Aktiveret pattedyr mål for rapamycin er en potentiel terapeutisk mål i gastrisk cancer

Aktiveret pattedyr mål for rapamycin er en potentiel terapeutisk mål i mavekræft
Abstract
Baggrund
pattedyr mål for rapamycin (mTOR) spiller en central rolle i cellulær vækst og homeostase. Formålet med vores nuværende undersøgelse er at undersøge ekspressionen af ​​aktiverede mTOR (p-mTOR) i mavecancerpatienter, deres prognostiske betydning og hæmning effekt RAD001 på tumorvækst og at afgøre, om en målrettet hæmning af mTOR kunne være en potentiel terapeutisk strategi for mavekræft.
Metoder
udtryk for p-mTOR blev påvist i prøver af 181 gastrisk kræft, som gennemgik radikal resektion (R0) ved immunhistokemi. Korrelationen af ​​p-mTOR udtryk for clinicopathologic funktioner og overlevelse mavekræft blev undersøgt. Vi har også bestemt hæmning effekt RAD001 på tumorvækst ved hjælp BGC823 og AGS menneskelige gastrisk cancer cellelinjer.
Resultater
Immunfarvning for p-mTOR var positiv i 93 af 181 (51,4%) gastrisk kræft, tæt korreleret med lymfeknuder node status og pTNM fase. Patienter med p-mTOR positive viste signifikant kortere sygdomsfri overlevelse (DFS) og samlet overlevelse (OS) satser end dem med p-mTOR-negative tumorer i univariable analyser, og der var en tendens til en sammenhæng mellem p-mTOR udtryk og overlevelse i multivariable analyser. RAD001 markant inhiberede dosisafhængigt proliferation af humane gastriske carcinomaceller ved nedregulering ekspression af p70S6k, p-p70S6k, C-myc, CyclinD1 og Bcl-2, opregulering ekspression af P53.
Konklusioner Salg In gastrisk cancer, p-mTOR er et potentielt terapeutisk mål og RAD001 var en lovende behandlingsmiddel med inducere cellecyklus og apoptose ved nedregulering ekspression af C-myc, CyclinD1 og Bcl-2, opregulering ekspression af P53.
Baggrund
Gastric karcinom er den fjerde mest almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, herunder 1 million nye tilfælde om året i hele [1] verden. Omkring 60% af nye tilfælde af mavekræft forekomme i det østlige Asien [2], især i Kina. Kirurgisk resektion er den mest effektive behandling af gastrisk cancer, og effektiviteten af ​​kemoterapi fortsat begrænset [3]. Mange undersøgelser har indikeret, at dybden af ​​invasionen og antallet af metastatiske lymfeknuder er de vigtigste kraftfulde prædiktorer for overlevelse for mavecancerpatienter [4, 5]. For eksempel i tidligere undersøgelser [6, 7], har vi fundet positiv lymfeknude-forholdet er en uafhængig prognostisk indikator efter D2 resektion og intraperitoneal kemoterapi kan være gavnligt for mavecancerpatienter. Men et afgørende skridt i retning af at forbedre kliniske resultater ligger i den øgede forståelse af tumoren biologiske adfærd, som kan hjælpe med at identificere de mulige mål for individuel terapi [8, 9].
I de seneste år, molekylært baserede tilgange til behandling i mavekræft har fået stor bekymring. Adskillige artikler er beskrevet nogle potentielle molekylære mål for terapi i gastrisk cancer, såsom epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) [10-13], vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF) [14], recepteur d'origine Nantais (RON) [15 ].
