Aktivni sisavaca cilj rapamicina je potencijalni terapijski cilj u želučanoj cancer

Aktivni sisavaca cilj rapamicina je potencijalni terapijski cilj u raka želuca pregled apstraktne pregled pozadine
sisavaca cilj rapamicina (mTOR) igra ključnu ulogu u stanični rast i homeostazu. Svrha našeg ove studije je istražiti izražaj aktiviranog mTOR (p-mTOR) u bolesnika s rakom želuca, njihov prognostički značaj i učinak u inhibiciji RAD001 na tumorski rast i kako bi se utvrdilo je li ciljano inhibicija mTOR mogao biti potencijalna terapijska strategija raka želuca.
Methods
ekspresija p-mTOR otkrivena je u uzorcima 181 želučanog karcinoma podvrgnutih radikal resekciju (R0) pomoću imunohistokemije. Korelacija p-mTOR izražavanja na kliničko mogućnosti i preživljavanje karcinoma želuca je proučavao. Također smo odredili učinak u inhibiciji RAD001 na tumorski rast pomoću BGC823 i AGS staničnih linija raka želuca. | Rezultati
imunološko p-mTOR bio je u 93 od 181 (51,4%) želučanog karcinoma, usko povezana s limfna status čvor i pTNM pozornici. Bolesnici s p-mTOR pozitivno pokazalo je značajno kraće preživljenje bez bolesti (DFS) i ukupno preživljenje stope (OS) od onih s p-mTOR-negativnih tumora u Univarijatnom analizama, a tu je trend korelacije između izraza p-mTOR i opstanak u multivarijabilnih analizama. RAD001 značajno inhibiraju proliferaciju ovisno o dozi ljudskih stanica karcinoma želuca podreguliranjem ekspresije p70S6K, p-p70S6K, C-myc, CyclinD1 i Bcl-2, povećati ekspresiju p53. Pregled Zaključci
u želučanom rak, p-mTOR potencijalni terapeutski cilj i RAD001 bio obećavajući agens tretman induciranje staničnog ciklusa i apoptozu podreguliranjem ekspresiju c-myc, CyclinD1 i Bcl-2, povećati ekspresiju p53. pregled pozadini pregled, karcinom želuca je četvrti najčešći karcinom i drugi vodeći uzrok raka povezanih smrti u svijetu, uključujući i 1 milijun novih slučajeva godišnje širom [1] svijet. Oko 60% novih slučajeva raka želuca javljaju u istočnoj Aziji [2], a posebno u Kini. Kirurška resekcija je najučinkovitiji tretman za rak želuca i učinkovitosti kemoterapije i dalje je ograničen. [3] Mnoga istraživanja su pokazala da je dubina invazije i broj metastatskih limfnih čvorova su najvažniji moćni prediktori preživljenja bolesnika s karcinomom želuca [4, 5]. Na primjer, u prethodnim studijama [6, 7], našli smo pozitivan omjer limfnih čvorova je neovisno prognostičkim indikatorom nakon resekcije D2 i intraperitonealnom kemoterapijom, mogu biti prikladna za pacijente s rakom želuca. Međutim, temeljni korak prema poboljšanju klinički ishod leži u povećanom razumijevanju biološkog ponašanja tumora, koji mogu pomoći u identificiranju mogućih ciljeva za individualne terapije [8, 9].
U posljednjih nekoliko godina, molekularno temelji pristupe za liječenje u rak želuca je dobila veliku zabrinutost. Nekoliko članaka opisali neke potencijalne ciljane molekule za terapiju kod raka želuca, kao što je receptor faktora epidermalnog rasta (EGFR) [10-13], vaskularni endotelni faktora rasta (VEGF) [14], recepteur d'origine nantais (RON) [15 ].
sisavaca cilj rapamicina (mTOR) je novi potencijalni molekularni cilj za antitumorski terapiju. Njegova ekspresija je pokazano u različitim staničnim linijama i tumorskih uzoraka, kao što su jetra neoplazme [16], raka dojke [17], žučnog sustava adenokarcinom [18] i rak vrata maternice [19, 20]. Ove studije su pokazale da je ekspresija mTOR bio povezan sa slabom kliničkom prognozom. Lang et al [21]. također promatrati aktivaciju mTOR ljudskog raka želuca in vitro i in vivo. Oni naznačeno mTOR često se aktivira u ljudskom raka želuca. Nedavno, oralno biološki dostupne derivat rapamicina, RAD001 (everolimus; Novartis Pharma AG), razvijen je. Trećoj fazi pokusa otkrio liječenje everolimusa produžuje bez progresije opstanak u bolesnika s metastatskim karcinomom bubrežnih stanica koja je napredovala na druge ciljane terapije [22]. RAD001 Također je pokazano da inhibira proliferaciju rasta tumorskih stanica u nekim karcinomima [23, 24]. No, uloga RAD001 u želučanom rak stanica nije jasno.
