Plos ONE: kalpainskega /SHP-1 Interakcija s Honokiol zaviralnega peritonealno izkazovanja želodca raka v nu /nu miši

Povzetek

Ozadje

Honokiol, majhno molekulsko maso naravni izdelek, je pa že so poročali, da aktivirate apoptozo in zavirajo želodcu tumorigeneze. Ali honokiol zavira angiogenezo in metastaze želodčnih rakavih celic ostaja neznan.

metodologija /glavnih ugotovitev

Testirali smo učinke honokiol na angiogensko aktivnost in peritonealno razširjanje s pomočjo in vivo, ex vivo
in in vitro
analizne sisteme. V signalne odzivi v človeške želodčne rakave celice, so odkrili in analizirali človekovih centralni žilne endotelijske celice (HUVECs) in izolirani tumorji. V ksenotransplantskih želodčne modelu tumor miške, honokiol močno zaviral peritonealno razširjanje s PET /CT tehniko odkriti. Honokiol tudi učinkovito oslabila angiogenezo, ki piščancev horioalantoisnih membrane testu, miška Matrigel vtiča testu, rat aortne obroč endotelijskih celic brstenja testu in endotelnih celic cevi oblikovanja testa odkriti. Poleg tega honokiol učinkovito izboljšati signala pretvornik in aktivator transkripcije (STAT-3) fosforilacijo in blokiranem STAT-3 zavezujoč aktivnost DNA v človeških želodčne rakavih celic in HUVECs, ki je bila v korelaciji z up-regulacijo dejavnosti in beljakovin izražanja Src homologijo 2 (SH2) vsebujoč tirozin fosfataze-1 (SHP-1). inhibitor kalpainskega-II in siRNA transfekciji bistveno obrnil SHP-1 aktivnost-honokiol povzroča. Zmanjšana STAT-3 fosforilacija in povečala SHP-1 izraz so bili prikazani tudi v izoliranih peritonealno metastatskih tumorjev. Honokiol bil sposoben zaviranja generacije VEGF, ki bi se lahko obrnil s SHP-1 siRNA transfekciji tudi.

Sklepi /Pomen

Honokiol poveča izražanje in aktivnost SPH-1, ki nadalje deaktivira stat3 pot. Te ugotovitve kažejo tudi, da je honokiol roman in močan zaviralec angiogenezo in peritonealno širjenje želodca rakavih celic, ki zagotavlja podporo za možnost prijave honokiol pri zdravljenju raka želodca

Navedba. Liu SH, Wang KB, Lan KH, Lee WJ, Pan HC, Wu SM, et al. (2012) kalpainskega /SHP-1 Interakcija s Honokiol zaviralnega peritonealno izkazovanja želodca raka v nu /nu
miši. PLoS ONE 7 (8): e43711. doi: 10,1371 /journal.pone.0043711

Urednik: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Nemčija

Prejeto: 17. januar 2012; Sprejeto: 24. julij 2012; Objavljeno: 24. avgust 2012

Copyright: © Liu et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprlo raziskovalne štipendije iz Taichung veteranov General Hospital, Tajvan (TCVGH-997314C, TCVGH-1007313C) in National Science sveta Tajvana (NSC99-2320-B-005-003-MY3). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

večina bolnikov (~60%) z rakom želodca so diagnosticirali pozno fazi bolezni. želodčni rak je drugi najpogostejši vzrok za globalno smrtnosti zaradi raka v razvitih državah in kaže metastatsko bolezen ob diagnozi [1]. Kirurgija in kombinacija kemoterapijo za rakom želodca, se je izkazalo, da daje le skromne koristi za preživetje v naprednih primerih, in skoraj 50% bolnikov, ki so še vedno umre po ponovitve [2], [3]. Glavna oblika ponovitve je peritonealno širjenje. Rast raka in peritonealno metastaze so odvisni angiogenezo, postopek, ki vključuje več angiogenskih faktorjev, vključno vaskularni endotelijski rastni faktor (VEGF), epidermalni rastni faktor (EGF), bazičnega fibroblastnega rastnega faktorja, prostaglandin E2, interlevkin-8, kemokin (CXC motiv) liganda 1, in matrica metaloproteinaza družina [4] - [6]. Več molekularnih signalov, kot signala pretvornik in aktivator transkripcije-3 (STAT-3), jedrska faktorja EB Akt, mitogenom aktivirana protein kinaz, ciklooksigenaze-2, lipoksigenaze, inducibilne sintaze dušikovega oksida, tumorjev nekrotizirajočega faktorja in drugih so tudi pokazale, da se vključijo v napredovanje tumorja in angiogenezo [7] - [9]. Vendar pa celični in molekularni mehanizmi za nastanek, napredovanje in metastaze raka želodca je treba še pojasniti.

