PLOS ONE: microARN-410 Supprime la migration et l'invasion par ciblage MDM2 dans le cancer gastrique

Résumé

Le cancer gastrique est l'une des tumeurs malignes les plus fréquentes dans les tumeurs dans les pays d'Asie orientale. L'identification des marqueurs de pronostic précis et des cibles thérapeutiques efficaces est important dans le traitement du cancer gastrique. microARN (miARN) jouent un rôle important dans la tumorigenèse. Cependant, les mécanismes par lesquels miARN régulent les métastases du cancer de l'estomac sont encore mal compris. Dans cette étude, nous avons constaté que les niveaux de miR-410 dans des lignées cancéreuses et cellules gastriques étaient beaucoup plus faibles que dans le contrôle normal, respectivement, et le niveau inférieur de miR-410 était significativement associée à des ganglions lymphatiques métastases. La transfection de miR-410 mimétiques pourrait inhiber de manière significative la prolifération cellulaire, la migration et l'invasion des HGC-27, des lignées cellulaires de cancer gastrique. En revanche, knockdown de miR-410 a eu l'effet inverse sur la prolifération cellulaire, la migration et l'invasion. De plus, nous avons également constaté que MDM2 a été régulée négativement par miR-410 au niveau post-transcriptionnel, par l'intermédiaire d'un site cible spécifique avec le 3'UTR par dosage de rapporteur de la luciférase. L'expression de MDM2 a été inversement corrélée à l'expression de miR-410 dans des tissus de cancer de l'estomac, et la surexpression de MDM2 dans des cellules de cancer gastrique miR-410 transfectées efficacement secouru l'inhibition de la prolifération et l'invasion cellulaire provoquée par miR-410. Ainsi, nos résultats suggèrent que miR-410 a agi comme un nouveau gène suppresseur de tumeur en ciblant le gène MDM2 et d'inhibition des cellules cancéreuses gastriques prolifération, la migration et l'invasion. Les résultats de cette étude ont contribué à la compréhension actuelle de ces fonctions de miR-410 dans le cancer gastrique

Citation:. Shen J, Niu W, Zhou M, Zhang H, Ma J, Wang L, et al. (2014) microARN-410 Supprime la migration et l'invasion par ciblage MDM2 dans le cancer gastrique. PLoS ONE 9 (8): e104510. doi: 10.1371 /journal.pone.0104510

Editeur: Jin Cheng Q., H.Lee Moffitt Cancer Center & Institut de recherche, Etats-Unis d'Amérique

Reçu: 6 mai 2014; Accepté 9 Juillet 2014; Publié: 19 Août, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Shen et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données:. La auteurs confirment que toutes les données sous-jacentes les résultats sont entièrement disponibles sans restriction. Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

Financement:. Anhui Fondation provinciale des sciences naturelles (. NO 1208085QH169) http://220.178.98.52/zrkxjj/. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

Différentes stratégies ont été utilisées pour le traitement du cancer gastrique (GC), qui est le quatrième cancer le plus répandu et la deuxième cause de décès par cancer dans le monde [1], [2]. La plupart des patients du GC est diagnostiqué au stade III ou IV, et le taux de métastases ganglionnaires est élevé [3], [4]. De nos jours, les patients avec le GC stade avancé sont avec la survie de l'ensemble 5 année de appoximately 20% [5]. Cet effet, il est d'une grande valeur clinique pour élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans la métastase GC et d'identifier de nouveaux marqueurs pour le diagnostic, le pronostic et le traitement pour les patients avec GC.

microARN (miARN) sont de petite taille non codantes les ARN de ~22 nucléotides de longueur qui régulent l'expression des ARNm cibles par la répression traductionnelle ou clivage de l'ARNm [6]. Ils sont impliqués dans les processus biologiques essentiels, y compris le développement et la différenciation [7], [8]. La dysrégulation de miARN est corrélée à jouer un rôle important dans le développement du cancer et à la progression de la régulation de la prolifération cellulaire, la différenciation, l'apoptose et carcinogesis [9], [10]. l'expression aberrante des miARN ou des mutations de gènes de miARN ont été bien étudiés dans de nombreux types de tumeurs, y compris le lymphome, le poumon, le pancréas, la leucémie, du sein, du côlon et des cancers du foie [11] - [15]. Cependant, le rôle des miARN dans GC demeurent largement inconnus.