Ciljevi ovog istraživanja su da se dodatno analizirati odnose izraz mTOR s prognozu vrijednosti aktiviranog mTOR (p-mTOR), učinak RAD001 na rast i stanica ciklus ljudskih stanica raka želuca in vitro i utvrditi da li rak želuca je dobar kandidat za ciljanu terapiju inhibitorima mTOR. pregled Metode
Pacijenti studirao pregled Ova retrospektivna studija sastojala se od 181 pacijenata koji su se podvrgnuli radikalnu resekcija ( R0) za histološki potvrđenim karcinomom želuca od Cancer Center Sun Sveučilišta Yat-sen u razdoblju od siječnja 1997. do prosinca 2002. u svih bolesnika s histološki potvrđeno adenokarcinom želuca bila podvrgnuta bilo proksimalni djelomično gastrektomije, distalni djelomično gastrektomije ili ukupnu gastrektomije. Etički pristanak dobiven iz Sun Yat-sen University Cancer Center istraživanja Etičkog povjerenstva.
Oni s odgovarajućom histološkog materijala i potpunih kliničkih podataka su uvjete za uključivanje. Kriteriji prihvatljivosti također uključeni histološki potvrđeno R0 resekcija, koji je definiran kao ne makroskopskim i mikroskopskim ostatnog tumora i postoperativnom vrijeme preživljavanja ≥ 6 mjeseci. Bolesnici s udaljenim metastazama i karcinom želuca panja nakon resekcije za benignu bolest bili su isključeni iz studije. Razlog tome je što je opstanak bolesnika s udaljenim metastazama često utječu i mnogi drugi čimbenici, kao što su preoperativne kemoterapije ili opstrukcije
Svi bolesnici imali praćenja nakon završetka operacije na 6 do 12 mjeseci intervalima. konačni datum povratka bilo je prosinac 2008. godine Srednje razdoblje praćenja bilo je 50 (prosjek: 50,66; rasponu od 10 do 128) mjeseci za sve pacijente, i 74 mjeseci (znači: 72.80, raspon 27-128) za opstanak. Srednje trajanje praćenja bio je 40 (srednja: 43.71, raspon 11-125) kod pacijenata koji su imali tumore p-mTOR pozitivnog izražavanja, te 60,5 mjeseci (znači: 58.01, raspon 10-128) za negativne izražavanja. Preživljavanje je izračunata od dana postavljanja dijagnoze do datuma smrti ili zadnjeg nastavka.
Prikupljanje uzoraka i imunološko p-mTOR
Svi uzorci tumora su dobiveni iz kirurški reseciranih želučanog karcinoma prije adjuvantne terapije. Formalinom fixed, paraffin-embedded blokovi tkiva bile su pohranjene na sobnoj temperaturi, koja je identificirana sa identifikacijskim brojem. Pet-um debljine sekcije tkiva su izrezani iz parafinskih blokova, deparafmizirani u ksilenu i rehidrirane. Antigeni dohvat je obrađen sa natrij citrata. Stakalca su potom inkubirane u 0,3% 'H-sub> 2O 2 za 10 min, i blokirane s 1% albumina goveđeg seruma na 60 min, nakon čega slijedi zečjeg monoklonskim antitijelima specifičnim za p-mTOR (fosfo-mTOR, Ser2448, 49F9 Cell Signalling Technology) na 4 ° C preko noći, i zatim oboje sa 3,3-diaminobenzidin. Nakon vizualizacije imunoreaktivnosti, sekcije su prebrojane s hematoksilinom i montiran. Pregled Procjena Imunohistokemijsko bojanje
