Aktiverad mammalian target of rapamycin är ett potentiellt terapeutiskt mål i gastric cancer

aktiverad mammalian target of rapamycin är ett potentiellt terapeutiskt mål i magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
mammalian target of rapamycin (mTOR) spelar en nyckelroll i cellulär tillväxt och homeostas. Syftet med vår nuvarande studie är att undersöka uttrycket av aktiverat mTOR (p-mTOR) i gastric cancerpatienter, deras prognostisk betydelse och hämmande effekt av RAD001 på tumörtillväxt och för att avgöra om riktad hämning av mTOR kan vara en potentiell terapeutisk strategi för magcancer.
metoder
uttrycket av p-mTOR upptäcktes i exemplar av 181 gastric cancer som genomgick radikal resektion (R0) genom immunhistokemi. Korrelationen av p-mTOR uttryck för clinicopathologic funktioner och överlevnad magcancer studerades. Vi bestämde också hämmande effekt av RAD001 på tumörtillväxt med hjälp av BGC823 och AGS humana magcancer-cellinjer.
Resultat
immunfärgning för p-mTOR var positiv i 93 av 181 (51,4%) gastric cancer, nära korrelerad med lymfan nod status och pTNM skede. Patienter med p-mTOR positiv visade signifikant kortare sjukdomsfri överlevnad (DFS) och total överlevnad (OS) priser än de med p-mTOR-negativa tumörer i univariable analyser, och det fanns en trend mot ett samband mellan p-mTOR uttryck och överlevnad i multivariabla analyser. RAD001 markant inhiberade dosberoende proliferation av humana gastriska karcinomceller genom nedreglering uttryck av p70S6k, p-p70S6k, C-myc, CyclinD1 och Bcl-2, uppreglera uttryck av P53.
Slutsatser
I gastric cancer, är p-mTOR ett potentiellt terapeutiskt mål och RAD001 var en lovande behandlingsmedel med inducering av cellcykelstopp och apoptos genom nedreglering uttryck av C-myc, CyclinD1 och Bcl-2, uppreglera uttryck av P53.
bakgrund
Gastric cancer är den fjärde vanligaste cancerformen och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i hela världen, inklusive 1 miljon nya fall per år i hela världen [1]. Omkring 60% av nya fall av magcancer förekommer i östra Asien [2], särskilt i Kina. Kirurgisk resektion är den mest effektiva behandlingen av gastrisk cancer och effektiviteten av kemoterapi fortfarande begränsad [3]. Många studier har visat att djupet av invasionen och antalet metastatiska lymfkörtlar är de viktigaste kraftfulla prediktorer för överlevnad för patienter med ventrikelcancer [4, 5]. Till exempel, i tidigare studier [6, 7], har vi funnit positiva lymfkörtel-förhållandet är en oberoende prognostisk indikator efter D2 resektion och intraperitoneal kemoterapi kan vara till nytta för patienter med ventrikelcancer. Men ett viktigt steg mot att förbättra kliniskt resultat ligger i ökad förståelse av tumören biologiska beteende, som kan hjälpa till att identifiera möjliga mål för individuell terapi [8, 9].
Under de senaste åren, molekylärt baserade metoder för behandling i magsäckscancer har fått stor oro. Flera artiklar har beskrivit vissa potentiella molekylära mål för terapi i gastrisk cancer, såsom epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) [13/10], vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) [14], recepteur d'origine Nantais (RON) [15 ].
mammalian target of rapamycin (mTOR) är en ny potentiell målmolekyl för cancerbehandling. Dess uttryck har visats i olika cellinjer och tumörprover, såsom lever tumörer [16], bröstcancer [17], gallvägarna adenokarcinom [18], och cervical cancer [19, 20]. Dessa studier visade att mTOR uttryck förknippas med dålig klinisk prognos. Lang et al [21]. har även observerat mTOR aktivering i humant gastric cancer in vitro och in vivo. De angav mTOR ofta aktiveras i human magcancer. Nyligen en oralt biotillgängliga derivat av rapamycin, RAD001 (everolimus, Novartis Pharma AG), har utvecklats. En fas III-studie visade behandling med everolimus förlänger progressionsfri överlevnad hos patienter med metastaserande njurcellskarcinom som hade kommit på andra riktade behandlingar [22]. RAD001 har också visats hämma proliferationen av tumörcelltillväxt i vissa karcinom [23, 24]. Men roll RAD001 i gastric cancer cell är inte klart.