pattedyr mål for rapamycin (mTOR) er en ny potentiel molekylær mål for anticancer-terapi. Dets ekspression er blevet påvist i forskellige cellelinier og tumorprøver, såsom lever neoplasmer [16], brystcancer [17], galdevejene adenocarcinom [18], og livmoderhalskræft [19, 20]. Disse undersøgelser viste, at mTOR ekspression blev forbundet med dårlig klinisk prognose. Lang et al [21]. har også observeret mTOR aktivering i human gastrisk cancer in vitro og in vivo. De anførte mTOR ofte aktiveres i human gastrisk cancer. For nylig, en oralt biotilgængelig derivat af rapamycin, RAD001 (everolimus; Novartis Pharma AG), er blevet udviklet. Et fase III studie afslørede behandling med everolimus forlænger progressionsfri overlevelse hos patienter med metastatisk renalcellecarcinom, der havde udviklet sig på andre målrettede behandlinger [22]. RAD001 har også vist sig at inhibere proliferation af tumorcellevækst i nogle carcinomer [23, 24]. Men den rolle, RAD001 i gastrisk kræft celle er ikke klart.
Formålene med denne undersøgelse blev til yderligere at analysere forholdet mTOR udtryk med prognosen værdi af aktiveret mTOR (p-mTOR), virkningen af ​​RAD001 på væksten og cellecyklus af humane gastriske kræftceller in vitro og afgøre, om gastrisk kræft er en god kandidat til target behandling med mTOR-hæmmere.
Metoder
patienter studerede
Denne retrospektiv undersøgelse bestod af 181 patienter, som gennemgik radikal resektion ( R0) til histologisk bekræftet gastrisk karcinom fra Cancer center of Sun Yat-sen University fra januar 1997 til december 2002. Alle patienter med histologisk bekræftet adenocarcinom i maven havde underkastet enten proksimalt partiel gastrektomi, distal partiel gastrektomi eller total gastrektomi. Etisk godkendelse blev opnået fra Sun Yat-sen University Cancer Center videnskabsetisk komité.
Personer med tilstrækkelig histologisk materiale og komplette kliniske data blev berettiget til optagelse. Kriterierne for støtteberettigelse også omfattede histologisk bekræftet R0 resektion, som blev defineret som ingen makroskopisk og mikroskopisk residual tumor og postoperativ overlevelsestid ≥ 6 måneder. Patienter med fjernmetastaser og karcinom i gastrisk stub efter resektion for benign sygdom blev udelukket fra undersøgelsen. Årsagen er, at overlevelsen af ​​patienter med spredte metastaser ofte påvirkes af mange andre faktorer, såsom præoperativ kemoterapi eller obstruktion
Alle patienter havde opfølgning efter kirurgi på 6 til 12 måneders interval.; den endelige dato for opfølgning var december 2008. Median opfølgningsperiode var 50 (gennemsnit: 50,66; 10 til 128) måneder for alle patienter, og 74 måneder (betyder: 72,80; range 27-128) for at overleve. Median varighed af opfølgning var 40 (middelværdi: 43,71; interval 11-125) for patienter, som havde tumorer af p-mTOR positivt udtryk, og 60,5 måneder (betyder: 58.01; 10 til 128) for negative udtryk. Overlevelse blev beregnet fra datoen for diagnosen frem til datoen for død eller sidste opfølgning.
Prøvetagning og Immunfarvning for p-mTOR
Alle tumor prøver blev opnået fra kirurgisk resektion gastrisk kræft før adjuverende behandling. Formalinfikserede, paraffinindlejrede vævsblokke blev opbevaret ved stuetemperatur identificeret ved et identifikationsnummer. Fem-um-tykke vævssnit blev skåret fra paraffinblokke, afparaffiniseret i xylen og rehydreret. Antigen genfinding blev forarbejdet med natriumcitrat. Objektglassene blev derefter inkuberet i 0,3% H 2O 2 i 10 minutter, og blokeret i 1% bovint serumalbumin i 60 minutter efterfulgt af et kanin-monoklonalt antistof specifikt for p-mTOR (Phospho-mTOR, Ser2448, 49F9; Cell Signaling Technology) ved 4 ° C natten over, og derefter farvet med 3,3-diaminobenzidin. Efter visualisering af immunreaktivitet blev snittene modfarvet med hematoxylin og monteres derefter.
