylation, ki lahko vključuje v ustreznem molekularni mehanizem tumorigeneze. Določitev novega gena tarča promotorja hypermethylation lahko zagotovi vpogled v mehanizme za inaktivacijo tumorskih-omejevalno poti in je pomembno za identifikacijo tumorskih označevalcev raka želodca [5,6].

V zadnjem času smo opredelili, adherens križišči transmembranski protein, ki je, VEZT kot kandidatko gena tumor-supresorski. Naš namen je, da se pojasni epigenetsko regulacijo in bioloških funkcij v VEZT na raka želodca. VEZT, vseprisotno integralni protein, ki je neposredno povezan z E-kadherina-catenin kompleksa in aktina skeleta [7,8]. Njegove naloge so predvsem raziskati epitelijskih celic. Izguba VEZT je postopoma škoduje razvoja zarodka [9,10], in VEZT je ključnega pomena za ohranjanje celovitosti mobilnih križiščih med dolgotrajnim mehanske obremenitve se pojavljajo na ravni lasnih celic notranjega ušesa pri odzivu na zvok. Poleg tega notranje uho specifična VEZT pogojno razveljavitev povzroča progresivno gluhosti [7]. VEZT je zelo izražena v možganih [8,11]. VEZT je obogaten z dendriti v miš hipokampusa nevronov. Uporaba VEZT knock navzdol in pogojno Knockout pred (D6cre) ali po (CamKIIαcre) rojstvo, VEZT ureja hrbtenice morfologijo. Morfološke spremembe niso povezane z ogroženimi sinaptičnih stikov, vendar postsinaptični VEZT igra ključno vlogo pri morfofunkcionalne zorenje ekscitatornih postsinaptične elementov [12].

Inaktivacija gena VEZT je bila ugotovljena pri raku želodca in metiliranje CpG otokov v promotorski regiji gena VEZT prispevajo k njeni inaktivacijo kot ga določa prejšnji študiji, ki jo našem laboratoriju [13] poteka. Mehanizem metilacije in natančna vloga VEZT pri razvoju raka želodca trenutno niso znani. še niso bile opredeljene ciljne geni in z njimi povezane poti iz VEZT. V tej študiji smo sistematično analizirali mehanizem metilacijskega statusa in metilacijskega promotorja gena VEZT. Prav tako smo analizirali svoje funkcionalnosti po rekonstituciji VEZT izražanja in vitro in in vivo
.

Materiali in metode

Celične linije in vzorce tkiva

MKN -45, MKN-28, SGC-7901 je ovekovečena človeške želodčne sluznice celične linije GES-1 (ki jih je inštitut prebavnega kirurgije Ruijin bolnišnice povezana Shanghai Jiao Tong University) [13,14,15,16,17] in človeške endotelijske celice popkovna veno (HUVECs) so bili ohranjeni v našem zavodu. Želodčni rak celične linije snu-1 in NCI-N87 celice smo pridobili iz American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Na kratko smo celice gojili v RPMI1640 dopolnjenem z 10% fetalnega telečjega seruma in 2 mM L-glutamina. Celice so se ohranili pri 37 ° C v prisotnosti 5% CO _2.

Glavni želodčni tumor in normalne želodčne sluznice tkiva so bili zbrani bodisi iz rednega terapevtskega operacijo ali gastrointestinalne endoskopije na našem oddelku. Preostanek je bil H. pylori
stanje okužbe je bila določena na podlagi testa hitro ureaze kot je opisano prej [18].

Etika Izjava

Pisna privolitev v študiji je bila pridobljena iz vseh udeležencev. 4-tedensko-letni moški BALB /c golih miši so bile kupljene pri eksperimentalnem centru živali kitajske akademije znanosti (Shanghai, Kitajska) in ohranila v laboratorijske Center živali deželne bolnišnice povezan z Shandong University (Jinan, Kitajska) na 12/12 h cikla svetloba /tema (luči off na 19: 00), s hrano in vodo na voljo adlibitum. Poskusi na živalih so bili odobreni odbor Institucionalna živali Nega in uporabe na deželne bolnišnice povezan z Shandong University (Dovoljeno število: SHANS87492). Protokol študije je odobril odbor za etiko deželne bolnišnice povezan z Shandong University.