Syftet med denna studie var att ytterligare analysera sambanden den mTOR uttryck med prognosen värde av aktiverad mTOR (p-mTOR), effekten av RAD001 på tillväxten och cellcykel av mänskliga gastric cancerceller in vitro och avgöra om magcancer är en bra kandidat för mål behandling med mTOR-hämmare.
Metoder
studerade patienterna Review, är detta retrospektiv studie bestod av 181 patienter som genomgick radikal resektion ( R0) för histologiskt bekräftad magcancer från Cancer Center i Sun Yat-sen universitetet mellan januari 1997 och december 2002. Alla patienter med histologiskt bekräftad adenocarcinom i magen hade genomgått antingen proximal partiell gastrektomi, distal partiell gastrektomi eller total gastrektomi. Etiskt godkännande erhölls från Sun Yat-sen universitetet Cancer Center forskningsetisk kommitté.
De med tillräckligt histologiska material och kompletta kliniska data kan tas upp. Urvalskriterierna ingår också histologiskt bekräftad R0 resektion, som definierades som ingen makroskopisk och mikroskopisk rest tumör och postoperativ överlevnadstiden ≥ 6 månader. Patienter med fjärrmetastaser och cancer i magsäcken stubben efter resektion för godartad sjukdom exkluderades från studien. Anledningen är att överlevnaden för patienter med avlägsna metastaser är ofta påverkas av många andra faktorer, såsom preoperativ kemoterapi eller obstruktion
Alla patienter hade uppföljning efter operation på sex till tolv månaders intervall. sista datum för uppföljning var december 2008. Medianuppföljningsperioden var 50 (medelvärde: 50,66; intervallet 10-128) månader för alla patienter, och 74 månader (medelvärde: 72,80, range 27-128) för överlevnad. Mediantiden för uppföljning var 40 (medelvärde: 43,71; intervallet 11-125) för patienter som hade tumörer i p-mTOR positiv uttryck, och 60,5 månader (medelvärde: 58.01; range 10-128) för negativa uttryck. Överlevnad beräknades från dagen för diagnos fram till dagen för dödsfall eller senaste uppföljningen.
Provtagning och immunfärgning för p-mTOR
Alla tumörprover erhölls från kirurgiskt resekterade gastric cancer innan adjuvant terapi. Formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadsblock lagrades vid rumstemperatur identifieras av ett identifikationsnummer. Fem-im tjock vävnadssnitt skars från paraffinblock, avparaffinerades i xylen och rehydreras. Antigenisk hämtning bearbetades med natriumcitrat. Objektglasen inkuberades sedan i 0,3% H 2O 2 under 10 min, och blockerades i 1% bovint serumalbumin under 60 min följt av en kanin monoklonal antikropp specifik för p-mTOR (Phospho-mTOR, Ser2448, 49F9; Cell Signa Technology) vid 4 ° C över natten och färgades sedan med 3,3-diaminobensidin. Efter visualisering av immunoreaktivitet, var sektionerna motfärgades med hematoxylin och monterades sedan.