Evaluering af immunhistokemisk farvning
Den immunfarvet snit blev evalueret og væv fra humane prostata-adenocarcinomer tjente som positiv kontrol. Ifølge nyligt beskrevne kriterier for vurdering mTOR ekspression blev farvningsintensitet bestemt som 0 (fraværende), 1 (svag) og 2 (stærk) og ekspressionsniveauer af biomarkører blev semiquantified brug af en immunhistokemisk score (range, 0-200) beregnet ved at multiplicere farvningsintensitet med procentdelen af ​​positive tumorceller [18]. Patienter med en immunhistokemisk score på ≤ 20 blev betragtet som p-mTOR-negative og dem med en score på > 20 p-mTOR-positive. Alle objektglas blev uafhængigt vurderet to uafhængige patologer uden nogen viden om patienternes kliniske oplysninger. Når udtalelserne fra de to evaluatorer var forskellige, blev der opnået enighed ved omhyggelig diskussion
cellelinjer og dyrkningsbetingelser
Humane mavekræft cellelinjer BGC823 og AGS (ATCC: CRL-1739). Som er dårligt differentieret VAR gaver fra Peking University School of Oncology (Beijing, PR China.) [25]. Cellelinjerne blev opretholdt i RPMI 1640-medium (Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone), penicillin (100 enheder /ml) og streptomycin (100 enheder /ml) ved 37 ° C og 5% CO2 i en fugtig inkubator .
Cellernes levedygtighed assay
for at analysere effekten af ​​RAD001 på humane gastriske kræftceller blev cellelevedygtighed bestemt ved MTT-analysen. RAD001 blev leveret af Novartis Pharma (Basel, Schweiz). For levedygtighed assayet blev logaritmisk voksende celler stimuleret med forskellige doser af RAD001 (0, 5, 10, 20 og 40 uM). Ved afslutningen af ​​dyrkningsperioden, 20 pi tetrazolium farvestof 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (Sigma, USA) opløsning ved 0,2 mg /ml i PBS blev tilsat den optiske densitet ved 490 nm (OD490) blev bestemt ved anvendelse af et enzym-koblet immunosorbent assay (ELISA) læser. Middelværdier blev beregnet ud fra tredobbelte kulturer.
Cellecyklusanalyse
Celler blev opsamlet og fikseret i 70% ethanol natten over ved 4 ° C. Celler blev derefter vasket og farvet med propidiumiodid (PI) (Sigma) 5 ug /ml. Efter 30 minutter ved stuetemperatur beskyttet mod lys blev cellerne analyseret via flowcytometri under anvendelse af en Becton Dickinson FACScan.
Annexin V assay
Prøverne blev vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) og under anvendelse Annexin V-fluorescein (FITC) og PI-farvning til bestemmelse af phosphatidylserin eksponering på den ydre plasmamembran. Efter inkubation i 30 minutter ved stuetemperatur beskyttet mod lys blev prøverne kvantificeret ved flowcytometri under anvendelse af en Becton Dickinson FACScan.
Revers transkription-PCR
Totalt RNA blev ekstraheret ved anvendelse af TRIzol metode. RNA blev omvendt transskriberet ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit (Fermentas, USA). Blandingen (25 pi i alt) til PCR bestod af 0,5 pi cDNA, 0,5 U Taq DNA-polymerase, 2,5 pi 10 x PCR-buffer, 2,5 mM dNTP-blanding, og 50 pM sense- og antisense-primere hver. CyclinD1 og C-myc blev analyseret ved følgende primere: CyclinD1 5'GAACAGAAGTGCGAGGAGGAG3 'og revers primer 5'AGGCGGTAGTAGGACAGGAAG3'; C-myc, 5 'CGAGCTGCTGGGAGGAGACAT3 og 5'AGCCGCCCACTTTTGACA GG3' Actin:. 5'GGCACCCAGCACAATGAA 3 'og 5' TAGAAGCATTTGCGGTGG 3'
Cellelysat og Western blot-analyse
Celler blev lyseret i lysisbuffer og koncentrationen af protein blev bestemt ved Bradford dye-metoden (Bio-Rad Laboratories). Lige store mængder celleekstrakt blev underkastet SDS-PAGE og overført til PVDF-membran (Bio-Rad). Western blot analyser blev udført med forskellige specifikke primære antistoffer. Antistoffer, som genkender phospho-p70S6K (Thr389), p70S6K, phospho-mTOR (Ser2448), Bcl-2 og p53 var fra Cell Signaling.