Janus aktivira kinaze (Jak) /STAT signalizacijo pot igra pomembno vlogo pri regulaciji rast celic, angiogenezo, diferenciacija, migracija in metastaze [10]. Konstitutivna aktivacija STAT poti, zlasti STAT-3, ki je povezan s široko paleto človeških malignostmi. Obstojna STAT-3 fosforilacije so opazili pri različnih človeških rakavih obolenj, kot so trdni tumorji želodca, debelega črevesa, jeter, prostate, dojk, pljuč, glave in vratu ter kakor tudi krvne malignostmi [8], [10]. Predhodna raziskava je pokazala, da so fosforilacijo STAT-3 in VEGF proteinov izražanja človeške želodčne tkivu raka, kar povzdignil za angiogenski fenotip in prispeva k razvoju želodca in napredovanja raka [11] povečala. Po drugi strani pa so nekateri fosfataze znano, da so tumorske valov in lahko igrajo pomembno vlogo pri inhibicijo ali nadzor rasti raka [12] - [15]. Protein tirozin fosfataze (PTP), vključno SH2 vsebujejo domene tirozin fosfataze (SHP) -1 in SHP-2, lahko negativno regulacijo STAT signalizacijo, ki jih tirozin fosforilacijo več komponent v sorodnih signalnih [13] - [15] . Neprekinjeno aktivacija STAT-3 v tumorjih se lahko olajša vsaj delno izgubo funkcije teh fosfataze. Kalpainskega II Dokazano je, da igra vlogo v endoplazemski retikulum (ER), stres urejeno tumorigeneze, ki sodeluje v mehanizmu honokiol zaviral želodca tumorigeneze [16]. Poleg tega je prejšnji Študija je tudi pokazala, da je SHP-1 endogeni substrat za kalpaina po A23187 sproženo aktivacijo trombocitov [17]. Zato je kalpainskega /SHP-1 urejena STAT-3 in VEGF pot lahko sodelujejo v angiogenezo, rast in peritonealna širjenje želodca rakavih celic.

Honokiol, majhno molekulsko maso naravni izdelek, je glavna aktivna biphenolic spojina Magnolia officinalis
, ki je znano, da izboljša mikrobne infekcije, vnetja in prebavne motnje v tradicionalnih azijskih medicinskih sistemov [18]. Naši prejšnji študija je pokazala, da honokiol zavira želodčni tumorigeneze po aktivaciji 15-lipoksigenaze-1 in posledično inhibicijo peroksisom receptorjev-a in COX-2-odvisnih signalov-proliferator aktiviran [19]. Honokiol Dokazano je, da povzroči ER stres in sproži kalpainskega-II-posredovano glukoze regulirano protein-94 dekolte in apoptozo v človeške želodčne rakavih celic [16]. Dokazano je, da bi lahko VEGF izraz odzivajo na hranil pogoji prikrajšanosti, ki povzročajo ER stres [20], [21]. Poleg tega je bilo ugotovljeno, da ER stres aktivator Tunicamicin izrazito prepreči razvoj mikrovaskularizacije, kar kaže, da imajo ta ER stres induktor lahko potencialno vlogo pri zdravljenju dojk tumorjev [21]. Učinki honokiol na ER-stres povezana angiogenezo in želodca tumorja metastaz še vedno nejasna. Tu smo predpostavili, da honokiol zavira angiogenezo in peritonealno razširjanje želodčnih rakavih celic skozi kalpainskega /SHP-1 organiziranem STAT-3 in VEGF poti. Rezultati so pokazali, da honokiol izrazito zaviral angiogenezo in peritonealno širjenje želodca rakavih celic preko kalpainskega /SHP-1 interakcij aktivira STAT-3 fosforilacijo in VEGF navzdol-ureditev poti.

