PLOS ONE: MicroRNA-410 Undertrycker migration och invasion genom att rikta MDM2 i Gastric Cancer

Abstrakt

Gastric cancer är en av de vanligaste maligniteter i tumörer i östasiatiska länder. Att identifiera exakta prognostiska markörer och effektiva terapeutiska mål är viktigt vid behandling av gastrisk cancer. mikroRNA (miRNA) spelar en viktig roll i tumörbildning. De mekanismer genom vilka miRNAs reglerar magcancer metastaser fortfarande dåligt kända. I denna studie fann vi att nivåerna av miR-410 i magcancer och cellinjer var mycket lägre än i den normala kontrollen, respektive, och den lägre nivån av MIR-410 var signifikant associerade med lymfkörtelmetastaser. Transfektion av MIR-410 härmar kan hämma celltillväxt, migration och invasion i HGC-27 gastric cancercellinjer. I motsats, knockdown av MIR-410 hade motsatt effekt på celltillväxt, migration och invasion. Dessutom fann vi även att MDM2 negativt reglerades av MIR-410 vid posttranskriptionsnivå, via ett specifikt målställe med 3'UTR av luciferas reporter analys. Uttrycket av MDM2 var omvänt korrelerad med MIR-410 uttryck i magcancer vävnader, och överuttryck av MDM2 i MIR-410-transfekterade gastric cancerceller räddade effektivt hämning av celltillväxt och invasion som orsakas av MIR-410. Således föreslog våra fynd att MIR-410 fungerade som en ny tumörsuppressor genom att fokusera på MDM2-genen och hämma gastric cancerceller proliferation, migration och invasion. Resultaten av denna studie har bidragit till den nuvarande förståelse av dessa funktioner från Mir-410 i magcancer

Citation. Shen J, Niu W, Zhou M, Zhang H, Ma J, Wang L, et al. (2014) MicroRNA-410 Undertrycker migration och invasion genom att rikta MDM2 i magcancer. PLoS ONE 9 (8): e104510. doi: 10.1371 /journal.pone.0104510

Redaktör: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, USA

Mottagna: 6 maj 2014. Accepteras: 9 juli 2014. Publicerad: 19 aug 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet. Det författarna bekräftar att all data som ligger till grund resultaten är helt utan begränsning. Alla relevanta uppgifter finns inom pappers- och dess stödjande information filer

Finansiering:. Anhui Provincial Natural Science Foundation (. NO 1208085QH169) http://220.178.98.52/zrkxjj/. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Olika strategier har använts för att behandla magcancer (GC), som är den fjärde mest förekommande cancer och den andra ledande orsaken till dödsfall i cancer i världen [1], [2]. De flesta GC patienter diagnostiseras i stadium III eller IV, och graden av lymfkörteln metastaser är hög [3], [4]. Numera patienter med långt framskriden GC med en total 5 års överlevnad appoximately 20% [5]. Därför är det av stort kliniskt värde att ytterligare belysa molekylära mekanismer som är involverade i GC metastaser och att identifiera nya markörer för diagnos, prognos och behandling för patienter med GC.

mikroRNA (miRNA) är små icke-kodande RNA av ~ 22 nukleotider i längd som reglerar uttrycket av sina mål mRNA genom translationell repression eller mRNA klyvning [6]. De är inblandade i viktiga biologiska processer, inklusive utveckling och differentiering [7], [8]. Den dysreglering av miRNA är korrelerad till spela en viktig roll vid cancerutveckling och progression genom reglering av cellproliferation, differentiering, apotosis och carcinogesis [9], [10]. Onormalt uttryck av miRNA eller mutationer av miRNA gener har väl undersökts i många typer av tumörer, innefattande lymfom, lung-, pankreas-, leukemi, bröst, kolon och lever cancer [11] - [15]. Emellertid roller miRNA i GC förblir till stor del okända.