Statistiske analyser
primære endepunkt vores undersøgelse var samlet overlevelse (OS). Det blev defineret som perioden mellem tidspunktet for kirurgi og død. Sygdomsfri overlevelse (DFS) var tiden mellem tidspunktet for kirurgi og tilbagefald eller tumor-relaterede dødsfald. Det blev undersøgt som en sekundær slutpunkt. Foreningen af ​​p-mTOR udtryk med forskellige clinicalopathologic funktioner blev analyseret ved hjælp af chi-square test. Kumulativ overlevelse og sygdomsfri overlevelse blev anslået af Kaplan-Meier-metoden. Af log-rank testen blev anvendt til at evaluere den statistiske signifikans af forskelle mellem overlevelseskurver. En Cox proportional hazard model (baglæns, trinvis) for multivariabel analyse blev ansøgt om faktorer, der opnåede betydning i univariable analyse. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS-software (version 13 til Windows, SPSS, Chicago, IL). Forskelle på P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Resultater
Clinicopathologic funktioner
En alt 181 patienter blev inkluderet i denne undersøgelse. Den mediane alder var 59 år (spændvidde, 23-83 år). De clinicopathologic karakteristika undersøgelsespopulationen er opsummeret i tabel 1. 129 patienter var mænd og 52 kvinder. 77 af 181 tumorer (42,5) var fra den øvre mave, 74 af 181 patienter (40,9%) var fra den nedre del af maven, og de resterende tumorer var fra midten og hele kroppen af ​​maven. 118 af 181 (65,2%) patienternes tumorstørrelse var > 4 cm, og 63 (34,8%) var ≤ 4 cm. I overensstemmelse med WHO kriterier, 4 af 181 tumorer (2,2%) var godt differentieret, 55 af 181 tumorer (30,4%) var moderat differentierede, 116 var dårligt differentieret, og seks var udifferentierede. Postoperativ kirurgisk fase blev klassificeret i henhold til 2002 UICC /AJCC klassifikation [26] .table en Clinicopathologic korrelation af p-mTOR udtryk i mavekræft
Faktorer
Alle patienter
No. af patienterne (%)
P

N
= 181 (%)
mTOR negativ
mTOR positiv

Age (y)
0,256
< 60
95 (52,5)
50 (56,8)
45 (48,4)
≥60
86 (47,5)
38 (43,2)
48 (51,6)
Sex
0,926
Mand
129 (71,3)
63 (71,6)
66 (71,0)
Female
52 (28,7)
25 (28,4)
27 (29,0)
site
0,053
Øvre
77 (42,5)
33 (37,5)
44 (47,3)
Mellemøsten
28 ( 15.5)
10 (11,4)
18 (19,4)
lavere
74 (40,9)
43 (48,9)
31 (33,3)
Diffus
2 ( 1.1)
2 (2.3)
0 (0,0)
Tumor størrelse
.172
≤ 4 cm
63 (34,8)
35 (40,0)
28 (30.1)
> 4 cm
118 (65,2)
53 (60,0)
65 (69,9)
BORRMANN typen
0,398
Tidligt stadium
7 (3,9)
6 ( 6.8)
1 (1.1)
jeg
4 (2.2)
2 (2.3)
2 (2.1)
II
65 (35,9)
31 ( 35.2)
34 (36,6)
III
101 (55,8)
47 (53,4)
54 (58,1)
IV
4 (2.2)
2 ( 2.3)
2 (2.1)
sortering
0,999
1
4 (2.2)
2 (2.3)
2 (2.1)
2
55 (30,4)
27 (30.7)
28 (30,1)
3
116 (64,1)
56 (63,6)
60 (64,5)
4
6 (3.3)
3 (3.4)
3 (3.3)
Patologisk T klassifikation
0,168