Rezultati

Honokiol blokiran Peritonealna Metastasis želodčnega raka vivo

Rak je pogosto označena s povečano privzema [ ^{18F] fluoro-2-deoksi-D-glukoze (FDG), in [ 18F] -FDG /PET lahko služi kot nadomestni ukrep o terapevtski učinkovitosti. Funkcionalna možnost majhnega slikanje živali s pomočjo klinično PET /CT skener s FDG je bila ovrednotena. so raziskovali štiri skupine miši za peritonealno metastazami poskuse. Izjava /slika položaja metastaz je prikazano na sliki 1. Mi izkoriščena [ 18F] -FDG-PET /CT za odkrivanje peritonealno metastaze pri miših, cepljenih z človeškimi želodčnih rakavih celic (MKN45 ali SCM-1), z ali brez honokiol zdravljenje. Kot je prikazano na sliki 2, je največja intenziteta projekcija ustvarjen s tipičnimi reprezentativnih miši. Peritonealno metastaze je označena v kontrolni skupini miši (leva plošča), zato je bil obrnjen z obdelavo honokiol (desno plošče). Te slike so jasno pokazali, da je neinvazivna [ 18F] -FDG dimnih kanalih v peritonealno metastatskih tumorjev kontrolnih miših so bili precej višji od tistih v miši-honokiol zdraviti. Količinsko intenzivnosti je prikazano na sliki 3A. Intraperitonealno injekcijo honokiol (5 mg /kg, dvakrat /teden) bistveno zmanjšala ocenjene radioaktivnosti sliko in posebne privzema vrednosti (SUV) s FDG-PET /CT, določene pri miših, cepljenih z želodčnih rakavih celic (sl. 3). Poleg tega so bili številni metastatskim vozlički najdemo v peritonealni votlini (mezenterij) kontrolnih miši, cepljenih z MKN45 in SCM-1 (sl. 2) celicah. V nasprotju s tem so pri miših, obdelanih z honokiol občasno opazili peritonealne tumorske gomoljev. Količinska gomoljev na polju je prikazano na sliki 3B.}

Honokiol inhibirano Angiogeneza in vivo
, ex vivo
in in vitro

endotelijskih celic so ključnega pomena za angiogensko proces, ki je potrebna za rast tumorja in metastaz. Bomo naslednjič raziskovali angiogensko učinek honokiol pomočjo bejba horioalantoisnih membran testa ( CAM
test), Študiie vtič test, aortna obroč brstenja test, in endotelnih tvorba celic cev. Kot je prikazano na sliki 4A, honokiol učinkovito zaviral neo-žilne tvorbe v CAM
testom brez vidnega učinka na že obstoječe krvnih žil. Kvantitativna analiza je pokazala, da honokiol povzročil 2,5-kratno zmanjšanje števila novo oblikovanih krvnih žil v primerjavi s tisto za kontrolni medij.

V testu Matrigel stožca, Študiie vsebujejo VEGF (100 ng /ml gela) s ali brez honokiol (10 mg /ml) smo subkutano implantirali v golih miših. Po 21 dneh implantaciji so bile oblikovane Matrigel svečke izrežemo in fotografirali. Vtič s samo VEGF so izrazito progasto, žilni in rdeče barve. Svečke, ki vsebujejo VEGF in honokiol bili bledi, ne kaže nobene ali manjšo tvorbo krvnih žil (sl. 4B-a). Prav tako preučil gostoto plovila in morfologijo plovila v oddelkih vtiča s H & E obarvanje in Imunohistokemijsko s protitelesom proti CD31, kot endotelijskih celic marker. Prekrvavitve v honokiol + VEGF skupine signifikantno zmanjšana v primerjavi s samim skupino VEGF (sl. 4B-b). Kvantifikacija prekrvavitve s štetjem plovil in predstavljene endotelijske celice, je pokazala, da je bila žilne gostota v skupini, honokiol obravnavati bistveno zmanjšala (sl. 4B-c in 4B-d).

Nato so sprožili endotelijske celice rastnimi iz izoliranih podganjih aorte plošč v prisotnosti Matrigel in ECGM (endotelni celični rasti srednje), ki vsebuje angiogenim citokinov, kot so VEGF in osnovno fibroblastni rastni faktor. Obsežna endotelna celica izrastek iz podganjega aorte obročnimi eksplanti so opazili pri kontrolni skupini (sl. 5A). Zdravljenje Honokiol povzročilo znatno (~five-krat) zmanjšanje endotelijske izraščanja in razraščanja iz aorte obroči (sl. 5A in 5c). Poleg tega je morfološka diferenciacija endotelijske tvorbe celične cevi raziskovali uporabo dvodimenzionalne metode Matrigel. Kot je prikazano na sliki 5B, cepitev HUVECs v Matrigel je privedlo do žilne tvorbo strukture cevastem. Honokiol učinkovito inhibira tvorbo endotelnih celic cevi z zmanjšanjem strukture cevi, kot v dolžino in širino (sl. 5B in 5D).