imunološki Sekcije su ocijenjeni i tkiva iz humanih adenokarcinoma prostate je služio kao pozitivna kontrola. Prema nedavno opisanim kriterijima Ocjena mTOR izražavanja, bojenje intenzitet je određen kao 0 (nema), 1 (slabo) i 2 (jakim) i ekspresije tih biomarkera su semiquantified pomoću imunohistokemiju rezultat (raspon 0-200) izračunava se tako da se pomnoži intenzitet bojenja s postotak pozitivnih tumorskih stanica [18]. Bolesnici s jedne imunohistokemijske rezultatom od ≤ 20 se smatralo da su p-mTOR-negativnih i oni s rezultatom od > 20, kao p-mTOR-pozitivne. Svi slajdovi su nezavisno ocijeniti dva neovisna patologa, bez ikakvog znanja o kliničkoj podataka pacijenata. Kada se mišljenja dvaju procjenitelja bili različiti, postignut je dogovor pažljivim raspravu
Stanične linije i uvjeti uzgoja
Ljudski rak želuca stanične linije BGC823 i AGS (ATCC broj: CRL-1739). Koji su slabo diferencirani su bili darovi iz Pekinškog University School of Oncology (Peking, NR Kina.) [25]. Stanična linije su održavane u RPMI 1640 mediju (Invitrogen) uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (Hyclone), penicilinom (100 jedinica /mL) i streptomicina (100 jedinica /ml) na 37 ° C i 5% CO2 u vlažnom inkubatoru . pregled, stanica održivost test pregled analizirati učinak RAD001 na ljudskim stanicama raka želuca, održivost stanica određena je MTT testom. RAD001 dao Novartis Pharma (Basel, Švicarska). Za određivanje vitalnosti, logaritamski rastuće stanice su stimulirani s različitim dozama RAD001 (0, 5, 10, 20 i 40 uM). Na kraju perioda kultiviranja, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolijeva bromida (MTT) (Sigma, SAD) otopine na 0,2 mg /dodano je 20 ul tetrazolium boje ml u PBS je optička gustoća pri 490 nm (OD490) određena je pomoću enzimski vezana imunosorpcijske analize (ELISA) čitača. Srednje vrijednosti izračunate su iz triplikatnih kultura. Analiza staničnog ciklusa pregled pregled Stanice su prikupljene i fiksirane u 70% etanolu preko noći na 4 ° C. Stanice su zatim isprane i obojene s propidij jodida (PI) (Sigma) 5 ug /ml. Nakon 30 minuta na zaštićeno od svjetla sobne temperature, stanice su analizirane pomoću protočne citometrije pomoću Becton Dickinson FACScanu. Pregled Annexin V Test pregled uzorci su isprani s fosfat-puferiranom fiziološkom otopinom (PBS) i uporabom aneksin V-fluorescein izotiocijanat (FITC) i PI bojanja za određivanje ekspozicije fosfatidilserina na vanjskoj plazma membranu. Nakon inkubacije 30 minuta pri zaštićena od svjetlosti sobnoj temperaturi, uzorci su bili kvantificirani su protočnom citometrijom pomoću Becton Dickinson FACScanu.
Reverznom transkripcijom-PCR pregled Ukupna RNA je ekstrahirana pomoću trizolne metode. RNA je obrnuto transcripted korištenjem komercijalno dostupnog pribora (Fermantas, USA). Smjesa (25 ul ukupna) za PCR se sastojao od 0,5 ul cDNA, 0,5 U Taq DNA polimeraze, 2,5 ul 10 × PCR pufer, 2,5 mM dNTP smjese, i 50 pM smislenim i protivsmislenim zaglavljima svaki. CyclinD1 i C-myc analizirani su sljedeći primeri: CyclinD1 5'GAACAGAAGTGCGAGGAGGAG3 'i reverzni prajmer 5'AGGCGGTAGTAGGACAGGAAG3'; C-myc, 5 CGAGCTGCTGGGAGGAGACAT3 'i 5' AGCCGCCCACTTTTGACA GG3 'Actin. 