PLOS ONE: kliniskt patologiska betydelse och prognostiska värdet av laktatdehydrogenas A Expression i magcancer patienter

Abstrakt

Inledning

LDH-A, det enzym som ansvarar för att omvandla pyruvat till laktat, har visat sig vara upp-regleras i många typer av cancer och kan ge upphov till mer aggressiv beteende genom att reglera spridning och anti-apoptos. Emellertid har sitt uttryck i magcancer (GC) inte präglats ordentligt. Syftet med denna studie var att klargöra uttrycket och potentiella konsekvenser av LDH-A i GC.

Metoder

Vi undersökte LDH-A uttryck genom immunhistokemi på GC vävnad microarray (TMA) och med hjälp av western blöt på färska GC vävnader och cellinjer. Prognostiskt värde och korrelation med andra clinicopathologic faktorer utvärderades. Vi transfekterade siRNA i GC-celler mot LDH-A. LDH-A analyserades med Western blotting och realtids-RT-PCR. Celltillväxt utvärderades in vitro och in vivo. Laktat och ATP-produktion genom celler bestämdes.

Resultat

Det var signifikant högre LDH-A-uttryck i karcinom jämfört med icke-neoplastisk slemhinna (NNM). Det fanns en positiv korrelation mellan LDH-A uttryck med åldern, histologiska typ och lymfkörtelmetastaser. Överlevnadsanalys visade att högt uttryck av LDH-A i GC var associerat med lägre total överlevnad (OS). När stratifierat av Lauren kvalitet och histologiska klassificering, dök betydelse diffus typ och odifferentierad typ GC. I multivariat analys, LDH-A uttryck i GC var en oberoende prognostisk riskfaktor för OS (hazard ratio = 1,829, 95% CI 1,375-2,433, P < 0,0001). Specifik siRNA mot LDH-A i GC-cellinje retarderad celltillväxt både in vitro och in musmodeller. LDH-A knockdown minskade också laktat och ATP-produktion i GC-celler.

Slutsatser

Vår studie indikerade onkogen roll LDH-A i GC. LDH-A uttryck är en oberoende prognostisk riskfaktor i GC patienter och uppreglerat uttryck av LDH-A kan vara prediktiva för dåliga resultat i diffus typ och odifferentierad typ GC. Våra resultat tyder på att LDH-A kan vara ett potentiellt terapeutiskt mål i magcancer

Citation:. Sön X, sön Z, Zhu Z, Guan H, Zhang J, Zhang Y, et al. (2014) kliniskt patologiska betydelse och prognostiska värdet av laktatdehydrogenas A Expression i magsäckscancer patienter. PLoS ONE 9 (3): e91068. doi: 10.1371 /journal.pone.0091068

Redaktör: Anthony W.I. Lo, den kinesiska University of Hong Kong, Hongkong

emottagen: 12 augusti, 2013; Accepteras: 7 februari 2014; Publicerad: 7 mars 2014

Copyright: © 2014 Sun et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Denna studie har finansierats med bidrag från forskningsprojekt i Liaoning-provinsen vetenskap och teknik Institutionen (nr 2007225017, nr 2009225011 till 2 och nr 2011415052) och vetenskapliga och tekniska projekt i Shenyang (nr F11-264-1-19). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

de metaboliska egenskaper cancerceller skiljer sig avsevärt från de normala celler, som cancerceller företrädesvis utnyttjar glykolysen i stället för mitokondriell oxidativ fosforylering även i närvaro av syre; Detta fenomen kallas Warburg effekt [1], [2], [3]. Den överraskande höga för att ta upp glukos och laktat produktion i tumörer i närvaro av syre ledde Warburg att spekulera i att avvikande metabolism kan vara orsaken till många cancerformer [2]. Men fördelen med den metaboliska omvandlingen ger till cancerceller är fortfarande oklart [4], [5]. Nyligen har upptäckten av sambandet mellan onkogener och metaboliska processer har lett till ett uppsving av intresse i Warburg arbete. Det finns allt fler bevis för att anpassningen av aerob glykolys av cancerceller skulle kunna underlätta cancer proliferation [5]. Cancer metabolism har varit under omfattande prospektering i hopp om att upptäcka nya effektiva behandlingar för cancer.