Obdelava Laser mikrodisekcijo za tkiva in celice

Robčki so čim prej odstraniti po resekciji in je določena v formalin, vgrajeni v parafin, in narežemo na 8-mikrometrov debelih oddelkov za hematoksilinom in eozinom (H &E) barvanjem. Vsa tkiva bili pregledani histološko in izkušeni patologi potrdil diagnoze. Del vsakega vzorca je bil vključen v Tissue-Tek ^{® Optimum Rezanje Temperature ™ (OCT) spojina medij (VWR Znanstvena izdelki, San Diego, CA, ZDA) v kriostat in skoči zamrznili za mikrodisekcijo.}

celice in zamrznjena oddelek diapozitivi smo obarvali tik pred laser zajemanja mikrodisekcijo (LCM) na ledu. Na kratko, oddelki so laser microdissected z uporabo LM200 sistema (Olympus, Japonska /Arcturus Engineering Inc, ZDA). Področja interesov, so bili izbrani na podlagi mikroskopskih vodstvom in prekrita z etilen vinil termoplastično (EVA) filma nameščena na optično prozoren pokrov. Infrardeči laser je bil aktiviran s pritiskom na tipko, ki se tali film neposredno nad tarčne celice. To talina povzročila vezave, da tvorita med celicami in filmu prenos, ki je močnejša od vezave med celicami in diapozitive. Parametre, uporabljene za LCM vključen premer lasersko 7,5 um, lasersko moč 50-60 mW. Pet tisoč laserskih impulzov izpusti na vzorcu so bili uporabljeni za "zajemanje" približno 10 000 morfološko celice iz vsakega primera. Vsaka populacija je ocenjena na > 95% "homogeni", kot je določeno z mikroskopskim vizualizacijo zajetih celic. Zgornje meje s ujetih celice so nato nameščena na 0,5 ml microcentrifage cevi. Po mikrodisekcijo, lahko DNA, RNA, ali protein pridobljen iz alikvoti microdissected vzorcev.

metilacije analiza

genomske DNK, pridobljene iz microdissected celičnih linij, želodca rakavih tkiv in plazme (0,2 ml ) smo očistili z uporabo DNAzol (Invitrogen). Očiščen DNK smo obdelali z natrijevim bisulfitom (Sigma, Phoenix, ZDA) in nato analizirali z BSP ali specifično verižno reakcijo s polimerazo (PPN) kot je opisano zgoraj [13,15]. Pomnoženi bisulfitne PCR produkte smo subklonirali v vektorski sistem TA (Promega) po navodilih proizvajalca. DNA sekvencioniranje smo opravili na treh posameznih klonov (Sangong). PCR produkt smo potrdili agaroznem gelu in vizualizirali z uporabo etidijevim bromidom obarvanje. Primerji so povzeti v Tabeli S1.

Elektronsko mikroskopska opazovanja

H. pylori
sevi NCTC11637 (tako CagA- in VacApositive) so bili zagotovljeni profesorja Guo Oddelka za medicinsko mikrobiologijo in parazitologijo, inštituti medicinske znanosti, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine. H. pylori
sevi so bili kultivirani rutinsko za 72 ur na Columbia agar osnove (BIOMERIEUX, Francija) s 5% ovčje krvi v mešanem zraku, ki vsebujejo 10% CO _{2, 5% O2, 85% N 2 na 37 ° C. Nato smo pretvorili H. pylori
na tekočem mediju, ki vsebuje možgansko srčno infuzijo (BD, US), 10% ovc kri, in enake antibiotike, kot je bila uporabljena v Columbia agar bazo. Tekoč medij smo stresali na stresalniku (Forma znanstvenega, ZDA) s konstantno hitrostjo vrtenja 120 obratov na minuto. H. pylori so
šteje uporablja spektrofotometer (BioSpec-min, SHIMADZU znanstveni instrumenti, Japonska) in speremo s sterilnim PBS (pH 7,4, 5000 rpm, 10 min) pred uporabo. GES-1 celice (4 x 10 ^{5) gojimo do zlit na steklenim pokrovom zdrsne v šestih vdolbinami, nato pa so bile celice GES-1 okuženih z H. pylori
na Multiplicity okužbe (MNZ) 100: 1. Po inkubaciji 24 ur, so opazili morfološke spremembe celic ges-1 z uporabo H-800 menjalnik z elektronskim mikroskopom.}}