Tidigare studier har undersökt rollen av MIR-410 i flera cancerformer. Gattolliat et al [16] .demonstrated att uttrycket av MIR-410 signifikant associerad med sjukdomsfria överlevnaden av de icke-förstärkta gynnsam neuroblastom. Vidare, Chen på el [17] fann att uttrycket av MIR-410 reducerades i humana gliom och tvångs uttryck av MIR-410 i gliomceller starkt hämmade celltillväxt, invasion förmedlad genom att rikta MET. Dessutom Chien et al [18] fann att MIR-410 regleras pRb /E2F vägen negativt med direkt inriktning CDK1 som var en onkogen i bröstcancer. Förblir emellertid den roll som miR-410 i GC fortfarande oklart. I denna studie visade vi att minskad MIR-410 uttryck är en karaktäristisk molekyl förändring i GC och undersökte effekten av module miR-410 nivåer på fenotyper av GC cellinjer. Vi visade också att MIR-410 kan fungera som en onkogen genom att direkt rikta MDM2.

Material och metoder

Etik Statement

Alla dessa patienter gick med på att delta i studien och gav skriftligt informerat samtycke. Både denna studie och samtycke godkändes av etiska styrelsen för Anhui Provincial Hospital och följt med Helsingforsdeklarationen.

Mänskliga prov

Human GC och deras motsvarande icke-tumörgastriska prover samlades in vid tidpunkten för kirurgisk resektion från Anhui Provincial Hospital från 2008 till 2009. skriftligt informerat samtycke erhölls före samlingen. Den ena delen fixerades med 10% formalin för histopatologisk diagnos, och den andra var omedelbart snabbfrystes i flytande kväve och lagrades vid -196 ° C i flytande kväve tills RNA extraherades. Användning av mänskliga vävnader godkändes av Clinical Research etikkommitté Anhui Provincial Hospital.

Cellodling

SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 och HEK293T celler köpt från Shanghai Institute of biokemi och cellbiologi vid Chinese Academy of Sciences. Gastric epitel-en cell (GES) erhölls från Shanghai Ruijin Hospital i Shanghai Jiaotong University School of Medicine. SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 och GES bibehölls i RPMI1640 och HEK293T bibehölls i Dulbeccos modifierade Eagles medium medier. Media kompletterades med 10% fetalt bovint serum. Cellerna inkuberades vid 37 ° C i en befuktad kammare innehållande 5% koldioxid.

Plasmider och celltransfektion

MIR-410 härma /inhibitor och kontrollerna köptes från RiboBio (Guangzhou, Kina). De HGC-27-celler såddes i sex-brunnars plattor vid 30% sammanflytning en dag före transfektion. Transfektion med MIR-410 härma /hämmare eller kontrollerna genomfördes med hjälp av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Transfektion komplex framställdes enligt tillverkarens anvisningar.

QRT-PCR

För QRT-PCR-analyser, extraherades totalt RNA från celler med TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Omvänd transkription utfördes med PrimeScript RT reagenskit med gDNA suddgummi (Takara) enligt tillverkarens anvisningar. Uttrycket av MIR-410 bekräftades av den förändrade stemloop RT-PCR med specifika RT och PCR-primers. U6 snRNA användes som en endogen kontroll. RT-reaktioner utfördes med användning av RNA-fraktion med Promega RT Kit enligt tillverkarens protokoll. PCR-betingelser utfördes genom denaturering av DNA vid 94 ° C under 4 min, följt av 40 cykler av amplifiering: 94 ° C under 40 s, 52 ° C under 40 s, 72 ° C under 40 s för att samla data. Kvantitativ PCR utfördes på en ABI 7500 thermocycler (Applied Biosystems) med användning av SYBR Premix Ex Taq (Perfect Realtid) Kits (TaKaRa, Japan) i enlighet med tillverkarens instruktioner.