Utvärdering av immunhistokemisk färgning sälja The immunostained sektioner utvärderades och vävnader från humana prostata adenokarcinom tjänade som positiv kontroll. Enligt nyligen beskrivna kriterier för rating mTOR uttryck, var färgningsintensitet bestämdes som 0 (frånvarande), en (svag), och 2 (stark) och expressionsnivåer av de biomarkörer ades semiquantified med en immunhistokemiskt poäng (intervall, 0-200) beräknat genom att multiplicera färgningsintensitet med andelen positiva tumörceller [18]. Patienter med en immunohistokemi poäng ≤ 20 ansågs som p-mTOR-negativa och de med en poäng på > 20 såsom p-mTOR-positiva. Alla Glasen oberoende bedömning av två oberoende patologer utan någon kunskap om patienternas klinisk information. När yttranden från de två utvärderare var annorlunda, nåddes en överenskommelse genom noggrann diskussion
Cellinjer och odlingsbetingelser
mänskliga magsäckscancer cellinjer BGC823 och AGS (ATCC-nummer: CRL-1739). Som är dåligt differentierade var gåvor från Peking University School of Oncology (Beijing, Kina.) [25]. Cellinjerna hölls i RPMI 1640-medium (Invitrogen) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (Hyclone), penicillin (100 enheter /ml) och streptomycin (100 enheter /ml) vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad inkubator .
cellviabiliteten analys
för att analysera effekten av RAD001 på mänskliga gastric cancerceller, cellviabiliteten bestämdes genom MTT-analys. RAD001 tillhandahölls av Novartis Pharma (Basel, Schweiz). För viabilitetsanalys, var logaritmiskt växande celler stimulerades med olika doser av RAD001 (0, 5, 10, 20 och 40 | iM). Vid slutet av odlingsperioden, 20 mikroliter av tetrazoliumfärgämne 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5- difenyltetrazoliumbromid (MTT) (Sigma, USA) lösning vid 0,2 mg /ml i PBS tillsattes , den optiska densiteten vid 490 nm (OD490) bestämdes genom användning av en enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) läsare. Medelvärden beräknades från trefaldiga odlingar.
Cellcykelanalys
Celler uppsamlades och fixerades i 70% etanol över natten vid 4 ° C. Cellerna tvättades sedan och färgades med propidiumjodid (PI) (Sigma) 5 mikrogram /ml. Efter 30 min vid rumstemperatur skyddad från ljus, analyserades cellerna via flödescytometri med användning av en Becton Dickinson FACScan.
Annexin V assay
Proven tvättades med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och med användning Annexin V-fluorescein isotiocyanat (FITC) och PI-färgning för bestämning av fosfatidylserin exponering på det yttre plasmamembranet. Efter inkubation under 30 min vid rumstemperatur skyddad från ljus proverna kvantifierades genom flödescytometri med användning av en Becton Dickinson FACScan.
Omvänd transkription-PCR
Totalt RNA extraherades med användning av TRIzol-metoden. RNA omvänt Transcripted användning av ett kommersiellt tillgängligt kit (Fermentas, USA). Blandningen (25 | il totalt) för PCR bestod av 0,5 | j, l cDNA, 0,5 U Taq DNA-polymeras, 2,5 | il 10 x PCR-buffert, 2,5 mM dNTP blandning, och 50 pM sense- och antisense-primrar vardera. CyclinD1 och C-myc analyserades genom följande primers: CyclinD1 5'GAACAGAAGTGCGAGGAGGAG3 'och omvända primer 5'AGGCGGTAGTAGGACAGGAAG3 "; C-myc, 5 'CGAGCTGCTGGGAGGAGACAT3' och 5 'AGCCGCCCACTTTTGACA GG3' Actin:. 5'GGCACCCAGCACAATGAA 3 'och 5' TAGAAGCATTTGCGGTGG 3 '
Cellysat och Western blot-analys
Celler lyserades i lysbuffert och koncentrationen av protein bestämdes genom Bradford-färgmetoden (Bio-Rad Laboratories). Lika stora mängder av cellextrakt underkastades SDS-PAGE och överfördes till PVDF-membran (Bio-Rad). Western blot analyser gjordes med olika specifika primära antikroppar. Antikroppar som känner igen fosfo-p70S6k (Thr389), p70S6k, fosfor-mTOR (Ser2448), Bcl-2 och p53 var från Cell Signa Statistisk.