Des études antérieures ont étudié le rôle de miR-410 dans plusieurs cancers. Gattolliat et al [16] .demonstrated que l'expression de miR-410 était significativement associée à la maladie sans survie du neuroblastome non amplifié favorable. En outre, Chen à el [17] a révélé que l'expression de miR-410 a été réduite dans les gliomes humains et a forcé l'expression de miR-410 dans des cellules de gliome fortement inhibé la prolifération cellulaire, l'invasion à médiation par le ciblage MET. En outre, Chien et al [18] ont trouvé que miR-410 régulée négativement pRb /E2F voie en ciblant directement CDK1 qui est un oncogène du cancer du sein. Cependant, le rôle de miR-410 en GC reste encore incertain. Dans cette étude, nous avons démontré que la diminution de l'expression de miR-410 est un changement moléculaire caractéristique GC et étudié l'effet de modulation miR-410 niveaux sur les phénotypes des lignées de cellules de GC. Nous avons également montré que miR-410 peut fonctionner comme un oncogène en ciblant directement MDM2.

Matériel et méthodes de

Déclaration
éthique

Tous ces patients ont accepté de participer à l'étude et a donné un consentement éclairé écrit. Tant cette étude et le consentement ont été approuvés par le comité d'éthique de l'hôpital provincial de l'Anhui et du respect de la Déclaration d'Helsinki.

Les échantillons humains

GC humaine et leurs échantillons gastriques non-tumoraux correspondants ont été recueillies au moment de la résection chirurgicale de l'hôpital provincial de l'Anhui de 2008 à 2009. le consentement éclairé écrit a été obtenu avant la collecte. Une partie a été fixé avec 10% de formaline pour le diagnostic histopathologique, et l'autre a été immédiatement snap-congelé dans l'azote liquide et stocké à -196 ° C dans de l'azote liquide jusqu'à ce que l'ARN a été extrait. L'utilisation de tissus humains a été approuvé par le Comité d'éthique de la recherche clinique de l'hôpital provincial de l'Anhui.

SGC-7901 Cell culture, HGC-27, MGC-803, MKN-45 et des cellules HEK293T ont été acheté auprès de l'Institut de Shanghai de biochimie et de biologie cellulaire à l'Académie chinoise des sciences. Gastric épithéliale-1 cellule (GES) a été obtenu à partir de l'hôpital de Shanghai Ruijin de Shanghai University School of Medicine Jiaotong. CGS-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 et GES ont été maintenues dans du RPMI1640 et HEK293T a été maintenue dans un milieu support de Eagle modifié par Dulbecco. Le milieu a été supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 10%. Les cellules ont été incubées à 37 ° C dans une chambre humidifiée contenant 5% de dioxyde de carbone.

Plasmides et transfection de cellules

miR-410 mimétique /inhibiteur et les contrôles ont été achetés auprès RiboBio (Guangzhou, Chine). Les cellules HGC-27 ont été ensemencées dans des plaques à six puits à une confluence de 30% un jour avant la transfection. Transfection avec miR-410 mimique /inhibiteur ou les contrôles a été effectué en utilisant Lipofectamine 2000 réactif (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). complexes de transfection ont été préparés selon les instructions du fabricant.

qRT-PCR

Pour les essais qRT-PCR, l'ARN total a été extrait des cellules avec un réactif Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Une transcription inverse a été réalisée avec le kit de réactifs PrimeScript température ambiante avec une gomme ADNg (Takara) selon les instructions du fabricant. L'expression de miR-410 a été vérifiée par le stemloop modifié par RT-PCR avec des amorces RT et PCR spécifiques. U6 snRNA a été utilisé comme un contrôle endogène. Les réactions de RT ont été effectuées en utilisant la fraction d'ARN avec le kit Promega RT suivant le protocole du fabricant. Les conditions de PCR ont été réalisées par dénaturation de l'ADN à 94 ° C pendant 4 min, puis 40 cycles d'amplification: 94 ° C pendant 40 s, 52 ° C pendant 40 s, 72 ° C pendant 40 s pour la collecte des données. PCR quantitative a été réalisée sur un ABI 7500 thermocycleur (Applied Biosystems) en utilisant SYBR Premix Taq Ex (Perfect Real Time) Kits (Takara, Japon) selon les instructions du fabricant.