Real-time QRT-PCR analizo

Prečiščena skupno RNA je bila pridobljena iz microdissected celic, smo celotno RNA pridobljeni z uporabo TRIzola rešitev. Reverzna transkripcija (RT) smo izvedli v reakciji 20! Li skladu s priporočili proizvajalca (Qiagen). Realnem času analize QRT-PCR smo izvedli s pomočjo začetnih oligonukleotidov, navedenih v tabeli S1. ekspresijski nivoji prepisovali smo določili s kvantifikacijo intenzivnost produkta PCR normalizirajo na gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) izražanja. Kvantitativno merjenje ravni mRNA je bila narejena z ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, ZDA). Ti podatki so bili analizirani s pomočjo primerjalne metode CT.

Western blot

Skupaj protein je bila vzeta iz microdissected celic. Signal ekstrakcije protein buffer 1 sistem (430-7608-SDS) z Bio-Rad Corporation je bila uporabljena za pridobivanje beljakovin v naših poskusih in koncentracija je bila izmerjena z metodo protein-testa DC Bradford (Bio-Rad). Skupaj 100 mg proteina iz vsakega vzorca, smo ločili z 10% SDS-PAGE gelu in prenesli na uravnotežen poliviniliden difluorid membrane (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, VB) Proteine ​​smo zaznali z izboljšano kemiluminescence (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL , ZDA) po inkubaciji s specifično primarna protiteles VEZT (1: 2000), IL-6 (1: 2000), AKT (1: 1000), CAG A (1: 3000), IL-8 (1: 3000), ATF3 (1: 2000), in IRX5 (1: 2000) pri 4 ° C preko noči in nato sekundarno protitelo. vsebnosti beljakovin so preračunana na celotno GAPDH uporabo monoklonsko anti-GAPDH protitelesa (Sigma), kot je opisano zgoraj [15].

Gradnja izražanja vektorja VEZT and TCF19

VEZT in TCF19 Čezmerno vektorja pEGFP -N1 VEZT in pEGFP-N1-TCF19 so bili izdelani s pomočjo prekrivanja PCR ali PCR metodo, v tem zaporedju in primerji, ki se uporabljajo za dve vektorjev so povzete v tabeli S1. PCR produkt smo potrdili z direktnim sekvenciranjem DNA in klonirali v ekspresijski vektor sesalca pEGFP-N1, kot smo že prej opisali [15]. MKN-45 in NCI-N87 raka želodca celične linije so bile uporabljene za študij Čezmerno. Dobili smo stabilno transfektirali klonov, ki G418 izbiro (Promega). Stabilna transfektant praznega vektorja pEGFP-N1 smo uporabili kot kontrolo. Za transfekciji smo komplekse Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp, Carlsbad, ZDA) in eden izmed plazmidov omenjenih pripravimo po navodilih proizvajalca, in ti kompleksi so bili direktno zmešamo s celicami pri 24 vdolbinami ploščice za celično kulturo z gostoto 4 × 10 ^{4 celice na dobro. Stopnja VEZT ali TCF19 izraza po transfekciji smo analizirali s PCR v realnem času.}