Analyser
primära slutpunkten för vår studie var total överlevnad (OS). Det definierades som perioden mellan tidpunkten för kirurgi och död. Sjukdomsfri överlevnad (DFS) var tiden mellan tidpunkten för kirurgi och återfall eller tumörrelaterade dödsfall. Den analyserades som en sekundär slutpunkt. Föreningen p-mTOR uttryck med olika clinicalopathologic funktioner analyserades med hjälp av chi-square test. Kumulativ överlevnad och sjukdomsfri överlevnad uppskattades av Kaplan-Meier-metoden. Log-rank test användes för att utvärdera den statistiska signifikansen av skillnader mellan överlevnadskurvor. En Cox proportionella hazardmodell (bakåt, stegvis) för flerdimensionell analys tillämpades för faktorer som uppnått betydelse i univariable analys. Statistisk analys utfördes med hjälp av SPSS mjukvara (version 13 för Windows, SPSS, Chicago, IL). Skillnader på P < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant.
Resultat
clinicopathologic funktioner
Totalt 181 patienter inkluderades i denna studie. Medianåldern var 59 år (intervall 23-83 år). De clinicopathologic egenskaper studiepopulationen är sammanfattade i Tabell 1. 129 patienter var män och 52 kvinnor. 77 av 181 tumörer (42,5) var från den övre magen, 74 av 181 patienter (40,9%) var från den nedre delen av magen, och de återstående tumörerna var från mitten och hela kroppen av magen. 118 av 181 (65,2%) patienternas tumörstorlek var > 4 cm, och 63 (34,8%) var ≤ 4 cm. I enlighet med Världshälsoorganisationens kriterier 4 av 181 tumörer (2,2%) var väl differentierad, 55 av 181 tumörer (30,4%) var måttligt differentierade, 116 var dåligt differentierade, och 6 var odifferentierad. Postoperativ kirurgisk skede klassificerades enligt 2002 UICC /AJCC klassificering [26] .table en clinicopathologic sambandet mellan p-mTOR uttryck i magcancer
Faktorer
Alla patienter
Nej av patienterna (%)
P
vid N
= 181 (%)
mTOR negativ
mTOR positiv
vid Age (y) katalog 0,256 Hotel < 60
95 (52,5) Review 50 (56,8) Review 45 (48,4) katalog ≥60
86 (47,5) Review 38 (43,2) Review 48 (51,6)
Sex
0,926
Man
129 (71,3) Review 63 (71,6) Review 66 (71,0) Review Kvinna
52 (28,7) Review 25 (28,4)
27 (29,0) Site
0,053
Övre
77 (42,5) Review 33 (37,5) Review 44 (47,3) katalog USA
28 ( 15,5) Review 10 (11,4) Review 18 (19,4) Review lägre
74 (40,9) Review 43 (48,9) Review 31 (33,3) Review Diffusa
2 ( 1,1) katalog 2 (2,3) Review 0 (0,0) Review Tumörstorlek storlek~~POS=HEADCOMP
.172
≤ 4 cm
63 (34,8) Review 35 (40,0) Review 28 (30,1) Hotel > 4 cm
118 (65,2) Review 53 (60,0) Review 65 (69,9) Review Borrmann typ
0,398
Tidigt
7 (3,9) Review 6 ( 6,8) katalog 1 (1,1) Review jag
4 (2,2) Review 2 (2,3) Review 2 (2,1) Review II