Honokiol odpravijo STAT-3 signalizacijo v Human želodca rakavih celic HUVECs in Tumorji

Prejšnje študije so pokazale močno povezavo med aktivnim STAT-3 in angiogensko fenotipa [11]. Nadaljevali smo pojasnili vpliv honokiol na fosforilacijo STAT-3 v človeške želodčne rakavih celic (MKN45 in AGS) in HUVECs. Kot je prikazano na sliki 6, honokiol zmanjšalo tirozin (Tyr705) fosforilacijsko od STAT-3 v odvisnosti od časa način s približno dvakratno znižanje na 1-2 uri v AGS celicah (sl. 6A) in 3 do 10- krat zmanjšano na 0.5-24 hv MKN45 celic (sl. 6b). Presenetljivo je, da honokiol povzroča STAT-3 defosforilacije za Tyr705, vendar ne Ser727, ostankov v teh človeških želodčnih rakavih celic. Vendar honokiol hkrati zaviral tako Tyr705 in Ser727 fosforilacijo STAT-3 v HUVECs (sl. 6c). Kvantitativna analiza beljakovin pasovih v zahodni blot uporabo Image-Pro Plus programsko opremo je prikazano na sliki 7. Rezultati analize s konfokalnim mikroskopom je pokazala tudi, da honokiol odpravila tirozin (Tyr705) fosforilacija STAT-3 v AGS celic in HUVECs (Slika . 8A).

smo podrobneje preučiti fosforilacije STAT-3 v peritonealno metastatskih tumorjev izoliranih iz golih miših, cepljenih z MKN45 celic z (5 mg /kg) zdravljenjem ali brez honokiol. Imunohistokemični analiza je pokazala, da je p-STAT-3 prekomerno in kopičenje v regiji tumorja, vključno jedra in citoplazmo, signifikantno obrnil s honokiol zdravljenju (sl. 8B). V Zahodni blot analizi honokiol opazno zmanjšala kopičenje p-stat3 v tumorjih v primerjavi s kontrolnim nosilcem (sl. 9A). Izraz konstitutivni stat3 ni bila prizadeta. Poleg tega je bila vezava aktivnost DNA STAT-3 potrjuje uporabo EMSA. Kot je prikazano na sliki 9B honokiol znatno inhibira povečano DNA vezavno aktivnost STAT-3 v človeške želodčne rakavih celic. Honokiol ovira tudi-VEGF povečala STAT-3 DNA vezavo dejavnost HUVECs (sl. 9b).

Honokiol povzročena SHP-1 urejeni STAT-3 fosforilacijo v želodcu rakavih celic, endotelijskih celic in tumorjev

SHP-1 je ne-transmembranski PTP [12]. Mi Naslednja preučiti, ali lahko honokiol regulira izražanje in aktivnost SHP-1. Kot je prikazano na sliki 10A, honokiol izboljšano ekspresijo proteina SHP-1, vendar ne SHP-2, pri HUVECs in AGS celic v odvisnosti od časa način. Farmakološko PTP inhibitor in SHP-1 siRNA transfekciji učinkovito odpravila-honokiol povzroča STAT-3 defosforilacije v HUVECs in AGS celic (sl. 10B-a). Podobne rezultate v celicah SCM-1 in SV-40 imortalizirana miš mikrovaskularnih endotelnih celic (SVECs), zdravljenih z honokiol so prikazani na Sliki 10B-b. Mi poleg preučilo, ali je endogeni SHP-1 prilagodijo po honokiol. Honokiol bil sposoben vzbuja aktivnost SHP-1 v želodčnih rakavih celicah, HUVECs in SVECs v odvisnosti od časa način (sl. 11A). Honokiol okrepljeno tudi SHP-1 protein izraz v peritonealno metastatskih tumorjev izoliranih iz MKN45-cepljenih miših je kot ga imunohistokemičnim analizo (sl. 11B) je pokazala. nadalje smo raziskovali interakcije med SHP-1 in STAT-3 z uporabo metod sodelovanja imuno in metodo Western blot. Kot je prikazano na sliki 11C, se je SHP-1 posebej povezana s STAT-3 v AGS celic in HUVECs v prisotnosti honokiol v primerjavi z IgG kontrolo.

Honokiol Altered ER Morfologija, inducirane kalpaina II regulirano SHP -1-inducirano STAT-3 fosforilacijo in zmanjšana VEGF Generation

Prejšnje študije so pokazale, da ima ER stres pomembno vlogo pri angiogenezo [20], [21]. Mi poleg preučila vpliv honokiol na ER mikrostrukturo s transmisijsko elektronsko mikroskopijo. Kot je prikazano na sliki 12A, so ER dilatacija in razdrobljenost razstavljena v-honokiol zdravljenih SCM 1-želodčne rakavih celic in HUVECs.