T1
17 (9.4)
12 (13,6)
5 (5.4)
T2
35 (19,3)
18 (20,5)
17 (18,3)
T3
119 (65,7)
55 (62,5)
64 (68,8)
T4
10 (5.5)
3 (3.4)
7 (7,5)
Patologisk N status
0,008
N negativ
44 ( 24.3)
29 (33,0)
15 (16,1)
N positiv
137 (75,7)
59 (67,0)
78 (83,9)
Patologisk etape (pTNM)
0,026
jeg
26 (14,4)
17 (19,3)
9 (9,7)
II
47 (26,0)
28 (31,8)
19 (20,4)
III
100 (55.2)
41 (46,5)
59 (63,4)
IV
8 (4.4)
2 (2.3)
6 (6.5)
129 af 181 patienter (71,2%) havde mere fremskreden T stadie sygdom (PT3 + pt4), og 137 patienter (75,7%) havde lymfeknude metastaser. Totally patienter under trin I-IV var 26, 47, 100 og 8 tilfælde, henholdsvis.
P-mTOR udtryk i mavekræft
immunfarvning af p-mTOR var cytoplasmatisk og dels membranøs. Figur 1 viser repræsentative eksempler på p-mTOR immunfarvning. Den normale maveslimhinden er negativ for p-mTOR. Af de 181 patienter, 93 (51,4%) var p-mTOR-positive tumorer. Figur 1 Eksempler på p-mTOR immunfarvning. (A) Den normale maveslimhinden er negativ for p-mTOR (oprindelig forstørrelse x 200). (B) Den normale maveslimhinden er negativ for p-mTOR (oprindelig forstørrelse x 400) (C) Positive ekspression af p-mTOR i gastrisk cancer (oprindelig forstørrelse x 200). (D) Negativ udtryk for p-mTOR i gastrisk cancer (original forstørrelse × 200).
Survival analyse
Patienter med p-mTOR positiv mavekræft viste signifikant kortere sygdomsfri og samlet overlevelse satser end dem med p- mTOR negativ gastrisk cancer (DFS, 48,9% versus 30,1%, p = 0,006; OS, 51,1% versus 34,4%, p = 0,011; tabel 2, figur 2A, B). Univariable analyse viste, at overlevelsestid også faldet med højere pT klassifikation (DFS, p = 0,001, OS, P = 0,005), lymfeknude metastaser (DFS, s < 0,0001, OS, P = 0,001) og avancerede pTNM fase (DFS, s < 0,001; OS, P = 0,001). Der var ingen sammenhæng mellem DFS eller OS og alder, køn eller tumor size.Table 2 Univariable analyse af sygdomsfri og samlet overlevelse i mavekræft


Disease-free suivival
Samlet survival

Characteristic

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

Age(y)
0,343
0,583
< 60
95
1.00
1.00
≥60
86
0,834
0,573-1,214
0,898
0,611-1,320
Sex
. 662
0,950
Mand
129
1.00
1.00
Female
52
0,909
0,591-1,396
0,986
0,639-1,521
Tumor størrelse
0,151
0,232
≤4 cm
63
1.00
1.00
> 4 cm
118
1,345
0,897-2,016
1,287
0,851-1,945
pT stadium
0,001
0,005
PT1
17
1,00
1.00
pT2
35
1.549
0.558-4.301
.401
1.535
0.553-4.264
.411
pT3
119
3.546
1.437-8.750
.006
3.237
1.310-8.001
.011
pT4
10
4.738
1.547-14.506
.006
4.068
1.289-12.836
.017
pN fase
< 0,0001
0,001
Negativ
44
1.00
1.00
Positiv
137
2,617
1,538-4,451
2,389
1.401- 4,075
pTNM etape
< 0,0001
0,001
jeg
26
1.00
1.00
II
47
2.920
1.197-7.121
.018
2.860
1.173-6.973
.021
III
100
4.955
2.152-11.409
< 0,0001
4,455
1,930 til 10,281
< 0,0001
IV
8
7,369
2,470 til 21,981