65 (35,9) Review 31 ( 35,2) Review 34 (36,6) Review III
101 (55,8) Review 47 (53,4) Review 54 (58,1) Review IV
4 (2,2) Review 2 ( 2,3) katalog 2 (2,1) Review betygs
0,999 1
4 (2,2) Review 2 (2,3) Review 2 (2,1) 2
55 (30,4) Review 27 (30,7) Review 28 (30,1) katalog 3
116 (64,1) Review 56 (63,6) Review 60 (64,5) 4
6 (3,3) Review 3 (3,4) Review 3 (3,3) Review Patologisk T klassificering
0,168
T1
17 (9,4) Review 12 (13,6) Review 5 (5,4) Review T2
35 (19,3) Review 18 (20,5) Review 17 (18,3) Review T3
119 (65,7) Review 55 (62,5) Review 64 (68,8) Review T4
10 (5,5) Review 3 (3,4) Review 7 (7,5) Review Patologisk N status
0,008
N negativ
44 ( 24,3) Review 29 (33,0) Review 15 (16,1) Review N positiv
137 (75,7) Review 59 (67,0) Review 78 (83,9) Review Patologisk stadium (pTNM)
0,026
jag
26 (14,4) Review 17 (19,3) Review 9 (9,7) Review II
47 (26,0) Review 28 (31,8)
19 (20,4) Review III
100 (55,2) Review 41 (46,5) Review 59 (63,4) Review IV
8 (4,4) Review 2 (2,3)
6 (6,5) Review 129 av 181 patienter (71,2%) hade mer avancerad T skede av sjukdomen (PT3 + PT4), och 137 patienter (75,7%) hade lymfkörtel metastas. Totalt patienter stadium I-IV var 26, 47, 100 och 8 fall, respektive.
P-mTOR uttryck i magcancer
immunfärgning av p-mTOR var cytoplasmatisk och delvis membran. Figur 1 visar representativa exempel på p-mTOR immunfärgning. Den normala magslemhinna är negativt för p-mTOR. Av de 181 patienter, 93 (51,4%) var p-mTOR-positiva tumörer. Figur 1 Exempel på p-mTOR immunfärgning. (A) Normal magslemhinna är negativa för p-mTOR (ursprunglig förstoring x 200). (B) Den normala magslemhinna är negativa för p-mTOR (ursprunglig förstoring x 400) (C) Positiva uttryck av p-mTOR i magcancer (ursprunglig förstoring x 200). (D) Negativ uttryck av p-mTOR i magcancer (ursprunglig förstoring x 200).
Överlevnadsanalys
Patienter med p-mTOR positiv magcancer uppvisade signifikant kortare sjukdomsfri och total överlevnad än de med p- mTOR negativ magcancer (DFS, 48,9% mot 30,1%, p = 0,006; OS, 51,1% mot 34,4%, p = 0,011; tabell 2, fig 2A, B). Univariable analys visade att överlevnadstiden minskade också med högre pT klassificering (DFS, p = 0,001; OS, P = 0,005), lymfkörtel metastas (DFS, p < 0,0001, OS, P = 0,001) och avancerade pTNM stadium (DFS, p < 0,001; OS, P = 0,001). Det fanns inget samband mellan DFS eller OS och ålder, kön eller tumör size.Table 2 Univariable analys av sjukdomsfri och total överlevnad i magcancer
vid vid Sjukdomsfri suivival
Övergripande survival

Characteristic

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

Age(y)
0,343
0,583 Hotel < 60
95
1,00
1,00
≥60
86
0,834
0,573-1,214
0,898
0,611-1,320 Sex
.