Prav tako smo želeli ugotoviti, ali je potrebna aktivacija kalpainskega-II za SHP-1 aktivnost v honokiol zdravljene celice. Farmakološko kalpainskega inhibitor in kalpainskega-II siRNA transfekciji učinkovito znižani honokiol okrepljeno SHP-1 aktivnost v AGS celic in HUVECs (sl. 12B). Celice se zdravijo z rekombinantnim kalpainskega-II, kot pozitivno kontrolo, so pokazali povečanje 4-5-kratno v SHP-1 aktivnost (sl. 12B). VEGF je znano, da vsebuje STAT-3 promotor vezno mesto. Mi Naslednja preučiti, ali lahko honokiol regulira VEGF izraz. Honokiol bistveno zmanjša nastajanje VEGF v AGS celic in HUVECs, in ta učinek se je obrnil s SHP-1 siRNA transfekciji (sl. 12C). Poleg tega transfekcija mutantski-STAT-3 plazmida v celice zaviral tudi nastajanje VEGF. Kombinacija honokiol s mutanta-STAT-3 plazmida transfekciji v celicah sinergistično zmanjšano produkcijo VEGF v primerjavi z bodisi samim zdravljenjem (sl. 12C). Nadalje potrjujejo povezanost med kalpainskega-II in SHP-1, smo sočasno imunoprecipitacije in Western blot izvedemo v želodčnih rakavih celic. Kot je prikazano na sliki 12D, smo kalpainskega II posebej povezana s SHP-1 v AGS celicah v prisotnosti honokiol (20 um) v primerjavi s IgG kontrolo. Podobno je, honokiol povzroča kalpainskega /SHP-1 interakcija tudi v HUVECs (podatki niso prikazani).

Pogovor

Honokiol je pomemben sestavni del Magnolia officinalis
, ki je prehodno zdravilo v Aziji [18]. Honokiol ima anti-oksidacijske in protivnetne učinke in vitro
in in vivo
[22] - [25]. Honokiol Dokazano je, da kaže močno antiproliferativno aktivnost proti endotelne celice vitro
in anti-tumorskih učinkov proti angiosarkom pri golih miših [26]. V tej študiji smo dokazali prvič, da je honokiol močan inhibitor angiogeneze in peritonealno metastaze raka želodca. Naša raziskava se je osredotočila na učinke in možnih mehanizmov honokiol peritonealno metastaz in angiogenezo uporabo PET /CT, CAM
test, Študiie vtič test, aortna obroč endotelijskih celic brstenja test, endotelijskih celic cev oblikovanje testa, in in vitro
celic poskusov. Rezultati so pokazali, da se lahko honokiol zavirajo angiogenezo in peritonealno širjenje informacij prek kalpainskega-II-aktivirano SHP-1 aktivacijo signalne kaskade a. Aktivacija fosfataze SHP-1, ki ga honokiol nadalje privedlo do navzdol-regulacijo STAT-3 aktivacijo in VEGF proizvodnje, ki izhajajo iz inhibicije angiogeneze in peritonealno metastaz. Vendar pa lahko zaviranje angiogeneze in zaviranje metastatskega potenciala rakavih celic, ki jo honokiol biti ločeni vidiki, ena čemer učinek od honokiol na angiogenezo neposredno in drugega učinka honokiol na rakave celice.

V zadnjih nekaj let, so pokazale številne študije, da konstitutivna aktiviranje družine STAT, zlasti STAT-3, ki je povezana z celično proliferacijo, angiogenezo in metastaziranje [10], [11], [27] - [30]. Povečana aktivacije STAT-3 izražanja je bila najdena v različnih tumor izvira celic in vzorcev iz človeških tkivih raka. Deregulacije aktivacije STAT-3 je bilo predlagano, da igrajo pomembno vlogo pri čezmerni VEGF in povečana angiogenim fenotipov na raka želodca, ki lahko prispevajo k razvoju želodca in napredovanja raka [11]. V tej raziskavi smo ugotovili, da lahko honokiol učinkovito zavre fosforilacijo STAT-3 v HUVECs (tako Tyr705 in Serine727 straneh), človeške želodčne rakavih celic (Tyr705 strani), in peritonealno metastatskih tumorjev (Tyr705 mestu). Ker je onkogeni aktivacija tirozin kinaz skupna značilnost raka, smo se osredotočili na vlogo Tyr705 fosforilacije STAT-3.