5'GGCACCCAGCACAATGAA 3' i 5 'TAGAAGCATTTGCGGTGG 3' pregled Stanični lizat i Western blot analiza pregled Stanice se liziraju u puferu za liziranje i koncentracija proteina se određuje Bradfor-ovom metodom boje (bio-Rad Laboratories). Jednake količine ekstrakta stanica su bili podvrgnuti SDS-PAGE i prenesen na PVDF membranu (Bio-Rad). Western blot analize su učinili s različitim specifičnim primarnim antitijelima. Antitijela koja prepoznaju fosfo-p70S6K (Thr389), p70S6K, fosfo-mTOR (Ser2448), bcl-2 i p53 su iz stanične signalne. Pregled statističkih analiza pregled Primarni cilj našeg istraživanja bio ukupno preživljenje (OS). Je definiran kao periodu za vrijeme operacije i smrti. Bez znakova bolesti opstanak (DFS) je vrijeme između vremena operacije i recidiva ili smrti povezanih s tumorima. To je analizirana kao sekundarna krajnja točka. Udruga p-mTOR izražavanja s raznim clinicalopathologic značajkama analiziran pomoću hi-kvadrat test. Kumulativno preživljavanje i opstanak bolesti bez procijenjeni su Kaplan-Meier metodi. Log-rank test korišten je za procjenu statističke značajnosti razlike između krivulja preživljavanja. COX Model proporcionalna opasnosti (unatrag, korak po korak) za multivarijatnog primijenjen je na čimbenike koji postignute značaj u Univarijatnom analize. Statistička analiza provedena je pomoću SPSS programa (verzija 13 za Windows, SPSS, Chicago, IL). Razlike u P < 0,05 smatrane su statistički značajnima. | Rezultati
kliničko karakteristike
je ukupno 181 pacijenata su bili upisani u ovoj studiji. Medijan dobi bio je 59 godina (raspon 23-83 godina). U kliničko karakteristike ispitivane populacije sažeti su u tablici 1. 129 pacijenata bili su muškarci, a 52 žene. 77. 181 tumora (42,5) od gornjeg želuca, 74 181 pacijenata (40,9%) bile su iz donjeg dijela trbuha, a preostali su tumori bili od srednje i cijelog tijela želuca. 118 od 181 (65,2%), veličine tumora pacijenata su > 4 cm, a 63 (34,8%) su bili ≤ 4 cm. U skladu sa Svjetske zdravstvene organizacije kriterijima, 4. 181 tumora (2,2%) bili su dobro diferencirani, 55 181 tumora (30,4%) su umjereno diferenciranih, 116 su bili slabo diferencirani i 6 su nediferencirane. Postoperativna kirurški faza je klasificirati prema 2002 UICC /AJCC klasifikacije [26] .table 1 kliničko korelacije izražavanja p-mTOR u rakom želuca pregled Čimbenici
Svi pacijenti
br bolesnika (%)
P
pregled N pregled = 181 (%)
mTOR negativna
mTOR pozitivno
pregled doba (y) pregled 0,256 izvoznici < 60 pregled, 95 (52,5)
50 (56,8)
45 (48,4) pregled ≥60 pregled 86 (47,5)
38 (43,2)
48 (51,6)
Sex pregled .926 pregled Muški pregled 129 (71,3)
63 (71,6)
66 (71,0) pregled Ženski pregled 52 (28,7)
25 (28.4) pregled, 27 (29,0) pregled stranice
0,053 pregled Gornja pregled 77 (42,5)
33 (37,5)
44 (47,3)
Srednji
28 ( 15.5)
10 (11,4)
18 (19,4)
niže pregled 74 (40,9)
43 (48,9)
31 (33,3) pregled difuznu
2 ( 1.1)
2 (2.3)
0 (0.0) pregled, veličina tumora pregled .172
≤ 4 cm
63 (34,8)
35 (40,0)
28 (30.1) izvoznici > 4 cm pregled 118 (65,2)
53 (60,0)
65 (69,9)
tip Borrmann pregled 0,398 pregled ranoj fazi pregled, 7 (3,9)
6 ( 6.8)
1 (1.1) pregled, ja
4 (2.2)
2 (2.3) pregled 2 (2.1) pregled II
65 (35,9)
31 ( 35,2)
34 (36,6), pregled III
101 (55,8)
47 (53,4)
54 (58,1) pregled, IV
4 (2.2)
2 ( 2.3) pregled 2 (2.1) pregled, ocjenjivanje pregled 0,999