Cellproliferationsanalys

totalt 10 ^{4-celler per brunn ströks ut i 96-brunnsplattor före transfektion och odlades under 24 timmar i normala förhållanden. De transfekterades sedan med MIR-410 härma eller anti-MIR-410-hämmare tillsammans med parade negativa kontroller. Cell proliferation bedömdes med hjälp av cellräkning Kit 8 (Dojindo, Tokyo, Japan) enligt tillverkarens protokoll.}

Cellmigration och invasion analys

För migrationsanalyser, 5 x 10 ^{4-celler tillsattes i den övre kammaren av insatsen (BD Bioscience, 8 | im porstorlek). För invasionsanalyser, 1 x 10 5 celler tillsattes i den övre kammaren av insatsen förbelagts med Matrigel (BD Bioscience). I båda analyserna, ströks cellerna i medium utan serum, och medium innehållande 10% FBS i den undre kammaren tjänade som chemoattractant. Efter flera timmars inkubation ades cellerna som inte migrerar eller invadera genom porerna noggrant utplånades med vadd. Då skären färgades med 20% metanol och 0,2% kristallviolett, avbildas, och räknades med en IX71 inverterat mikroskop (Olympus).}

Western blot-analys

Proteiner separerades på SDS-polyakrylamid gelelektrofores och överfördes till nitrocellulosamembran (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membranet blockerades med 5% fettfri mjölk och inkuberades med kanin-anti-MDM2 monoklonal antikropp (1:1000; Cell Signa Technology, Danvers, MA, USA) och den mus-anti-b-GAPDH monoklonal antikropp (1:10000; Sigma). Proteinerna detekterades med förstärkt kemiluminescens reagens (Pierce, Rockford, IL, USA).

Luciferase reporter assay

HEK293T celler ströks in i 96-brunnsplattor. Efter 24-h inkubation, en blandning av 100-ng pLUC 3'UTR, 5-pmol negativ kontroll, MIR-410 härma samtransfekterades med 20 ng.

Renilla i HEK293T celler med hjälp av Lipofectamine 2000. Fyrtioåtta timmar efter transfektion, firefly och Renilla luciferas aktiviteter mättes med Dual-Luciferase Reporter System (Promega, Madison, WI, USA). Transfektionseffektiviteten normaliserades genom samtransfektion med en Renilla reportervektor.

Statistisk analys

Data presenterades som medel ± standardavvikelse på minst tre experiment. Statistisk analys utfördes med hjälp av SPSS 15,0. En en-vägs variansanalys (ANOVA) test och Students t-test användes för statistisk analys. Ett värde på p. ≪ 0,05 ansågs indikera en statistisk analys

Resultat

Uttryck av MIR-410 var betydligt nedregleras i GC cell- och vävnads

För att bedöma rollen av mIR-410 i GC, utvärderade vi uttrycket av mIR-410 i GC-cellinje, vävnader och deras anpassade normala vävnader med användning av kvantitativ RT-PCR. Vi fann att miR-410-nivåer var ofta nedreglerade i GC-cellinjer jämfört med GES. Figur 1B visar att Mir-410 nivåer nedregleras i GC vävnader jämfört med dem i matchade normala vävnader. Den genomsnittliga expressionsnivån i karcinomvävnader (kombination) var signifikant högre jämfört med deras intilliggande icke-neoplastiska vävnader (Figur 1C). Vi visade också att uttrycket av MIR-410 i metastaser GC vävnader var lägre än i icke-metastaser vävnader (Fig. 1D).

MIR-410 inhiberade GC celltillväxt, migration och invasion

Halterna av MIR-410 ökade signifikant i GC-celler som transfekterades med MIR-410 härmar och Mir-410 nivåer minskade som behandlades med MIR-410-inhibitor (Fig. 2A). Uppreglering av MIR-410 inhiberade GC celltillväxt; däremot knockdown av MIR-410 hade motsatt effekt på celltillväxt (fig. 2B). Dessutom transwell assay och invasionsanalys visade att den migrerade och invasivitet hos celler transfekterade med MIR-410 härmar dramatiskt minskade jämfört med kontrollen och obehandlade celler. Vi visade också att den migrerade och invasivitet hos celler transfekterade med MIR-410-inhibitor var dramatiskt ökade jämfört med kontrollen och obehandlade celler. (Fig. 2C och D).