LDH-A, är en avgörande enzym som spelar en viktig roll i det sista steget av Warburg effekt genom att omvandla pyruvat till laktat . I olika typer av humana cancerformer, uttrycket av LDH-A var uppreglerat [6], [7]. I esofagus skivepitelcancer var LDH-A uppreglerat i cancervävnader och främjade överlevnaden av tumörceller [8]. Dessutom var LDH-A rapporteras att öka tillväxten och migration av gastric cancerceller [9]. Uttrycket status och funktionen av LDH-A i magcancer (GC) fortfarande okänd.

I denna studie undersökte vi uttrycket av LDH-A i en stor kohort av GC exemplar och korrelerade dess uttryck med kliniska patologiska parametrar och total överlevnad (OS). Våra resultat visar att expressionen av LDH-A var uppreglerat i de kliniska gastriska cancerprov, och proteinuttryck korrelerades till ålder och histologisk klassificering. Dessutom fann vi att hög LDH-A uttryck i samband med sämre prognos i GC patienter. Sammantaget visade vår studie onkogena funktionen av LDH-A i magcancer och föreslog LDH-A som en ny potentiell prognostisk faktor och ett potentiellt terapeutiskt mål.

Material och metoder

Patienter

den aktuella studien ingick 264 patienter med GC som följde kurativ kirurgi från januari 2006 till maj 2007 på den första anslutna sjukhus i Kina Medical University. Gruppen bestod av 194 män och 70 kvinnor med en medelålder på 59 (intervall 29-81) år. Ingen av patienterna genomgick kemoterapi eller strålbehandling före operation. Uppföljning uppgifterna hade samlats in från alla patienter.

Etik Statement

etiskt godkännande för denna forskning erhölls från forskningsetiska kommittén i Kina Medical University, Kina. Alla patienter som tillhandahåller tumörvävnad liksom normala mag vävnadsprover tecknat ett medgivande innan kirurgiskt avlägsnande av magcancer för att möjliggöra denna forskning som ska utföras. Alla studieförfaranden djur var i enlighet med National Institutes of Health Guide för vård och användning av försöksdjur och utfördes enligt de institutionella etiska riktlinjer. Dessa försöksdjur köptes från Shanghai Branch Center, Institutet för försöksdjursvetenskap, Chinese Academy of Medical Science (även känd som Shanghai CAS, certifikatnummer: SCXK [Hu] 2003-0003). Alla experimentella procedurer genomfördes i enlighet med institutionella riktlinjer för vård och användning av försöksdjur, och protokoll har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén i Kina Medical University, Shenyang, Kina. Alla ansträngningar gjordes för att minimera lidandet.

vävnadsprover och patologi

Alla patientgenererade paraffininbäddade magcancer prover (n = 264) och deras anpassade NNM exemplar (2 cm från cancer n = 209) samlades från kirurgisk resektion och arkiveras enligt protokoll som godkänts av Institutional Review Boards i första anslutna sjukhus Kina Medical University. Färskt magkarcinom och angränsande NNM uppsamlades och frystes i -80 ° C tills protein extraktion genom homogenisering i RIPA lysbuffert. Den histologiska diagnos och andra mikroskopiska egenskaper bekräftades av patologer och TNM stadieindelning för varje magcancer utvärderades enligt Union International Contre le Cancer (UICC) system för omfattningen av tumörspridning. Histologisk arkitektur magcancer uttrycktes i Laurens klassificering och Världshälsoorganisationen (WHO) klassificering. Dessutom var tumörens storlek, djup invasion, och lymfatiska bestämd.

cellinjer och kultur

humana magcancer-cellinjer MKN28 (väl differentierat), AGS, SGC-7901 (måttligt differentierade ), MGC803 (dåligt differentierad) och humant normalt gastric cellinje GES-1 köptes från cellbank av Chinese Academy of Sciences. Fem cellinjer hölls i RPMI 1640 (Hyclone, Logan City, USA) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS). Alla de cellinjer som var i en 5% CO _{2 fuktad atmosfär vid 37 ° C.}