1 pregled 4 (2.2) pregled 2 (2.3) pregled 2 (2.1) pregled 2 pregled 55 (30.4)
27 (30.7)
28 (30,1) pregled 3 pregled, 116 (64,1)
56 (63,6)
60 (64,5)
4
6 (3.3) pregled, 3 (3.4)
3 (3.3) pregled patoloških T klasifikaciju pregled 0,168 pregled T1 pregled 17 (9.4)
12 (13,6) pregled 5 (5.4) pregled T2 pregled 35 (19,3)
18 (20,5)
17 (18,3)
T3 pregled 119 (65,7)
55 (62,5) pregled 64 (68,8) pregled, T4 pregled 10 (5.5) pregled, 3 (3.4), pregled, 7 (7,5) pregled Patološka N status pregled 0,008
N negativna pregled 44 ( 24,3)
29 (33,0)
15 (16,1) pregled, N pozitivno pregled 137 (75,7)
59 (67,0)
78 (83,9) pregled Patološka faza (pTNM) pregled 0,026 pregled sam
26 (14,4)
17 (19,3)
9 (9,7) pregled II
47 (26,0)
28 (31,8)
19 (20,4) pregled III pregled, 100 (55,2)
41 (46,5)
59 (63,4) pregled, IV
8 (4.4)
2 (2.3)
6 (6,5)
129 od 181 bolesnika (71,2%) imalo napredniji T stadija bolesti (PT3 + PT4) i 137 bolesnika (75,7%) imalo je limfnog čvora metastaza. Totalno pacijenti fazi I-IV su 26, 47, 100 i 8 slučajeva, respektivno. Pregled, p-mTOR izraz u rak želuca pregled Imunobojanje p-mTOR je citoplazmatske i dijelom membranski. Slika 1 prikazuje reprezentativne primjere p-mTOR imunološkim. Normalna želučane sluznice negativna za p-mTOR. Od 181 pacijenata, 93 (51.4%) bilo je p-mTOR-pozitivnih tumora. Na slici 1 Primjeri p-mTOR imunobojenja. (A) Normalna želučane sluznice negativna za p-mTOR (izvornim povećanjem × 200). (B) Normalna želučane sluznice negativna za p-mTOR (izvornim povećanjem × 400) (c) pozitivna izrazu p-mTOR kod raka želuca (izvorni uvećanja × 200). (D) negativan ekspresiju p-mTOR kod raka želuca (izvorno povećanje × 200).
Preživljavanje analiza
bolesnika s p-mTOR pozitivni rak želuca pokazali značajno kraće simptoma bolesti te sveopću stopu preživljavanja od onih s p- mTOR negativan karcinom želuca (DFS, 48,9% u odnosu na 30,1%, p = 0,006, OS, 51,1% u odnosu na 34,4%; p = 0,011 Tablica 2; Slika 2A, B). Univarijatnom analiza pokazala je da je vrijeme preživljavanja također smanjio s višim PT klasifikacije (DFS, p = 0,001; OS, P = 0,005), limfnih čvorova metastaze (DFS, p < 0,0001; OS, P = 0,001) i napredne pTNM faza (DFS p < 0,001; OS, p = 0,001). Nije utvrđena povezanost između DFS ili OS i dob, spol ili tumora size.Table 2 Univarijatnom analiza bez bolesti i ukupno preživljavanje kod raka želuca pregled pregled pregled bolesti bez suivival
svemu survival

Characteristic

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

Age(y)
0,343 pregled 0,583 izvoznici < 60 pregled, 95
1,00 pregled 1.00 pregled ≥60 pregled 86 pregled 0,834 pregled 0,573-1,214 pregled 0,898 pregled 0.611-1.320
Sex Netlogu. 662 pregled .950 pregled muški pregled 129 pregled 1.00
1,00 pregled Ženski pregled 52 pregled 0,909 pregled 0,591-1,396 pregled 0,986 pregled 0,639-1,521 pregled veličina tumora pregled 0,151 pregled 0,232 pregled ≤4 cm pregled 63
1,00 pregled 1.00 izvoznici > 4 cm
118 pregled 1.345
0,897-2,016 pregled 1,287 pregled 0,851-1,945
PT fazi pregled 0,001 pregled 0,005 pregled pT1
17
1,00 pregled 1,00 pregled pT2
35
1.549
0.558-4.301
.401
1.535
0.553-4.264
.411
pT3
119
3.546
1.437-8.750
.006
3.237