662 0,950
Man
129
1,00
1,00
Kvinna
52
0,909
0,591-1,396
0,986
0,639-1,521
Tumörstorlek storlek~~POS=HEADCOMP
0,151
0,232
≤4 cm
63
1,00
1.00 Hotel >
4 cm
118
1,345
0,897-2,016
1,287
0,851-1,945
pT skede 0,001
0,005
PT1
17
1,00
1,00
pT2
35
1.549
0.558-4.301
.401
1.535
0.553-4.264
.411
pT3
119
3.546
1.437-8.750
.006
3.237
1.310-8.001
.011
pT4
10
4.738
1.547-14.506
.006
4.068
1.289-12.836
.017
pN stadium
< 0,0001
0,001
Negativ
44
1,00
1,00
Positiv
137
2,617
1,538-4,451
2,389
1.401- 4,075
pTNM steget
< 0,0001
0,001
I
26
1,00
1,00
II
47
2.920
1.197-7.121
.018
2.860
1.173-6.973
.021
III
100
4.955
2.152-11.409
< 0,0001
4,455
1,930-10,281 Hotel < 0,0001
IV
8
7,369
2,470-21,981
< 0,0001
6,103
1,965-18,957
0,002
p-mTOR
0,008
0,013
Negativ
88
1,00
1,00
Positiva
93
1,667
1,146-2,454
1,644
1,112-2,430
Figur 2 Kaplan-Meier beräkningar av sannolikheten för överlevnad. Patienter med p-mTOR positiv visade betydligt kortare total överlevnad (A) och sjukdomsfri överlevnad (B) priser än de med p-mTOR negativa uttryck. (P = 0,011 och p = 0,006 respektive) katalog I flerdimensionell analys, lymfkörtel metastas (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,038). Och pT steg (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,046) var betydande oberoende prognostisk faktor för överlevnadstid. Dessutom, variabelanalys (tabell 3) visade också en trend mot ett samband mellan p-mTOR uttryck och minskad överlevnad, men trenden nådde inte statistisk signifikans (DFS, p = 0,059; OS, P = 0,070) .table 3 Variabel cox regressionsanalys av sjukdomsfria och övergripande kvarlevor
vid
Sjukdomsfri suivival
Övergripande survival

Factors

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

p-mTOR

0,059 0,070
Negativ
88
1,00
1,00
Positiv
93
1,452
0,986-2,138
1,443
0,970-2,147
Infiltrerande djup
0,018
0,046
PT1
17
1,00
1,00
pT2
35
1.050
0.366-3.016
0.928
1.078
0.375-3.101
0.889
pT3
119
2.251
0.867-5.845
0.096
2.146
0.823-5.595
0.118
pT4
10
2.926
0.920-9.305
0.069
2.616
2.616-8.580
0.113
Lymph nodstatus
0,018 0,038
Negativ
44
1,00
1,00
Positiv
137
1,981
1,981-3,488
1,828
1,034-3,233
RAD001 hämmar proliferation och förhindrar p70S6k fosforylering
att undersöka effekterna av RAD001 på proliferationen av humana magcancer-cellinjer BGC823 och AGS, utförde vi proliferationsanalyser med 48-timmars exponering för RAD001. Som ett resultat, RAD001 genererar signifikant inhibering på båda cellinjer i ett dosberoende sätt. (Figur 3A). Figur 3 (A) RAD001 inhiberar proliferation av gastriska cancerceller. Gastriska cancerceller behandlades med de indikerade koncentrationerna av RAD001 i närvaro av 10% FBS under 48 h. Cellviabilitet bestämdes med MTT-analys. (B) Fosforylering av p70S6k minskade signifikant i en dosberoende sätt i både AGS och BGC823 celler genom behandling med RAD001. Båda cellinjerna inkuberades med ökande dos av RAD001 under 48 h, fick cellysaten utsattes för Western blot-analys med fosforylerade p-S6K och S6K antikroppar.
Western-blot-experiment utfördes med RAD001 vid 0, 5, 10, 20 | iM under 48 h. P70s6 kinas är ett viktigt mål av mTOR och mTOR-beroende fosforylering nedströms möjliggör översättning av ribosomproteiner. Vi undersökte fosforyleringen status nedströms mål p70S6k genom immunoblotting. Som visas i figur 3B, fann vi att behandling av båda cellinjerna BGC823 och AGS med RAD001 avsevärt förhindra fosforylering av p70S6k i en dosberoende sätt.