Invasion, migracije in nastajanje testi endotelija cevi

Cell invazija, je bilo opravljenih migracije in endotelija sestavo cevi testi uporabo MKN -45 in NCI-N87 celice. Celične kulture smo izvedli v transwell komor (Corningovimi, NY, ZDA). Za invazijo testu so bile vložna membrane obložena z razredčenim Matrigel (San Jose, CA, ZDA). Celice (1 x 10 ^{5) dodamo k zgornji komori in gojili 48 ur. Za migracijo testu, vložna membrane niso prevlečeni z Matrigel, vendar so bili gojeni pod enakimi pogoji. Končno smo vložna membrane reši in obarvamo s kristal vijoličnim (0,04% v vodi, 100 ml) in prehajali celice preštejemo pod mikroskopom obrnjenem in jih fotografirali}

In vitro angiogenezo je bila ocenjena z uporabo. endotelijska tvorba cev test kit (San Diego, CA, ZDA). Na kratko, smo vsako vdolbino prechilled kulture ploščah s 96 vdolbinami prevlečene s tanko plastjo ECM gela. HUVECs smo resuspendirali v supernatantih, zbranih iz transfektiranih celic. HUVECs (2 x 10 ^{4 celic /jamico) smo dodali k polimeriziranega ECM gel s 300 ml supernatantih. Po 18 h inkubacije je bila zmožnost oblikovanje cevi ocenili z določitvijo cevaste številko, cevasto dolžino in število cevnih stičišč vozlišč v petih naključno izbranih področjih s pomočjo sliko Pro Plus programska oprema (Media kibernetika Inc., Bethesda, MD, ZDA), po metodi Mirshahi v [19].}

rast celic in Soft agar oblikovanje kolonija test

želodcu rakave celice (2 x 10 ^{3 celice) inkubiramo z 100 ml medija kulture v 96 -multiwell plošče za en dan pri 37 ° C v 5% CO _{2. Celice smo transfektirali s plazmidom za 24, 48, 72, 96 in 120 ur. Cell številka je bila ocenjena s pomočjo mobilnega štetje kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Japonska). Na kratko smo CCK-8 (10 xl) dodamo v vsako vdolbino. Po 1 h inkubacije pri 37 ° C, je bila absorbanca pri 450 nm merijo v ploščo bralnika Arvo MX (PerkinElmer, Massachusetts, ZDA). Število celic je bila določena z relativnim absorbanco pri 450 nm.}}

želodcu rakave celice tripsiniziramo na podvozju enoceličnih od 3 x 10 ^{3 celice in nato smo nanesli na šestimi vdolbinicami v popolni gojišče, ki vsebuje 0,3% agarja večplastna na vrhu 0,6% agarja. Plošče smo inkubirali pri 37 ° C, v prisotnosti 5% CO _{2 za 16 dni. je bilo doseženih kolonije, ki vsebujejo vsaj 50 celic. Podatki so prikazani kot povprečje ± standardni odklon petih naključno doseženih področjih.}}

rast tumorjev pri golih miših

celice (1 x 10 ^{6 celic v 100 ml) iz rakavih celic linije transficirane s praznim vektorjem ali VEZT izražanja vektorja so bili zbrani in podkožno vcepimo v desnega krila regijah 4 tednov star moški BALB /c golih miših (kitajske akademije znanosti, Shanghai, Kitajska). Tumor vozliči so bile izmerjene na vsake 4 dni v čeljusti. Miši smo usmrtili po 1 mesec. so bile izračunane krivulje rasti tumorja in stopnje inhibicije rasti. Dve miši so bili uporabljeni za poskusne in kontrolne skupine, in tri neodvisne poskuse smo izvedli, kot je prej opisano [15,16].
Preverjanje}

Globalna analiza cDNA mikromrež in ciljni gen

Prečiščena skupaj RNA je bila pridobljen iz microdissected celic. Uporabili smo celoten človeški genom oligo mikromrež (Agilent, Santa Clara, CA, ZDA). Po hibridizaciji in izpiranju smo mikromrežnem drsi skenirane z mikromrežnem skener za Agilent DNA. Nastale besedilne datoteke, pridobljeni iz Agilent Feature Extraction programske opreme (različica 9.5.3), so bile uvožene v programsko opremo Agilent GeneSpring GX (različica 7.3) za nadaljnjo analizo. Diferencialno bili izraženi geni, opredeljenih s pregleda krat spremenila. Za ciljno preverjanje genov smo uporabili PCR v realnem času in kromatin imuno testom. Primerji za ciljne geni so navedeni v tabeli S1.