1.310-8.001
.011
pT4
10
4.738
1.547-14.506
.006
4.068
1.289-12.836
.017
pN faza izvoznici < .0001 Pregled 0,001 pregled Negativna pregled 44
1,00 pregled 1.00 pregled Pozitivan pregled 137 pregled 2,617 pregled 1,538-4,451 pregled 2,389 pregled 1.401- 4,075 pregled pTNM faza izvoznici < .0001 Pregled 0,001 pregled sam
26 pregled 1,00 pregled 1,00
II
47
2.920
1.197-7.121
.018
2.860
1.173-6.973
.021
III
100
4.955
2.152-11.409
< .0001 Pregled 4,455 pregled 1,930 do 10,281 izvoznici < .0001 Pregled IV pregled 8. pregled 7,369 pregled 2,470 do 21,981 Netlogu < .0001 Pregled 6,103 pregled 1,965 do 18,957 pregled 0,002 pregled P-mTOR pregled 0,008 pregled 0,013 pregled Negativna pregled 88
1,00
1,00
Pozitivni pregled 93 pregled 1,667 pregled 1,146-2,454
1,644 pregled 1,112-2,430
slici 2 Kaplan-Meier procjene vjerojatnosti preživljavanja. Bolesnici s p-mTOR pozitivnim pokazao znatno kraće ukupno preživljavanje (A) i bez znakova bolesti opstanak stope (B) od onih s p-mTOR negativnog izražavanja. (P = 0,011 ip = 0,006, respektivno)
U multivarijatnog, limfni čvor metastaze (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,038). I PT faza (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,046) bili su značajno neovisni prognostički faktor za vrijeme preživljavanja. Osim toga, višestruko zavisni analiza (Tablica 3) također ukazuje na trend korelacije između p-mTOR izražavanja i smanjen opstanak, ali trend nije dosegla statističku značajnost (DFS, p = .059, OS, p = .070) .table 3 multivarijabilno Cox regresijska analiza slobodnim od bolesti i ukupnih preživjelima pregled pregled
bolesti bez suivival
svemu survival

Factors

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

p-mTOR
0,059 pregled 0.070
Negativan pregled 88
1,00 pregled 1.00 pregled Positive pregled 93 pregled 1,452 pregled 0,986-2,138 pregled 1,443 pregled 0,970-2,147
infiltracije dubina pregled 0,018 pregled 0,046 pregled pT1
17 pregled 1,00 pregled 1.00
pT2
35
1.050
0.366-3.016
0.928
1.078
0.375-3.101
0.889
pT3
119
2.251
0.867-5.845
0.096
2.146
0.823-5.595
0.118
pT4
10
2.926
0.920-9.305
0.069
2.616
2.616-8.580
0.113
Lymph Status čvor pregled 0,018 pregled 0.038
Negativan pregled 44
1,00 pregled 1.00 pregled Positive pregled 137 pregled 1,981 pregled 1,981-3,488 pregled 1,828
1,034-3,233 pregled RAD001 inhibira proliferaciju i sprečava p70S6K fosforilacije
istražiti učinke RAD001 na proliferaciju ljudskih staničnih linija raka želučani BGC823 i AGS, proveli smo proliferacije sa 48-satnom izlaganja RAD001. Kao rezultat toga, RAD001 stvara značajna inhibicija na obje stanične linije na način ovisan o dozi. (Slika 3A). Slika 3 (A) RAD001 inhibira proliferaciju stanica želuca raka. Želučani stanice raka su tretirane s naznačenim koncentracijama RAD001 u prisutnosti 10% FBS tijekom 48 sati. Stanična vijabilnost je procijenjena pomoću MTT testa. (B) Fosforilaciju p70S6K je značajno smanjena na način ovisan o dozi, u oba AGS i BGC823 stanica obradom sa RAD001. Obje stanične linije su inkubirane s povećanjem doze RAD001 48 sati, stanični lizati su podvrgnuti Western blot analizom s fosforiliranih p-S6K i S6K antitijela.