RAD001 inducerar G0 /G1-cellcykelarrest och apoptos i gastric cancerceller
för att avgöra om förtrycket i celltillväxt berodde på G0 /G1-fas stillestånd eller apoptos, cellcykelfördelning analyserades genom FCM. Figur 4 visar att behandling av BGC823 celler av med RAD001 under 48 timmar resulterade i en robust G1 gripande och främjas apoptos. Med den ökande dosen av RAD001 förblev fler och fler celler i G1-fas, medan cellcykelprogression i S-fasen var minska (Figur 4A). RT-PCR-analys avslöjade RAD001 minskade dosberoende mRNA-nivån av cyklin D1 och C-myc (Figur 4B). Figur 4 RAD001 inducerar cellcykelstopp och apoptos i BGC823 celler. (A) BGC823 celler exponerades för olika koncentrationer av RAD001 under 48 timmar. (B) RNA extraherades från cellerna. Cyklin D1 och C-myc expressionsnivån detekterades genom RT-PCR, aktin som en laddningskontroll. (C) Cellerna inkuberades under 48 timmar med indikerade doser av RAD001 innan färgning med annexin V-FITC. Procenthalterna av apoptotiska celler visas. (D) Cellerna inkuberades under 48 timmar med angivna doser av RAD001. Celler samlades, lyserades och utsattes för Western blot-analys med Bcl-2 och p53-antikroppar. GAPDH användes som en laddningskontroll.
Annexin-V-analyser visade att RAD001 inducerad apoptos signifikant i BGC823 celler. En ökning av apoptos hastigheten analyserades med FCM med ökningen av dosen (Figur 4C). Western blot-analys visade RAD001 dosberoende minskande proteinnivån av Bcl-2 och öka proteinnivån hos p53 (Figur 4D). Liknande resultat observerades i AGS-celler (data visas ej) Diskussion
mammalian target of rapamycin (mTOR).
Upptäcktes i början av 1990-s studera verkningsmekanismen av rapamycin, som ursprungligen konstaterades som en svampdödande medel och senare erkänd som cancer egenskaper [27]. Som Ser /Thr proteinkinas, mTOR spelar en nyckelroll i celltillväxt och homeostas [28]. Den mTOR protein bildar ett komplex med adapter proteiner, mTORC1 (mammalian target of rapamycin komplex 1) och mTORC2. Aktivering av mTORC1 reglerar celltillväxt genom att modulera proteinsyntes, ribosom biogenes och autophagy [29]. Den mTORC2 vägen spelar en nyckelroll att aktivera Akt, som PDK1 (3-fosfoinositid-beroende proteinkinas 1) och PI3K, ett potentiellt mål drog för cancer där det finns Akt avreglering [26].
I den aktuella studien, vi konstaterade att 93 (51,4%) patienter hade positiva uttryck av p-mTOR 181 gastric cancerpatienter. I överensstämmelse med vårt resultat, i en annan studie, inklusive 1072 patienter, uttrycket av p-mTOR är 46,5% [30].
Tidigare studier har rapporterat prognostisk betydelse för p-mTOR uttryck. Herberger et al [18]. identifierade p-mTOR att vara en oberoende prognostisk faktor för dödsfall hos patienter med gallvägarna adenocarcinom. I deras studie var totalöverlevnad signifikant kortare hos patienter med p-mTOR-positiva tumörer jämfört med patienter med p-mTOR-negativa tumörer (P = 0,004). I magcancer, Yu et al. utvärderade uttryck av p-mTOR i 1,072 gastric cancerpatienter med användning av en vävnadsmikromatris, vilket visar överexpression av p-mTOR var en oberoende prognostisk faktor [30]. Men i en studie ingick 109 patienter med mag adenokarcinom som genomgick en radikal gastrektomi [31], Murayama et al. fann varken cytoplasmisk p-mTOR eller kärn p-mTOR var oberoende prognostisk faktor, även om de identifierade cytoplasmisk p-mTOR uttryck i samband med sämre överlevnad och korreleras med djupet av tumörinvasion, lymfkörtlar och tumörstadium. I den aktuella studien, bekräftade vi att PT klassificering och lymfkörtel status är oberoende prognostisk indikator på kliniskt utfall i gastric cancerpatienter med multivariabla analyser. Men eftersom de flesta patienter närvarande med lokalt avancerad sjukdom, andra sekundära prognostiska markörer, särskilt p-mTOR, kan vara till nytta [13]. Våra resultat visar tydligt att p-mTOR uttryck korrelerar starkt med dålig övergripande och sjukdomsfri överlevnad i univariable analyser med en trend mot korrelation i multivariabla analyser.