Cellule Essai de prolifération

Un total de 10 ^{4 cellules par puits ont été étalées dans des plaques à 96 puits avant la transfection et cultivées pendant 24 h dans des conditions normales. Ils ont ensuite été transfectées avec miR-410 mimique ou anti-miR-410 inhibiteur ainsi que des contrôles négatifs appariés. La prolifération cellulaire a été évaluée à l'aide du kit de cellule de comptage 8 (Dojindo, Tokyo, Japon) selon le protocole du fabricant.}

La migration cellulaire et l'invasion test

Pour les essais de migration, 5 x 10 ^{4 cellules ont été ajoutées dans la chambre supérieure de l'insert (BD Bioscience, 8 um de taille des pores). Pour les essais d'invasion, 1 × 10 5 cellules ont été ajoutés dans la chambre supérieure de l'insert prérevêtue avec Matrigel (BD Bioscience). Dans les deux essais, les cellules ont été étalées dans du milieu sans sérum et un milieu contenant 10% de FBS dans la chambre inférieure ont servi chimioattractive. Après plusieurs heures d'incubation, les cellules qui ne migrent ou envahissent à travers les pores ont été soigneusement balayés avec de la laine de coton. Ensuite, les inserts ont été colorées avec 20% de méthanol et 0,2% de cristal violet, imagées, et comptées avec un IX71 microscope inversé (Olympus).}

Western blot analyse

Les protéines ont été séparées sur SDS-polyacrylamide électrophorèse sur gel et transféré à la membrane de nitrocellulose (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). La membrane a été bloquée avec 5% de lait non gras et incubée avec l'anticorps anti-MDM2 anticorps monoclonal de lapin (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) et l'anticorps monoclonal anti-b-GAPDH souris (1:10000; Sigma). Les protéines ont été détectés avec des réactifs améliorés de chimioluminescence (Pierce, Rockford, IL, USA).

luciférase reporter test

cellules HEK293T ont été étalées dans des plaques à 96 puits. Après 24 heures d'incubation, un mélange de 100 ng Pluc 3'UTR, 5 pmol contrôle négatif, miR-410 mimétique a été cotransfecté avec 20 ng.

Renilla dans des cellules HEK293T utilisant Lipofectamine 2000. Quarante-huit heures après la transfection, la luciole et les activités de luciférase Renilla ont été mesurées avec le Dual-Luciferase Reporter système (Promega, Madison, WI, USA). L'efficacité de transfection a été normalisé par cotransfection avec un vecteur rapporteur Renilla.

L'analyse statistique

Les données ont été présentées comme le moyen ± écart-type d'au moins trois expériences. L'analyse statistique a été réalisée en utilisant SPSS 15.0. Une analyse simple de la variance (ANOVA) de test et le test t de Student ont été utilisés pour l'analyse statistique. Une valeur de p <. 0,05 a été considérée comme indiquant une analyse statistique

Résultat

L'expression de miR-410 était significativement régulée à la baisse dans la cellule de GC et de tissus

Pour évaluer le rôle de miR-410 dans le GC, on a évalué l'expression de miR-410 dans la lignée cellulaire GC, les tissus et les tissus normaux appariés à l'aide de RT-PCR quantitative. Nous avons constaté que miR-410 niveaux étaient souvent régulés à la baisse dans les lignées cellulaires du GC par rapport aux GES. Figure 1B montre que les niveaux de miR-410 ont été régulés à la baisse dans les tissus du GC par rapport à ceux dans les tissus normaux appariés. Le niveau moyen d'expression dans les tissus de carcinome (combinaison) était significativement plus élevé par rapport à leurs tissus non néoplasiques adjacents (figure 1c). Nous avons également montré que l'expression de miR-410 dans les tissus de métastases du GC est plus faible que dans les tissus non métastases (Fig. 1D).

miR-410 a inhibé la prolifération des cellules GC, la migration et l'invasion

les niveaux de miR-410 ont été significativement augmentés dans les cellules du GC qui ont été transfectées avec miR-410 imite et les niveaux miR-410 ont été réduits qui ont été traités avec l'inhibiteur de miR-410 (Fig. 2A). Régulation à la hausse miR-410 GC a inhibé la prolifération cellulaire; En revanche, knockdown de miR-410 a eu l'effet opposé sur la prolifération des cellules (Fig. 2B). En outre, l'essai de dosage Transwell et l'invasion a montré que la migrée et l'invasivité de cellules transfectées avec miR-410 mimétiques a été considérablement diminué par rapport au témoin et les cellules non traitées. Nous avons également montré que la migrée et l'invasivité des cellules transfectées avec miR-410 inhibiteur a été considérablement augmenté par rapport à la commande et les cellules non traitées. (Fig. 2C et D).