< 0,0001
6,103
1,965 til 18,957
0,002
p-mTOR
0,008
0,013
Negativ
88
1.00
1.00
Positive
93
1,667
1,146-2,454
1,644
1,112-2,430
Figur 2 Kaplan-Meier-estimater af sandsynligheden for overlevelse. Patienter med p-mTOR positive viste signifikant kortere samlet overlevelse (A) og sygdomsfri overlevelse (B) satser end dem med p-mTOR negative udtryk. (P = 0,011 og p = 0,006, henholdsvis)
I multivariable analyse, lymfeknude metastaser (DFS, p = 0,018, OS, P = 0,038). Og pT stadium (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,046) var signifikant uafhængig prognostisk faktor for overlevelse tid. Desuden multivariabel analyse (tabel 3) indikerede også en tendens til en sammenhæng mellem p-mTOR udtryk og nedsat overlevelse, men tendensen nåede ikke statistisk signifikans (DFS, p = 0,059, OS, P = 0,070) .table 3 Multivariabel cox regressionsanalyse af sygdomsfri og samlet overlevelse


Sygdomsfri suivival
Samlet survival

Factors

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

p-mTOR
0,059
0,070
Negativ
88
1.00
1.00
Positiv
93
1,452
0,986-2,138
1,443
0,970-2,147
Infiltrerende dybde
0,018
0,046
PT1
17
1.00
1.00
pT2
35
1.050
0.366-3.016
0.928
1.078
0.375-3.101
0.889
pT3
119
2.251
0.867-5.845
0.096
2.146
0.823-5.595
0.118
pT4
10
2.926
0.920-9.305
0.069
2.616
2.616-8.580
0.113
Lymph node status
0,018
0,038
Negativ
44
1.00
1.00
Positiv
137
1,981
1,981-3,488
1,828
1,034-3,233
RAD001 hæmmer proliferation og forhindrer p70S6K fosforylering
at undersøge virkningerne af RAD001 på proliferation af humane gastrisk cancer cellelinjer BGC823 og AGS, vi udførte proliferationsassays med 48-timers eksponering for RAD001. Som et resultat, RAD001 genererer signifikant inhibering på begge cellelinier i en dosisafhængig måde. (Figur 3A). Figur 3 (A) RAD001 inhiberer proliferation af gastriske cancerceller. Gastrisk cancer celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af RAD001 i nærvær af 10% FBS i 48 timer. Cellelevedygtighed blev vurderet ved MTT-assayet. (B) Phosphorylering af p70S6k blev signifikant reduceret på en dosis-afhængig måde i begge AGS og BGC823 celler ved behandling med RAD001. Begge cellelinier blev inkuberet med stigende dosis af RAD001 i 48 timer, blev cellelysater underkastet western blot-analyse med phosphorylerede p-S6K og S6K antistoffer.
Western blot blev udført med RAD001 på 0, 5, 10, 20 pM i 48 timer. P70s6 kinase er et vigtigt nedstrømsmål af mTOR og dets mTOR-afhængig phosphorylering tillader translation af ribosomale proteiner. Vi undersøgte phosphorylering status nedstrømsmål p70S6k ved immunoblotting. Som vist i figur 3B, fandt vi, at behandling af begge cellelinier BGC823 og AGS med RAD001 væsentligt forhindre phosphorylering af p70S6k på en dosis-afhængig måde.