Tok citometrična analiza celičnega cikla

En dan pred transfekcijo, 1 x 10 ^{zasejemo 6 celice podjetja MKN 45 celic v kulturi plošč 6-tudi brez antibiotikov. Celice smo transficirali s praznim vektorjem ali TCF19 ekspresijskem vektorju. Oseminštirideset ur po transfekciji smo celice poberemo in fiksna v 70% etanolu pri -20 ° C preko noči, in nato obarvali s 250 ig /ml propidijevim jodidom (Sigma-Aldrich), 5 mg /ml RNaze A (Sigma-Aldrich) in 5 mmol /l EDTA v PBS (pH 7,4) 30 minut. Analiza celičnega ciklusa je bilo izvedeno z FACSCAN (Beckman Instruments, Fullerton, CA, ZDA).}

Statistična analiza

Statistična analiza je bila opravljena s pomočjo SPSS15.0 programske opreme (SPSS Inc, USA). Podatki so izraženi kot povprečje ± standardni odmik od najmanj treh ločenih eksperimentih. Korelacija med VEZT izražanja v tumorjih in clinicopathologic spremenljivkami je bila izračunana s testom ranga Kruskal-Wallis in test Mann-Whitney U. Razlike med skupinami smo analizirali s pomočjo t-test in hi-kvadrat test. Vrednost p
< 0.05 smo imeli za statistično značilne.

Rezultati

Razmerje stopnjah izražanja VEZT in clinicopathological dejavnikov pri bolnikih z želodčnega raka

smo raziskovali odnos med izražanjem VEZT v 104 seznanjenih želodca rak tkiva in clinicopathological dejavniki pri bolnikih z rakom želodca. Ugotovili smo, da je raven izraz VEZT močno povezana s limfnega metastazo globine vdora raka in fazo TNM (tabela 1, P
< 0,05). Vendar pa stopnje izraženosti VEZT niso povezani s spolom, starostjo, velikost tumorja, diferenciacija celic, bruto videz, mestu tumorja in oddaljene metastaze.
Dejavniki
No. bolnikov
Povprečna ekspresije VEZT（mean±SD)
P
-value
GenderMale5714.87±2.031.382Female4715.47±3.15Age(year)<654918.62±2.150.584≥655513.11±3.45Tumor velikost < 5cm5117.16 ± 3.052.682≥5cm5311.26 ± 3.52Cell differentiationPoor differentiation6818.21 ± 1.651.827Moderate differentiation3616.6 ± 2.46Gross appearanceBorrmann Ⅰ + Ⅱtype3217.25 ± 3.462.361Borrmann Ⅲ + Ⅳtype7215.21 ± 6.58Site od tumorCardia2119 0,34 ± 2.530.692Body3611.24 ± 2.61Antrum4717.35 ± 2.87Lymphatic metastasisPositive747.42 ± 7.250.027 * Negative3018.26 ± 9.32Depth za raka invasionT22518.35 ± 7.820.041 * T36322.12 ± 4.21T41624.78 ± 5.41 distalno metastasisPositive249.34 ± 6.091.032Negative8012.35 ± 8.62TNM # StageⅠ156.35 ± 7.160.0385 * ⅱ2816.37 ± 4.56Ⅲ4817.24 ± 1.41Ⅳ137.41 ± 2.36Table 1. Povezava med izražanjem VEZT v rakavih tkiv in clinicopathological dejavniki pri bolnikih z rakom želodca.
smo analizirali odnos med izražanjem VEZT pri rakavih tkiv in clinicopathological dejavnikov v vzorcih želodčne raka v primerjavi sosednjih zdravih tkivih (n = 104). Ugotovili smo, da je raven izraz VEZT močno povezana s limfnega metastazo globine vdora raka in fazo TNM (tabela 1, P
< 0,05). Vendar pa stopnje izraženosti VEZT niso bili povezani s spolom, starostjo, velikost tumorja, diferenciacija celic, bruto videz, mestu tumorja in oddaljenosti metastaz #. TNM, tumor-node-metastaze; * p
< 0,05. CSV Prenos CSV