Western blot 'eksperimenti su provedeni s RAD001 na 0, 5, 10, 20 uM tijekom 48 h. P70s6 kinaza je važan nizvodni cilj mTOR i njegove mTOR ovisne fosforilacije dopušta translaciju ribosomskih proteina. ispitan fosforilacijskog statusa nizvodno ciljne p70S6K pomoću imunoblotinga. Kao što je prikazano na slici 3B, otkrili smo da tretiranje obje stanične linije BGC823 i AGS s RAD001 značajno spriječiti fosforilaciju p70S6K na način ovisan o dozi. Pregled RAD001 inducira G0 /G1 staničnog ciklusa i apoptozu u stanicama raka želuca
da se utvrdilo je li potiskivanje u proliferaciju stanica su zbog G0 /G1-faze uhićenja ili apoptoze, distribucija staničnog ciklusa analizirana je FCM. Slika 4 pokazali su da liječenje BGC823 stanica s RAD001 za 48 sati rezultirao je robustan G1 uhićenja i promiču apoptozu. S povećanjem doze RAD001, sve više i više stanica ostao u G1-fazu, a progresiju staničnog ciklusa u S fazi smanjuje (slika 4a). RT-PCR analiza je pokazala RAD001 ovisno o dozi smanjio razine mRNA ciklina D1 i c-myc (slika 4b). Slika 4 RAD001 inducira staničnog ciklusa i apoptozu u BGC823 stanicama. (A) BGC823 Stanice su izložene različitim koncentracijama RAD001 48 h. (B) RNA je ekstrahirana iz stanica. Ciklina D1 i C-myc razina ekspresije su detektirani pomoću RT-PCR, aktina kao kontrolom punjenja. (C) stanice su inkubirane 48 sati s naznačenim dozama RAD001 prije bojanja s Annexin V-FITC. Prikazani su postoci apoptoze stanica. (D) Stanice su inkubirane 48 sati s naznačenim dozama RAD001. Stanice su sakupljene, lizirane i podvrgnut Western blot analizom uz bcl-2 i p53 protutijela. GAPDH je korišten kao kontrola za punjenje.
Annexin V-testovi su pokazali da značajno RAD001 inducirana apoptoza u BGC823 stanicama. Povećanje brzine apoptoze je analizirana FCM s povećanjem doze (Slika 4C). Western blot analiza je pokazala RAD001 ovisno o dozi smanjuje razinu proteina Bcl-2 i povećanje razine proteina p53 (slika 4D). Slični rezultati su opaženi u AGS stanicama (podaci nisu prikazani). Pregled Rasprava pregled kod sisavaca cilj rapamicina (mTOR) otkrivena je u ranim 1990-ih u proučavanju mehanizma djelovanja rapamicina, koji je izvorno naći kao sredstvo protiv gljivica, a kasnije je prepoznat kao antikancerogena svojstva [27]. Kao protein kinaze Ser /Thr, mTOR igra ključnu ulogu u stanični rast i homeostazu [28]. MTOR protein tvori kompleks s adapter proteina, mTORC1 (sisavaca cilj rapamicina kompleksa 1) i mTORC2. Aktivacija mTORC1 regulira rast stanica modulacijom sintezu proteina, ribosom Biogeneze i autophagy [29]. MTORC2 put igra ključnu ulogu aktiviranja Akt, kao PDK1 (3-fosfoinozitid ovisne protein kinaze 1) i PI3K, potencijalni cilj lijeka za rak u kojem se nalazi Akt deregulacija [26].
U trenutnoj studiji, primijetili smo da su 93 (51,4%) bolesnika imalo pozitivan izraz p-mTOR u 181 bolesnika s rakom želuca. U skladu s našim rezultat toga, u drugoj studiji, uključujući 1072 pacijenata, izraz p-mTOR je 46,5% [30].
Prethodne studije su izvijestili prognostičku značajnost p-mTOR izražavanja. Herberger et al [18]. identificirati p-mTOR biti neovisni prognostički čimbenik smrti u bolesnika s adenokarcinom bilijarnog trakta. U svom istraživanju, ukupno preživljenje bio je znatno kraće u bolesnika s p-mTOR-pozitivnih tumora u usporedbi s bolesnicima s p-mTOR-negativnih tumora (P = 0,004). U karcinomu želuca, Yu i sur. ocjenjuje izraz p-mTOR u 1.072 bolesnika s rakom želuca pomoću mikročipa tkiva, pokazujući pojačanom ekspresijom p-mTOR bila samostalna prognostički čimbenik [30]. Međutim, u studiji uključeno 109 bolesnika s želučanog adenokarcinoma koji su bili podvrgnuti radikalnu gastrektomije [31], Murayama et al. pronađen niti citoplazmatski p-mTOR, niti nuklearni p-mTOR je neovisan prognostički čimbenik, iako su identificirani citoplazmatski p-mTOR ekspresija je povezana s lošijom opstanak i korelaciji s dubinom tumorske invazije, limfnih čvorova i tumora fazi. U ovom istraživanju utvrdili smo da PT klasifikacija i statusa limfnih čvorova su neovisni prognostički pokazatelj kliničkog ishoda u bolesnika s rakom želuca by multivarijabilnih analizama. Međutim, budući da većina bolesnika dolazi s lokalno uznapredovale bolesti, drugih sekundarnih prognostičkim biljezima, posebice p-mTOR, može biti od koristi [13]. Naši rezultati jasno pokazuju da je p-mTOR izraz je povezana jako sa slabom ukupne i bez bolesti opstanak u Univarijatnom analiza s trendom prema korelacije u multivarijabilnih analizama. Pregled skladu s našim trenutnoj studiji, nekoliko studija također su prepoznali antiproliferativni efekti inhibitora mTOR u želučanih stanica raka. Na primjer, Lang et al [21]. identificiran rapamicina može inhibirati rast stanica raka želuca i u supkutani modelu tumora i u eksperimentalnom modelu. Njihovi rezultati ukazuju na prikladnost inhibitora mTOR koji će se koristiti u antioangiogenog kontekstu za liječenje karcinoma želuca.