SHP-1 ima potencialno funkcijo tumor dušenje in je negativni regulator JAK /STAT signalizacijo pot [15]. Prav tako je bilo dokazano, da lahko SHP-1 fosfatazo veže na fosforiliranega Y1173 domene, ki vodi do EGFR fosforilacijo [31]. Y429 v citoplazemske domene receptorja eritropoetina je bilo predlagano, da se za protein tirozin fosfataze SH-PTP1 vezivno mesto, ki se lahko igra pomembno vlogo pri ustavitvi proliferacije signale [32]. SHP-1 je prav tako pokazala, da je antagonist rastnega faktorja signalizacijo v epitelijskih in hematopoetske celice [15]. SHP-1 je bila še posebej poudarjena kot potencialnega fiziološki antagonist VEGFR signalizacijo [33]. V endotelijskih celic, je SHP-1 fizično povezana s VEGFR2 in je potrebna tudi tako TNF posredovana in tkiv zaviralec metaloproteinaz (TIMP) pogojenega ki zavirajo angiogenezo [31]. Tako je SHP-1 aktivacija imajo lahko pomembne posledice za regulacijo orožja in angiogenezo. V tej študiji smo ugotovili, da honokiol posebej okrepljeno ekspresijo SHP-1, vendar ne SHP-2, pri želodčnih rakavih celic, endotelijskih celic in peritonealno metastaznih tumorjev. Te ugotovitve kažejo, da honokiol lahko zavirajo endotelnih celic angiogenezo in rakavih celic metastaze, ki so lahko s pomočjo SHP-1-inducirane STAT-3 navzdol-ureditev poti.

Prejšnje študije so predlagali pomembno vlogo ER stresa v molekulska mehanizem angiogenezo in rasti rakavih celic [16], [20], [21]. Koyama in kolegi so tudi predlagali, da se ER stres povzroča motnje kalcij lahko sodelujejo v indukcijo kopičenje amiloida beta in angiogenski faktor izražanja v mrežnice pigmentnega epitelija [34]. Nedavna študija je pokazala, da ER stres regulirano IRE-1α signalizacijo ima bistveno funkcijo placente razvoj in zarodka preživetja, kar kaže na odnos ER stresa in angiogenezo v posteljico med nosečnostjo [35]. Kim in sodelavci so pokazale, da sta oba SHP-1 in SHP-2 endogeni substrati za kalpaina, ki sodeluje v okviru Entamoeba histolytica
smrt inducirano gostiteljska celica [36]. Predvsem calpains postane aktiven, ko znotrajcelično kalcija ([Ca ^{2 +] i) koncentracija povišana; m-kalpainskega (kalpainskega II) zahteva [Ca 2+] i na milimolaren območju, vendar mikromolarnih koncentracij [Ca 2+] i dovolj za aktivacijo μ-kalpainskega (kalpaina I) [37 ], [38]. Dokazano je, da je visoka stopnja [Ca 2+] i zavira protein tirozin-kinazne aktivnosti zaradi aktivacije kalpainskega med stimulacijo ga ionoforjem v trombocite [39]. Honokiol bil sposoben inducirati [Ca 2 +] i mobilizacijo v živčnih celicah [40]. V zadnjem času, so poročali Tunicamicin da zavira angiogenezo in vivo
. Naša predhodna študija je pokazala, da honokiol povzroča človeško apoptozo želodčni rak celic in zavira tumorigeneze prek-kalpainskega posredovano glukoze regulirano protein-94 cepitvijo [16]. V tej raziskavi smo naravnost pokazala, da so ER razširjene in razdrobljen-honokiol zdravijo raka želodca celic in HUVECs. Poleg tega je farmakološko zaviralec kalpaina in kalpainskega-II siRNA transfekciji učinkovito znižani honokiol okrepljeno SHP-1 aktivnost v želodčnih rakavih celic in HUVECs. Predvsem naši rezultati prvič pokazala, da je kalpainskega /SHP-1 interakcije neposredno sproži honokiol inhibicijo STAT-3 fosforilacije v želodcu rakavih celic. Ti rezultati kažejo, da lahko honokiol povzroči ER stres in sproži kalpainskega-II-aktivirane SHP-1 aktivnost v želodcu rakavih celicah in endotelijskih celicah.}

Na koncu so rezultati te študije zagotavljajo in vivo , ex vivo
in in vitro
dokazi za inhibicijo angiogenezo in peritonealno širjenje želodca rakavih celic, ki ga honokiol in molekularna osnova za njegove učinke. Ti podatki poudarjajo sodelovanje ER kalpaina in protein tirozin fosfataze SHP-1 signalizacijo v honokiol zaviral STAT-3 aktivacije in VEGF proizvodnje v želodcu rakavih celicah in endotelijskih celicah (sl. 13). Te ugotovitve kažejo tudi, da naznanjajo navzdol-ureditev STAT-3 in VEGF inducira kalpaina /SHP-1 lahko obetavna terapevtska strategija za zdravljenje raka želodca.