MDM2 miR-410 directement ciblé dans GC

Comme prévu par PicTar, il y avait complémentarité entre a-miR-410 et MDM2 3'-UTR (Fig . 3A). Pour démontrer que miR-410 régule directement MDM2, nous avons utilisé un système rapporteur dual-luciférase. Nous avons découvert que la co-expression de miR-410 a supprimé de manière significative l'activité Firely rapporteur de la luciférase de type sauvage, mais pas MDM2 3'UTR du mutant 3'UTR (Fig. 3B). La surexpression de miR-410 a réduit l'expression de MDM2 ARNm et la protéine (Fig. 3C et D).

surexpression de MDM2 inpaired inhibition de l'invasion miR-410-induite dans les cellules du GC

Nous avons effectué expériences de sauvetage par transfection de MDM2 3'UTR négatif avec miR-410. Comme on s'y attendait, la transfection avec le vecteur pcDNA3.1 MDM2 atténué la réduction de MDM2 a résulté de miR-410 mimétique de traitement (Fig. 4A). En accord avec l'expression des protéines cibles, la transfection avec le vecteur pcDNA3.1-MDM2 a atténué l'inhibition de l'amplification des cellules (Fig. 4B) et l'augmentation des cellules invasives (fig. 4C) résulte de miR-410 traitement mimétique.

MDM2 était inversement exprimé par miR-410 dans

Pour élucider la relation entre miR-410 et l'expression de MDM2 dans des échantillons primaires, nous avons d'abord détecté MDM2 GC dans les lignées cellulaires du GC. Comme on le voit sur la Fig. 5A et 5B, l'ARNm et l'expression de protéine de MDM2 a été beaucoup higer dans les quatre lignées cellulaires GC que celui du Ges. Nous avons également constaté que l'expression de MDM2 dans des tissus GC était significativement plus élevée que dans les tissus normaux adjacents correspondants (fig. 5C). Le diagramme de dispersion et de l'analyse de corrélation de Pearson ont en outre montré que l'expression de miR-410 a été négativement corrélé avec les niveaux de protéine cible dans les échantillons de GC (Fig. 5D). Ces données suggèrent que le miR-410 diminution de l'expression est liée aux niveaux MDM2 a augmenté dans la plupart des patients du GC.

Discussion

miARN ont agi en tant que régulateurs importants de l'expression des gènes au poste niveau et -transcriptional réguler une large gamme de processus physiologiques et de développement [6], [19], [20]. preuves de montage suggèrent que des altérations de l'expression des miARN contribuent à la pathogenèse des cancers les plus humains, qu'ils peuvent agir soit comme oncogènes ou suppresseurs de tumeur [21], [22]. Récemment, les données indiquent que l'accumulation miARN sont impliqués dans plusieurs événements biologiques importants tels que la tumorigenèse et le cancer métastatique [23], [24]. Dans la présente étude, nous avons étudié le rôle biologique de miR-410 dans la tumorigenèse GC humaine. Nos résultats ont démontré que miR-410 était souvent régulé à la baisse en GC humaine et que sa régulation à la baisse a été associée de manière significative avec le stade clinique et métastase ganglionnaire. expression forcée de miR-410 pourrait augmenter la prolifération, la migration et l'invasion de la ligne de cellules GC in vitro. Nous avons en outre identifié MDM2, un gène suppresseur de tumeur putatif, comme une cible fonctionnelle directe de miR-410. À notre connaissance, cette étude est la première à explorer le rôle de miR-410 en GC, et nos résultats indiquent que miR-410 a agi comme un nouveau oncogène en GC.

Déréglementation de miR-410 est un fréquent cas dans divers cancers, ce qui suggère que miR-410 peut jouer un rôle important dans la tumorigenèse et la progression tumorale. Gattolliat et ses collègues montrent que l'expression de miR-410 était significativement associée à la maladie sans survie du neuroblastome favorable non amplifié [16]. En outre, Chen [17] a révélé que l'expression de miR-410 a été réduite dans les gliomes humains et forcé miR-410 l'expression dans des cellules de gliome fortement inhibé la prolifération cellulaire, l'invasion à médiation par le ciblage MET. Toutefois, l'expression et la fonction de miR-410 dans le développement de GC n'a pas été signalée. Dans cette étude, nous avons identifié l'expression de miR-410 dans plusieurs lignées de cellules GC et le GES en utilisant qRT-PCR. L'expression de miR-410 a été augmenté de façon significative dans toutes les lignées cellulaires quatre GC par rapport à la GES. En outre, les résultats obtenus à partir de tissus GC clinique ont également confirmé que miR-410 a été régulée à la baisse dans les tissus du GC par rapport aux tissus adjacents non cancéreux par paires, ce qui indique son éventuelle implication dans la transformation et à la fois la tumeur oncogène métastases. Nous avons ensuite confirmé que l'inhibition de miR-410 promu significativement cellule GC prolifération, la migration et l'invasion in vitro.