MIR-410 direkt riktade MDM2 i GC

Som förutspått av PicTar fanns komplementaritet mellan har-MIR-410 och MDM2 3'-UTR (Fig . 3A). För att visa att MIR-410 reglerar direkt MDM2, använde vi en dubbel-luciferas reportersystem. Vi fann att samexpression av MIR-410 undertryckte signifikant firely luciferas reporter aktiviteten hos vild-typ MDM2 3'UTR men inte mutant 3'UTR (Fig. 3B). Överuttryck av MIR-410 reducerade uttrycket av MDM2-mRNA och protein (Fig. 3C och D).

uttryck av MDM2 inpaired miR-410-inducerad hämning av invasion i GC-celler

Vi utförde räddningsförsök efter transfektion av 3'UTR-negativa MDM2 tillsammans med mIR-410. Som väntat, transfektion med pcDNA3.1-MDM2 lindras minskning av MDM2 resulterade från MIR-410 härma behandling (Fig. 4A). I samförstånd med uttryck av målproteiner, transfektion med pcDNA3.1-MDM2 mildras hämningen av cell förstärkning (Fig. 4B) och ökningen av invasiva celler (Fig. 4C) resulterade från MIR-410 härma behandling.

MDM2 var omvänt uttryckt med mIR-410 i GC

för att ytterligare belysa förhållandet mellan mIR-410 och MDM2 uttryck i delprov, vi först upptäckt MDM2 i GC-cellinjer. Såsom visas i fig. 5A och 5B, mRNA och proteinuttryck av MDM2 var mycket higer i de fyra GC cellinjer än i GES. Vi fann också att uttrycket av MDM2 i GC vävnader var signifikant högre än i motsvarande angränsande normala vävnader (Fig. 5C). Den punktdiagram och korrelationsanalys Pearson visade vidare att MIR-410 uttryck negativt korrelerad med målproteinet nivåerna i GC prov (Fig. 5D). Dessa data tyder på att den minskade miR-410 uttryck relaterade till de ökade MDM2 nivåer i de flesta GC patienterna.

Diskussion

miRNAs har fungerat som viktiga regulatorer av genuttryck på posten -transcriptional nivå och reglera ett brett spektrum av fysiologiska och utvecklingsprocesser [6], [19], [20]. Monterings bevis tyder på att förändringar i uttrycket av miRNA bidrar till patogenesen av de mänskliga cancer, som de kan fungera som antingen onkogener eller tumörsuppressorer [21], [22]. Nyligen ackumulerande data indikerar att miRNA är inblandade i flera viktiga biologiska händelser såsom tumörbildning och cancermetastaser [23], [24]. I den aktuella studien undersökte vi den biologiska roll miR-410 i humant GC tumörbildning. Våra resultat visade att MIR-410 var ofta nedregleras i human GC och att dess nedreglering var signifikant associerade med kliniskt stadium och lymfkörtel metastas. Påtvingad uttryck av MIR-410 skulle kunna öka spridningen, migration och invasion av GC-celler linjen in vitro. Vi identifierade vidare MDM2, en förmodad tumörsuppressorgen, som en direkt funktionell mål av MIR-410. Såvitt vi vet är detta den första studien för att undersöka betydelsen av MIR-410 i GC, och våra resultat indikerade att MIR-410 fungerade som en ny onkogen i GC.

Avreglering av MIR-410 är en frekvent händelse i olika cancerformer, vilket antyder att miR-410 kan spela en viktig roll i tumörbildning och tumörprogression. Gattolliat och kollegor visar att MIR-410 uttryck var signifikant associerad med sjukdomsfria överlevnaden av de icke-förstärkta gynnsam neuroblastom [16]. Vidare, Chen [17] fann att MIR-410 uttryck reducerades i humana gliom och tvingade miR-410 uttryck i gliomceller starkt hämmade celltillväxt, invasion förmedlad genom att rikta MET. Emellertid har uttryck och funktion av MIR-410 GC utveckling inte rapporterats. I denna studie identifierade vi uttrycket av MIR-410 i flera GC-cellinjer och GES använder QRT-PCR. Uttrycket av MIR-410 var signifikant ökat i alla fyra GC cellinjer jämfört med i GES. Dessutom resultaten från den kliniska GC vävnad bekräftade också att MIR-410 var ned-regleras i GC vävnader jämfört med de parade icke-cancer angränsande vävnader, vilket tyder på dess möjliga inblandning i både onkogen transformation och tumörmetastaser. Vi bekräftade senare att hämning av MIR-410 kraftigt främjas GC celltillväxt, migration och invasion in vitro.