I enlighet med vår aktuella studien, har flera studier också erkänt de antiproliferativa effekterna av mTOR-hämmare i gastric cancerceller. Till exempel, Lang et al [21]. identifierade rapamycin kan hämma magcancer celltillväxt i både en subkutan tumörmodell och i en experimentell modell. Deras resultat belysa lämplighet mTOR-inhibitorer som skall användas i en antiangiogen kontext för terapi av magcancer.
Emellertid är RAD001 en ny mTOR inhibitor som anticancermedel. Mekanismen om RAD001 i magcancer är inte klart. Cejka et al. visade den antiangiogena aktiviteten hos RAD001 kombinerat med en hög dos av cyklofosfamid visade synergistisk antitumöraktivitet mot magcancer [32]. De har också funnit att RAD001 minskad proliferation och försvagade produktion av HIF-1α samt VEGF i gastriska cancerceller in vitro [33]. I den aktuella studien, våra data visade att RAD001 terapi försvagade fosforylering av p70S6k och markant hämmade spridningen av gastric cancerceller genom cellcykelstopp och apoptos in vitro. Vi hittade RAD001 inducerade G0 /G1-fasen gripandet, som var förenat med minskad cyklin D1 och C-myc. Dessutom visade vi för första gången att RAD001 som en ny mTOR-hämmare dosberoende apoptos i gastric cancerceller genom Annexin V-analyser. Denna effekt kan dikteras av den cellulära sammanhang och mål nedströms inklusive P53 och Bcl-2. Dessa fynd kan ytterligare förklara effekten av RAD001.
Slutsats
Sammanfattningsvis vi genomfört systematisk forskning till mTOR i magcancer, som anger förhållandet uttrycket med prognosen värde av aktiverad mTOR (p-mTOR) in vivo, effekten av RAD001 och den del av mekanismer i gastriska cancerceller in vitro. Våra resultat indikerade att p-mTOR skulle tjäna som en potentiell biologisk markör för att identifiera en undergrupp av gastric cancerpatienter med dålig prognos. Den visade också att RAD001 var en lovande medel för behandling av gastrisk cancer med inducering av cellcykelstopp och apoptos genom nedreglering uttryck av C-myc, CyclinD1 och Bcl-2, uppreglera uttryck av P53. Ytterligare studier behövs för att belysa den roll som aktiveringen av mTOR och slutligen föreslå mTOR som ett konkret mål för magcancer terapi
notis bevilja stöd. Med stöd av National högteknologi forskning och utveckling (863) Program Kina
Notes
Da-Zhi Xu, Qi-Rong Geng bidragit lika för detta arbete.
förklaringar
Tack
detta arbete stöddes av National högteknologi forskning och utveckling (863) Program Kina. Författarna uppskattar utmärkt teknisk hjälp av Li-Hui Wang Fei-Meng Zheng, Zheng Zhi Zou, Yan Zhang och Zi-Jie Long.
Authors 'ursprungliga inlämnade filer för Images of Nedan finns länkar till författarnas original lämnat filer för bilder. 12885_2009_2335_MOESM1_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 1 12885_2009_2335_MOESM2_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 2 12885_2009_2335_MOESM3_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 3 12885_2009_2335_MOESM4_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 4 Konkurrerande intressen
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande intressen.

• Den prognostiska effekten av etnicitet för mag- och matstrupscancer: den populationsbaserade erfarenhet i British Columbia, Kanada
• Identifiering av prognostiska faktorer och kirurgiska indikationer för magsäckscancer