RAD001 inducerer G0 /G1 cellecyklusstop og apoptose i gastriske cancerceller
for at bestemme om suppression i celleproliferation skyldtes G0 /G1-fasen eller apoptose, celle-cyklus fordelingen blev analyseret ved FCM. Figur 4 viste, at behandling af BGC823 celler med RAD001 i 48 timer resulterede i en robust G1 anholdelse og fremmet apoptose. Med den stigende dosis af RAD001, flere og flere celler forblev i G1-fasen, mens cellecyklusprogression i S-fase var faldende (figur 4A). RT-PCR-analyse afslørede RAD001 dosisafhængigt reduceret mRNA-niveauet af cyclin D1 og C-myc (figur 4B). Figur 4 RAD001 inducerer cellecyklusstop og apoptose i BGC823 celler. (A) BGC823 celler blev udsat for forskellige koncentrationer af RAD001 i 48 timer. (B) RNA blev ekstraheret fra cellerne. Cyclin D1 og C-myc ekspressionsniveauet blev detekteret ved RT-PCR, actin som en loading kontrol. (C) -celler blev inkuberet i 48 timer med angivne doser af RAD001 før farvning med annexin V-FITC. Procentdelen af ​​apoptotiske celler vises. (D) Celler blev inkuberet i 48 timer med angivne doser af RAD001. Celler blev opsamlet, lyseret og underkastet Western blot-analyse med Bcl-2 og p53-antistoffer. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol.
Annexin-V-assays viste, at RAD001 signifikant apoptose i BGC823 celler. En stigning i apoptose sats blev analyseret ved FCM med stigningen i dosis (figur 4C). Western blot-analyse viste RAD001 dosisafhængigt faldende proteinniveauet af Bcl-2 og forøgelse proteinniveauet af p53 (figur 4D). Lignende resultater blev observeret i AGS celler (data ikke vist).
Diskussion
mammalian target of rapamycin (mTOR) blev opdaget i begyndelsen af ​​1990'erne s i at studere virkningsmekanismen af ​​rapamycin, som oprindeligt blev fundet som en antisvampemiddel og blev senere anerkendt som anticancer egenskaber [27]. Som Ser /Thr-proteinkinase, mTOR spiller en central rolle i cellulær vækst og homeostase [28]. Den mTOR protein danner et kompleks med adapter proteiner, mTORC1 (pattedyr mål af rapamycin kompleks 1) og mTORC2. Aktivering af mTORC1 regulerer cellevækst ved at modulere proteinsyntese, ribosom biogenese og autofagi [29]. Den mTORC2 vej spiller en vigtig del af at aktivere Akt, ligesom PDK1 (3-phosphoinositid-afhængig protein kinase 1) og PI3K, et potentielt lægemiddel mål for kræft, hvor der er Akt deregulering [26].
I den aktuelle undersøgelse, vi observeret, at 93 (51,4%) patienter havde positiv ekspression af p-mTOR i 181 mavecancerpatienter. I overensstemmelse med vores resultat, i en anden undersøgelse, herunder 1072 patienter, udtrykket af p-mTOR er 46,5% [30].
Tidligere undersøgelser har rapporteret den prognostiske betydning af p-mTOR udtryk. Herberger et al [18]. identificeret p-mTOR at være en uafhængig prognostisk faktor for død hos patienter med galdevejene adenocarcinom. I deres undersøgelse, samlede overlevelse var signifikant kortere hos patienter med p-mTOR-positive tumorer i forhold til patienter med p-mTOR-negative tumorer (P = 0,004). I mavekræft, Yu et al. evalueret ekspression af p-mTOR i 1.072 mavecancerpatienter anvendelse af et væv microarray, hvilket viser overekspression af p-mTOR var en uafhængig prognostisk faktor [30]. Men i en undersøgelse omfattede 109 patienter med gastrisk adenokarcinom, som gennemgik en radikal gastrektomi [31], Murayama et al. fundet hverken cytoplasmatiske p-mTOR eller nuklear p-mTOR var uafhængig prognostisk faktor, selv om de identificerede cytoplasmatisk p-mTOR ekspression blev associeret med dårligere overlevelse og korreleret med dybden af ​​tumorinvasion, lymfeknuder og tumor fase. I den foreliggende undersøgelse, bekræftede vi, at pT klassificering og lymfeknude-status er uafhængige prognostisk indikator for det kliniske resultat i mavecancerpatienter af multivariable analyser. Men fordi de fleste patienter til stede med lokalt fremskreden sygdom, andre sekundære prognostiske markører, især p-mTOR, kan være til nytte [13]. Vores resultater viser tydeligt, at p-mTOR udtryk er korreleret kraftigt med dårlig samlet og sygdomsfri overlevelse i univariable analyser med en tendens til sammenhæng i multivariable analyser.