Vi utfors vidare den molekylära mekanismen bakom roll miR-410 och identifieras MDM2 som en direkt funktionell nedströms mål av mIR-410 i GC-celler. Bioinformatik tillvägagångssätt, som användes för att förutsäga mål av miRNA, markerade en hög fri energi frö match på väl bevarade miRNA-bindningsställe och dess mål mRNA, men specificitet förblev ett problem att definiera mål för många miRNA. Sålunda överuttryck av en miRNA kunde nedreglera expressionen av målproteinet. Komplementär sekvens av MIR-410 identifieras i 3'UTR av MDM2 mRNA. Vidare visade vi att miR-410 är inriktad direkt 3'UTR av MDM2, som dess överuttryck var associerat med hämning av luciferasaktivitet. Dessutom har en betydande nedreglering av nivån av MDM2-protein observeras efter MIR-410 uttryck, vilket indikerar posttranskriptionell reglering av MDM2 via rikta sin 3'UTR. Dessa resultat indikerade att miR-410 kan fungera som en tumörsuppressor delvis medieras genom att undertrycka miR-410-expression i GC utveckling.

MDM2 är en onkogen som först upptäcktes i ett lokus amplifieras på dubbla minuten kromosomer i en tumörframkallande muscellinje (3T3-DM) [25]. Den huvudsakliga funktionen för MDM2 är att hämma p53 bioaktivitet genom att blockera transkriptionsaktiviteten för p53 och främja p53 proteinnedbrytning [26] - [28]. Höga MDM2 nivåer minskade p53 proteinnivåer och kan dämpa p53-funktion, vilket ökade risken för cancer och /eller accelererad tumörbildning och progression [29]. Den MDM2 onkogen spelat en viktig roll i cancerutveckling [30]. Överuttryck av MDM2 i tumörceller inducerade celltillväxt, hämmar cell apoptos [31]. Flera studier har visat att MDM2 uttryck var associerad med dålig överlevnad och var en användbar prediktiv faktor för dålig prognos hos människor med hepatocellulär cancer och bröstkarcinom [32], [33]. Dessutom har den aktuella studien fann att MDM2 uttrycktes på högre nivåer i GC vävnader än i icke-cancer magslemhinnan och MDM2 uttryck i samband med clinicopathologic funktioner hos patienter som behandlats endast med kirurgi [34], [35]. Dessutom knockdown av MDM2 eller överuttryck av JWA har synergistisk effekt på undertryckande av magcancer celltillväxt och migration [35]. Emellertid, är fortfarande okänd mekanismen hur MDM2 var överuttryck. Dessa resultat tydde på att förmågan hos MIR-410 för att rikta MDM2 kan tillhandahålla en sådan mekanism av post-transkriptionell kontroll av MDM2.

Sammanfattningsvis har våra resultat visade att miR-410 var signifikant nedreglerade i GC celler och vävnader. Påtvingad uttryck av MIR-410 ökade GC celltillväxt, migration och invasion genom direkt inriktning MDM2. Dessa fynd tyder på att denna nya miR-410 /MDM2 axel ger ny insikt i mekanismerna bakom tumörmetastaser, och förtryck av MIR-410 uttryck kan vara en potentiell terapeutisk strategi för behandling av GC i framtiden.

Stöd Information
Tabell S1.
clinicopathologic karakteristika hos patienter med GC
doi:. 10,1371 /journal.pone.0104510.s001
(DOCX) Review tabell S2.
Primer sekvensen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0104510.s002
(DOCX) Review

• PLOS ONE: Analys av Lymph Node metastaser Korrelation med prognosen i patienter med T2 Gastric Cancer
• PLOS ONE: associering mellan mejeriintag och Gastric Cancer: en metaanalys av observationsstudier