Nous avons exploré davantage le mécanisme moléculaire qui sous-tend le rôle de miR-410 et identifié MDM2 comme une cible en aval fonctionnelle directe de miR-410 dans les cellules GC. approches bioinformatiques, qui ont été utilisés pour prédire les cibles des miARN, ont mis en évidence un match de semences de haute énergie libre sur le site de miARN de liaison bien conservée et ses ARNm cibles, mais la spécificité est resté un problème dans la définition des objectifs de nombreux miARN. Ainsi, la sur-expression d'un miARN peuvent réguler négativement l'expression de la protéine cible. séquence complémentaire de miR-410 est identifié dans la 3'UTR de l'ARNm de MDM2. De plus, nous avons démontré que miR-410 vise directement la 3'UTR de MDM2, que sa surexpression est associée à la suppression de l'activité luciférase. En outre, une régulation à la baisse significative du taux de protéine MDM2 a été observée après miR-410 surexpression, ce qui indique la régulation post-transcriptionnelle de MDM2 par son ciblage 3'UTR. Ces résultats indiquent que miR-410 peut fonctionner comme un suppresseur de tumeur provoquée partiellement en réprimant l'expression de miR-410 dans le développement GC.

MDM2 est un oncogène qui a été d'abord découvert dans un locus amplifié sur des chromosomes double-minute dans une tumorigène ligne souris cellulaire (3T3-DM) [25]. La fonction principale du MDM2 est d'inhiber l'activité biologique de p53 en bloquant l'activité de transcription de p53 et de promotion de la dégradation de la protéine p53 [26] - [28]. Les niveaux élevés de MDM2 a diminué les taux de protéine p53 et peuvent atténuer la fonction de p53, ce qui augmente le risque de cancer et /ou la formation d'une tumeur accélérée et la progression [29]. L'oncogène MDM2 a joué un rôle important dans la progression du cancer [30]. La surexpression de MDM2 dans des cellules tumorales induites par la prolifération des cellules, inhibe l'apoptose des cellules [31]. Plusieurs études ont montré que la surexpression de MDM2 a été associée à une mauvaise survie et était un facteur prédictif utile pour un mauvais pronostic chez les humains atteints de carcinome hépatocellulaire et du sein carcinomes [32], [33]. En outre, la récente étude ont constaté que MDM2 a été exprimée à des niveaux plus élevés dans les tissus du GC que dans la muqueuse gastrique non-cancéreuses, et l'expression MDM2 a été associée à des caractéristiques clinico-pathologiques chez les patients traités uniquement avec la chirurgie [34], [35]. En outre, knockdown de MDM2 ou la surexpression de JWA a pour effet synergique sur la suppression de la prolifération des cellules gastriques du cancer et de la migration [35]. Cependant, la façon dont le mécanisme de MDM2 a été surexpression est encore inconnue. Ces résultats indiquent que la capacité de miR-410 pour cibler MDM2 peut fournir un tel mécanisme de contrôle post-transcriptionnelle de MDM2.

En résumé, nos résultats ont montré que miR-410 était significativement régulée à la baisse dans la GC les cellules et les tissus. Enforced expression de miR-410 augmentation de la prolifération des cellules de GC, la migration et l'invasion en ciblant directement MDM2. Ces résultats suggèrent que ce roman axe miR-410 /MDM2 offre un nouvel aperçu de la métastase de la tumeur sous-jacente des mécanismes, et la répression de miR-410 expression peut être une stratégie thérapeutique potentielle pour le traitement de la GC dans le futur.

Informations complémentaires
Tableau S1. charateristics
clinicopathologiques des patients atteints de GC
doi: 10.1371. /journal.pone.0104510.s001
(DOCX)
Tableau S2. Primer
séquence
doi:. 10.1371 /journal.pone.0104510.s002
(DOCX)

• PLOS ONE: Analyse des métastases ganglionnaires Corrélation avec pronostic chez les patients atteints T2 gastrique Cancer
• PLOS ONE: Association entre Dairy Intake et cancer gastrique: une méta-analyse de observationnelle Studies