Materiali in metode

Cells kultura in

Človeški želodčni rak celičnih linij, vključno celične linije kavkaškega (AGS, zmerno /slabo (mešane) diferenciranih adenokarcinom celicah) in azijske celičnih linij (MKN45 in SCM-1, nediferencirani adenokarcinomom celice), so bili pridobljeni iz celična banka Taipei veteranov Splošne bolnišnice (Tajvan). Celice so bile vzdrževane v RPMI1640 mediju, ki vsebuje 10% FCS in streptomicin /penicilin v navlaženi 5% CO _{2 atmosferi.}

HUVECs so bili pridobljeni iz centralnih ven vrvi z obdelavo kolagenaze kot je opisano predhodno [41]. Ta študija je v skladu z načeli za uporabo človeških tkiv, opisanih v Helsinški deklaraciji. Protokol študije je odobril revizijski odbor za etiko veteranov Splošne bolnišnice Taichung, Taichung, Tajvan (odobreni dokument TCVGH-C0062-1). smo uporabili HUVECs na tretji prehod. Učinkovitost transfekcije (> 80%), ki ga lipofektinskih reagenta (Invitrogen) smo določili na tretjem prehoda. V nekaterih poskusih, SV-40 imortalizirana mišjo mikro- endotelne celice (SVECs) gojimo v mediju Dulbeccovem modificiranem Eagle je (DMEM), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (FBS) in 1% penicilina /streptomicina. celično linijo SVEC je prijazno nadarjen dr KH Lan (Cancer Center, Taipei veteranov Splošne bolnišnice, Tajvan).

Honokiol je bilo pridobljeno iz WAKO Chemical Company (Osaka, Japonska), pa je bilo ugotovljeno, da je vsaj 99% -no čist s HPLC. smo uporabili različne koncentracije honokiol v tej študiji, odvisno od občutljivosti drog, ki ga IC50 vrednostmi, ki je naveden (20 mikronov AGS, 40 mikronov MKN45 in SCM-1). MKN45 in SCM-1 celice, ne pa AGS celice, se je izkazalo za učinkovito povzroči tumorje v model miške ksenogenskega tumorja.

Živali

Vse za nego živali in eksperimentalni postopki so bili odobreni in ki jih vodi Odbor za poskuse na živalih, National Chung Hsing University, Taichung, Tajvan (odobreni dokument NCHU-100-26). Štiri do šest tednov stare samce BALB /c golih miši so bile kupljene od NLAC (Taipei, Tajvan). Miši so redili in vzdrževati v skladu s posebnimi pogoji, brez patogenov, če s sterilizirano hrano in vodo ad libitum
in nahaja v pregrado objektu s 12 h cikla svetloba /tema.

ksenotransplantskih tumor Mouse Model

za oceno peritonealno metastaze, kultivirani človeške želodčne rakave celice (4~5 × 10 ^{6 celic) smo cepili v peritonealno votlino BALB /c golih miših [42]. Peritonealno tumorjev v golih miših so bili določeni za 7 dni po injekciji želodčnih rakavih celic, v katerih so bili tumorji so jih preverili nadzorom PET /CT. Nato smo miši intraperitonealno injicirali honokiol (5 mg /kg /dvakrat tedensko), za 28 dni. Učinek honokiol na peritonealne razširjanje je bila ocenjena s PET /CT. Navedba /slika napako metastaziranje je bil opisan na sliki 1. Nato smo miši žrtvovali pod anestezijo (pentobarbital) in mikroskopom pregledamo prisotnost peritonealno metastaz. Tumorji so izrezali, narežemo na bloke, ki so določene v 10% formalinu, in vgrajeni v parafinskih blokov ali snap-zamrznjene v tekočem dušiku.}