Tissue Microarray (TMA) och immunohistokemi

Representativa områden av solida tumörer och intilliggande NNM identifierades i HE-färgade sektioner av de utvalda fallen och en vävnad kärna per donatorblocket 1,5 mm diameter stansades ut och överfördes till ett mottagande block med maximalt 200 (10 × 20) kärnor med hjälp av en 1,5 mm punch diameter instrument. Efter re-smält, sektioner (4 pm tjocka) var i följd skära från varje vävnad microarray-block, färgning HE utfördes på TMA för bekräftelse av tumör och slemhinnor vävnad. Immunhistokemisk analys utfördes på TMA sektioner, var Tryckkokare medierad antigenåtervinning utförs i citratbuffert (pH 6,0) under 10 min. Sektioner inkuberades med 1:300 utspädning av LDH-A (muskel-subenhet) Kanin-monoklonal antikropp (epitomics) över natten vid 4 ° C, och inkuberades sedan med get-anti-mus eller anti-kanin Envision System Plus-HRP (Dako Cytomation) för 30 min vid rumstemperatur. Efter sköljning tre gånger i PBS under 10 min vardera, inkuberades sektionerna med DAB under 1 min, motfärgades med Mayers hematoxylin, dehydratiserades, rensas och monteras. Utelämnande av den primära antikroppen användes som en negativ kontroll.

Western Blot analys

Proteiner koncentrationer av prover extraherade från vävnadsprover och cellinjer med användning av radioimmunfällningsanalys lysbuffert bestämdes med användning av Bradford-reagens ( Sigma) enligt tillverkarens anvisningar. Denaturerat protein separerades på en natriumdodecylsulfat (SDS) -polyacrylamide gel (10% akrylamid) och överfördes till polyvinylidenfluorid-membran (Millipore, Bedford, MA), som därefter blockeras i 5% fettfri mjölk i Tris-buffrad saltlösning (pH 7,5). För immunblotting, inkuberades membranet över natten med LDH-A (muskel-subenhet) Kanin Monoclonal Antibody (1:1500) (epitomics) vid 4 ° C. Därefter visade det sköljdes med TBST och inkuberades med sekundära antikroppar under 15 minuter. Signaler detekterades genom förstärkt kemiluminescens (Pierce, Rockford, IL).

Uppföljning efter kirurgi

264 patienter som genomgick gastroctomy utsattes för noggrann klinisk observation, däribland bröst /buk /bäcken datortomografisk (CT) avbildning, CEA-nivå, och blodtestning vid 2 till 3 månaders intervall och en årlig gastroskopi. Uppföljning var i överensstämmelse med National Comprehensive Cancer Network (NCCN) Practice Guidelines i magcancer. Total överlevnad (OS) hastighet definierades som intervallet från den första operationen till döden. Slutdatumet för uppföljningsstudie för att genomföra analysen var den 29 juni var 2012.

Utvärdering av immunhistokemisk färgning

Immunoreaktivitet utvärderas oberoende av två forskare som var blinda för patienten resultatet. Utvärderingen baserades på färgningsintensitet. Färgningsintensitet för LDH-A bedömdes som 0 (negativ); En (svag); 2 (måttlig); och 3 (starkt). Exemplaren delades in i två grupper beroende på deras poäng: 0 och 1 är lågt uttryck grupp; 2 och 3 är högt uttryck grupp. I händelse av en avvikelse i poäng, var bilderna omprövas av båda patologer under ett mikroskop.

generation av små störande (si) RNA Knockdown stabila cellinjer

Baserat på LDH -A-sekvens, ades shRNA utformats med hjälp av siRNA Target Finder (Ambion): nukleotidsekvensen för det insatta ShLDH-A var 5'-ATCCAGTGGATATCTTGACCTACG TGGCT-3 '. Cellinjen som genereras genom att infektera celler med oordning plasmid användes som en kontroll. 10

• PLOS ONE: Ökad MicroRNA-630 Expression i Gastric Cancer är associerad med dålig total Survival
• PLOS ONE: Effekten av individuella och området socioekonomisk status på Gastric cancer Survival