Overensstemmelse med vores aktuelle undersøgelse har flere undersøgelser også anerkendt de antiproliferative virkninger af mTOR-hæmmere i mavens kræftceller. For eksempel Lang et al [21]. identificeret rapamycin kunne hæmme mavekræft cellevækst i både en subkutan tumor model og i en eksperimentel model. Deres resultater fremhæve egnethed mTOR inhibitorer, der skal anvendes i en antiangiogenisk forbindelse til terapi af gastrisk cancer.
Imidlertid RAD001 er en ny mTOR inhibitor som anticancermiddel. Mekanismen om RAD001 i mavekræft er ikke klart. Cejka et al. viste antiangiogenisk aktivitet af RAD001 kombineret med en høj dosis cyclophosphamid afslørede synergistisk antitumorvirkning mod mavekræft [32]. De har også fundet, RAD001 nedsat proliferation og svækket produktion af HIF-1α samt VEGF i gastriske cancerceller in vitro [33]. I den aktuelle undersøgelse, viste vores data, at RAD001-terapi svækket phosphorylering af p70S6K og markant inhiberede proliferationen af ​​gastriske cancerceller gennem celle-cyklus og apoptose in vitro. Vi fandt RAD001 inducerede G0 /G1 fasen, som blev forbundet med nedsat cyclin D1 og C-myc. Desuden viste vi for første gang, at RAD001 som ny mTOR inhibitor dosisafhængigt induceret apoptose i gastriske cancerceller ved Annexin V assays. Denne virkning kan være dikteret af den cellulære kontekst og nedstrøms mål herunder P53 og Bcl-2. Disse resultater kan yderligere forklare effekten af ​​RAD001.
Konklusion
Sammenfattende gennemførte vi systematisk forskning til mTOR i gastrisk kræft, der angiver forholdet udtrykket med prognosen værdi aktiveret mTOR (p-mTOR) in vivo, virkningen af ​​RAD001 og den del af mekanismer i gastriske cancerceller in vitro. Vores resultater viste, at p-mTOR ville tjene som en potentiel biologisk markør for at identificere en undergruppe af gastriske patienter med dårlig prognose cancer. Den viste også, RAD001 var en lovende middel til behandling af gastrisk cancer med at inducere cellecyklus og apoptose ved nedregulering ekspression af C-myc, CyclinD1 og Bcl-2, opregulering ekspression af P53. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at belyse den rolle, som aktivering af mTOR og i sidste ende til at foreslå mTOR som et konkret mål for mavekræft terapi
Bemærk
Grant Support:. Støttet af National High Technology Research and Development (863) Program for Kina
Noter
Da-zhi Xu, Qi-Rong Geng bidraget ligeligt til dette arbejde.
erklæringer
Tak
dette arbejde blev støttet af National High Technology Research and Development (863) Program for Kina. Forfatterne sætter pris på den fremragende teknisk bistand fra Li-Hui Wang, Fei-meng Zheng, Zheng-zhi Zou, Yan Zhang og Zi-jie Long.
Forfattere 'originale indsendte filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendt filer til billeder. 12885_2009_2335_MOESM1_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 1 12885_2009_2335_MOESM2_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 2 12885_2009_2335_MOESM3_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 3 12885_2009_2335_MOESM4_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 4 konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende interesser.

• Den prognostiske effekt af etnicitet til gastrisk og kræft i spiserøret: befolkningen-baserede erfaring i British Columbia, Canada
• Identifikation af prognostiske faktorer og kirurgiske indikationer for metastatisk gastrisk kræft