analiza metilacije normalnih želodčnih tkiv, osnovnih želodca rakavih tkiv in periferni krvi pacientov želodca karcinomom in zdravih kontrolah

Na podlagi predhodne študije iz našem laboratoriju smo domnevali, da je metilacija VEZT promotorja je bilo drugače pri bolnikih želodca karcinomom in zdravih kontrol; smo uporabili spletno bioinformatiÄŤnih programsko opremo za analizo stanja promotor regijo in metilacija VEZT gena (slika 1A). Proučili smo raven metilacijski promotorja VEZT v 30 vzorcih tkiva DNK pri bolnikih s primarnimi želodca tkiva z rakom, ki ustreza plazmi DNK in nadzor nad uporabo metod, BSP, ki je zajemal regije z -171bp za -428bp (Slika 1A). Povprečne metilirana ravni VEZT v 30 osnovnih želodca tkiv rakom in 30 običajnih želodčnega tkiva so bili 67.78 ± 25.90% in 42.42 ± 30,30%, v tem zaporedju (slika 1B). Primarne želodčne rak tkiva pokazala višjo raven metilacije v VEZT promotorski regiji v primerjavi z običajnimi želodčnih tkivi (slika S1A, slika 1B, P &0.05). Srednja methylated raven plazemske DNA v primarnih želodčnih bolnikih z rakom in zdrave primerih nadzora je bilo 69.00 ± 23.90% in 46.71 ± 26,31%, v tem zaporedju (slika 1C). Metiliranega nivo plazemskega DNA v primarnih bolnikih z rakom želodca pokazala višjo raven metilacije v VEZT promotorski regiji v primerjavi s kontrolno zdravo primeru (sl S1B, slika 1C, P < 0,05). Tako je bila pomembna metilacije opazili pri želodčnem skupini raka v primerjavi z zdravimi kontrolami. Raven metiliranega VEZT v tkivih in plazmi lahko služi kot molekulska označevalca raka želodca.

H. pylori
okužba sproži metilacije in utišanje VEZT

Precej študij je bil objavljen pa mora biti razvidno, da je H. pylori
okužba je neodvisni dejavnik tveganja za metilacije [20,21,22]. Zato predvidevamo, da H. pylori
povzroča VEZT metilacije in nato rakotvornost. Sprva smo preverjali raven metilacijski promotorja VEZT v DNK iz 23 vzorcev tkiv pri bolnikih s H. pylori
-positive kronični gastritis in kontrole z uporabo BSP in MSP metode, ki je zajemal regije -171bp za -428bp in -342 bp do -513 bp, v tem zaporedju (slika 1A). Ravni srednja metilacija promotor VEZT v H. pylori
-positive in nadzor bila 75,74 ± 28,16% in 31,20 ± 25,67%, oz. Tako so opazili pomembno razliko v metilacije v H. pylori
-positive kronični gastritis skupini v primerjavi s kontrolno skupino ( P
< 0,01, slika 2A). Promotor regija VEZT je običajno metiliramo pri bolnikih s kronično gastritisa po analizi PPN (tabela S2); Vendar pa smo ugotovili, štiri primere H. pylori
-positive kronični gastritis, ki so bili relativno nemetiliran. Ugotovili smo 19 primerov H. pylori
-positive kronični gastritis, da prikaže hypermethylation (tabela S2). Da bi ugotovili, ali H. pylori
okužba povzroči promotor metilacije gena VEZT in vitro
, smo ugotovili, da je H. pylori
okužba bile povezane z izražanjem IL-6, AKT, TNF-а, IL-8, ATF3 in IRX5 proteina po H. pylori
okužba in inkubirali 24 ur v celicah GES-1, ki uporablja metodo Western blot. Naši rezultati so pokazali, H. pylori
okužba spodbuja ekspresijo IL-6, AKT, TNF-а, IL-8, ATF3 in IRX5 proteina in H. pylori
okužba je bila uspešna pri GES-1 celic (slika 2B, 2C). Da bi še dodatno potrjujejo, da ta H. pylori
okužba je vsekakor odgovoren za metitiranjem ali utišanje VEZT smo analizirali stanje promotor metilacijski VEZT v celicah GES-1 s PPN in BSP. Kot je prikazano na sliki 2d in 2e je bil pobudnik VEZT hypermethylation v H. Opazili pylori
okuženimi GES-1 celice, vendar unmethylation v celicah neokuženih z H. pylori
(slika 2D in E). Stopnja protein izraz VEZT je bil nižji tudi v H. pylori
okuženimi celicami kot v celicah neokuženih z H. pylori
(slika 2C).