pozitron emisijska tomografija /Računalniška tomografija (PET /CT) Scanning

po najmanj 6 ur posta, so miši, ki so prejeli 7,4 MBq (0,2 MCI) odmerek ^{18F-FDG ustno pred izpiranjem z 1 ml vode. Miši smo anestezirali z Izofluran uparjalnika pred vsakim skeniranja. Poskusi za mala slikanje živali so bile izvedene s kombiniranim PET /CT (Discovery ST; GE Medical Systems). Uporabljena je bila multidetector vrstica spiralni CT skener. Tehnični parametri, ki se uporabljajo pri delu CT PET /CT so bili naslednji: CT tip skeniranje z 0,5-sekundnem polno vijačno skeniranje, konfiguraciji detektor zapored z 16 x 1,25 mm, intervalne prostor 2,75 mm debeline rezine 1,25 mm , smola za 1.75:1 (visoka način kakovosti), hitrost 17,5 mm na rotacijo, veliko polje-of-view (FOV), napetost 120 KVP in tok 200 mA. Tehnični parametri, ki se uporabljajo za del PET PET /CT so bili naslednji: 10,0 min pri vsaki postelji, je vidno polje izbrana za obnovo slikanje 20 cm in resolucija PET je bila približno 4,5 mm polna širina pri polovični največ (FWHM). V rekonstrukcijske parametri so vrsta 3D ponovitev kot 21 podskupin in 2 iteracij. Za oceno količinsko sposobnost /CT PET v majhnem slikanje živali, je bila regija obresti (ROI), nameščen na manjše FOV transaksialni PET slik v celoti obkrožajo področja FDG privzem v opazovanih tkivih ob izogibanju bližnje tkivo. Srednja vrednost dejavnosti vsake slikovne pike v vsaki ROI je bil posnet in izražene v Bq /ml.}

Chick horioalantoisnih Membrane Vsebnost ( CAM
Vsebnost)

Za preiskuje vivo
angiogensko aktivnost, modificiran piščančjih cela živalska CAM
testu je bila izvedena kot prej [43] opisano. Oplojenih chick jajca inkubiramo v stalno navlažen jajčni žlahtnitelja pri 37 ° C. Na 3 dneh inkubacije, smo chick zarodkov prenesemo v posodo kulture. Dvajset xl od honokiol ujetega v kolagena tipa I zmes nanesemo na premaznih diskov in polimerizirani s segrevanjem. Lističi so bili naloženi na CAM
6 dni starih zarodkov. Po 24-h inkubacije, je bilo območje okoli naloženega diska fotografirali z digitalnim fotoaparatom Nikon, in število novonastalih plovil je prešteti dva opazovalca v dvojno slepih način. Testi za vsak testni vzorec so bile opravljene z uporabo 10-13 jajc.

Študiie Plug Vsebnost

Nude miši ali C57BL /6 miši smo subkutano injicirali 0,6 ml Matrigel vsebuje navedeno količino kapsaicina 100 ng VEGF in 10 enot heparina. Vložen Študiie hitro oblikovali enoten in trden gel vtič. Po 7-21 dneh, je bila koža z miško enostavno potegnil nazaj, da odkrijete Matrigel vtikač, ki je ostala nedotaknjena. Hemoglobin je bila izmerjena po metodi Drabkin in Drabkin reagenta komplet 525 (Sigma, St Louis, MO) za kvantifikacijo nastajanja krvnih žil. Koncentracija hemoglobina izračunamo iz znane količine hemoglobina preizkušene vzporedno. Slike so bile fotografirali z digitalnim fotoaparatom Nikon, je prešteti število novonastalih mikro plovil.

ex vivo
aortne Ring Vsebnost

Aorte so bili izolirani od 6 -week starih Sprague-Dawley. Plošče (48 vdolbinami) prekrijemo s 120 p.L v Matrigel. Aorte izoliranih iz miši očistiti periadventitial maščobe in vezivnega tkiva, in narežemo na ~1 mm dolge do 1,5 mm dolgih obročev. Po speremo petkrat z endotelija medij, ki temelji na celice, so Aorte postavi na-Matrigel pokrita vodnjakov in prekrita s še 100 ml v Matrigel. Honokiol ali vozilo dodamo v jamice v končnem volumnu 250 xl medija.

• Plos ONE: Razmerje med negativnimi in pozitivnimi bezgavk je primerna za ovrednotenje Prognoza Rak želodca bolnikov s pozitivnim Node Metastasis
• Plos ONE: Visoko γ-sevanjem občutljivost je povezana z večjim Rak želodca Tveganje v kitajski Han Prebivalstvo: primera-Control Analysis