Funkcionalna analiza po obnovitvi VEZT ekspresijo in vitro

Pogosto dušenje zvoka ali downregulation od VEZT v želodcu raka celičnih linijah kažejo, da je verjetno tumor-supresorski je gen v prejšnji raziskavi. Da bi preverili to točko, smo pregledani VEZT izražanja v več želodčnih linij rakavih celic s PCR v realnem času in zahodni blot. Različne ravni VEZT izraz je bilo ugotovljeno, da v zadnjih šestih celičnih linijah, analiziranih (slika 3A). Zgradili smo pEGFP-N1-VEZT izrazni vektor in transfekcirajo pEGFP-N1 vektor v želodčni rak celične linije MKN-45 in NCI-N87, ki je pokazala, brez ali z nizko stopnjo VEZT izražanja. Po transfekciji smo opisali izražanje VEZT v teh celičnih linij s PCR v realnem času, ki je pokazala, da je bila stopnja prepis izraz VEZT navzgor reguliranim 41,99-krat (slika 3B, P < 0,01) v teh celičnih linijah v primerjavi s s celicami za nadzor transfektirana. Prav tako je preučilo zmogljivosti želodčnih rakavih celic s prekomerno ekspresijo VEZT, da napadejo in se selijo, ki jih transwell invazije in migracijskih teste (slika 3c). Invazivnega sposobnost MKN-45 celic v VEZT /N1 skupine se je bistveno zmanjšala v primerjavi s celicami za nadzor transfekcije (78.32 ± 5.27 vs. 174,13 ± 2,45, P
< 0,001). Število podjetja MKN 45 celic v VEZT-transfektirane vzorca, ki prehaja skozi vložek transwell je tudi bistveno zmanjšalo v primerjavi s celicami za nadzor transfektirana (48,28 ± 2,16 vs. 142,13 ± 7,42 P
< 0,001).

HUVECs smo suspendirali v supernatantih, zbranih iz nadzora in VEZT /N1. Po 18-urno inkubacijo, supernatant odvzamejo iz VEZT /N1 celic pokazali močno zavira nastanek cevastih konstrukcij s strani HUVECs z ozirom na število, dolžina in seka vozlišč v primerjavi s kontrolno skupino (slika 3C). Kot je prikazano na sliki 3D, rast celic MKN-45 celic signifikantno zatreti po obnovitvi VEZT izražanja glede na kontrolno skupino ( P
< 0,05). Da bi preverili ponovljivost naših ugotovitvah, smo ocenili sposobnost NCI-N87 raka želodca celic, da napadejo, selitev in cevasto obliko strukture na VEZT prekomerno. Ti rezultati so bili podobni tistim iz podjetja MKN-45 rakavih celic, ki kažejo, da ima VEZT pomembno zaviralno vlogo pri invaziji, migracije in cevasto nastanek rakavih celic.

Vpliv VEZT prekomerno na tumorjev raka celice v golih miših

izražanju VEZT zatreti rasti tako MKN-45 in NCI-N87 s CCK-8 testu v primerjavi s kontrolno skupino (slika 3D, p < 0,05). Ta ugotovitev je še dodatno potrjuje kolonije oblikovanja testom, z vzgajanjem želodčne rakavih celic mehkega agarja po transfekciji z VEZT-prekomerno ekspresijo vektorja. Stopnje nastanek kolonij MNK-45 celic je bilo 13,56 ± 0,53% v VEZT /N1 skupini in 1,2 ± 0,31%, v kontrolni skupini ( P
< 0,001, slika 4E). Stopnja kolonija oblikovanje NCI-N87 celic pokazala podoben trend. Dalje, smo preučili vpliv VEZT prekomerno na rast tumorja inokulacijo MKN-45 ali NCI-N87 /N1 in VEZT /N1 celice subkutano v desnega krila regijah golih miših. Tumorogenosti se je bistveno zmanjšalo v VEZT-transfekciji celic. Hitra rast tumorja smo opazili pri kontrolnih skupinah po 1 mesec (Slika 4F). supresivno Vloga tumor VEZT izražanja je bila očitna v obeh raka celičnih linijah testiranih (sliki 4G, P < 0,01), kar kaže, da VEZT zavira tumorogenosti rakavih celic. Ti rezultati so pokazali, da izraz VEZT zaviral tumorogenosti raka želodca tako in vitro
in in vivo
.

Identifikacija ciljnih genov po VEZT gen transfekciji

za pojasnitev molekularni mehanizem, ki je podlaga za zaviralni učinek VEZT na celice invazije, rast, migracije in tumorjev raka želodca. Analizirali smo genoma vsej transkriptome profil MKN-45 /N1 in VEZT /N1 celic z Agilent oligo mikromrež. Po zložljiv sprememb (> 3,0), pregledovanje med MKN-45 /N1 in VEZT /N1 celic, smo ugotovili 193 molekul genov in 135 navzdol reguliranih genov (tabela S3). Preiskali smo gene, ki se prekrivajo z povezanimi z rakom in molekularno povezanih s funkcijo gena kompleti v MSigDB (C4 in C5 genov določa; http://www.broad.mit.edu/gsea/msigdb/index.jsp~~HEAD=dobj~~number=plural). Izbrali smo 49 povezanih z rakom, gene, ki vključujejo 23 molekul genov in 26 navzdol reguliranih genov za gruče kartiranje na platformi analize mikromrež MeV (www.tm4.org/mev.html~~pobj, slika 4A). PCR v realnem času smo izvedli za preverjanje teh genov (tabela S4) in potrdili naše ugotovitve mikromrež za 8 molekul genov in 10 navzdol reguliranih genov (Slika 4b). Imena genov in funkcionalne opombe so navedeni v tabeli S5. Da bi ugotovili, ali gre za neposredni ciljni geni VEZT smo izvedli kromatina, imuno teste s pomočjo VEZT protitelesa in nato analiziral potegnil navzdol DNA. Identificirali smo tri navzdol reguliranih genov, TCF19 (NM_001077511), CDC42 (NM_001039802) in GPR56 (NM_001145770) kot neposredni cilji VEZT (slika 4C).

korelacije med VEZT in njenih nadaljnjim ciljev, kakor tudi njihovo pripadnost zaviranje želodčne rakavih celic invazije, rast, migracije in tumorjev raka želodca in vitro
in in vivo
, so prikazani na sliki 5C.

• Plos ONE: The Identifikacija in karakterizacija biomarkerjev-glikana, ki temeljijo N Novel želodčnega raka
• Plos ONE: genskega polimorfizma v TOX3 je povezana s preživetjem želodca raka v kitajski Prebivalstvo