Međutim, RAD001 je novi mTOR inhibitor kao sredstvo protiv raka. Mehanizam o RAD001 kod raka želuca nije jasno. Cejka et al. pokazuje da je antiangiogeno djelovanje RAD001 kombinaciji s visokom dozom ciklofosfamid pokazala sinergističku antitumorsko djelovanje protiv raka želuca [32]. Oni su također otkrili da RAD001 smanjene proliferacije i atenuirani proizvodnju HIF-1 a, kao i VEGF u želučanim stanice raka in vitro [33]. U trenutnoj studiji, naši podaci su pokazali da RAD001-terapija oslabljena fosforilaciju p70S6K i značajno inhibiraju proliferaciju stanica želuca raka putem staničnog ciklusa i apoptozu in vitro. Pronašli smo RAD001 navelo G0 /G1 fazi zastoja, koji je bio povezan sa smanjenom ciklin D1 i c-myc. Osim toga, pokazali smo po prvi put da je RAD001 kao novi inhibitor mTOR ovisno o dozi apoptozu kod želučanih stanica raka uz Aneksin V testovima. Ovaj učinak može biti diktirana od strane kontekstu stanice i nizvodno ciljeve, uključujući P53 i Bcl-2. Ovi rezultati mogli dodatno objasniti učinkovitost RAD001. Pregled Zaključak
Ukratko, proveli smo sustavno istraživanje kako bi mTOR kod raka želuca, što ukazuje na odnose izraz s prognozu vrijednosti aktiviranog mTOR (p-mTOR) in vivo, učinak RAD001 i dio mehanizama u želučanih stanica raka in vitro. Naši rezultati pokazuju da će p-mTOR poslužiti kao potencijalni biološki marker identificiranja podskupinu pacijenata slabe prognoze želučanog karcinoma. Također se je pokazalo da je RAD001 bio obećavajući sredstvo za liječenje karcinoma želuca s izazivanje staničnog ciklusa i apoptozu podreguliranjem ekspresije c-myc, CyclinD1 i Bcl-2, povećati ekspresiju p53. Daljnja istraživanja su potrebna kako bi se razjasnila uloga aktivacije mTOR i na kraju predložiti mTOR kao konkretan cilj za želučane terapiju raka pregled Napomena pregled Grant podrška:. Podržan od strane National High Technology istraživanje i razvoj (863) Program Kina pregled Bilješke
da-zhi Xu Qi-rong Geng doprinijeli jednako na taj posao. pregled deklaracija
Zahvale pregled ovaj rad je podržan od strane National High Technology istraživanje i razvoj (863) i program Kina. Autori cijeniti odličnu tehničku pomoć Li-Hui Wang, Fei-Meng Zheng, Zheng-zhi Zou, Yan Zhang i Zi-jie Long. Pregled autora na originalni poslanih datoteka za slike
Ispod su linkovi na autora izvornika poslanih datoteka za slike. 12885_2009_2335_MOESM1_ESM.pdf autora izvorna datoteka za Slika 1 12885_2009_2335_MOESM2_ESM.pdf autorskim izvorne datoteke za sliku 2 12885_2009_2335_MOESM3_ESM.pdf autorskim izvorne datoteke za sliku 3 12885_2009_2335_MOESM4_ESM.pdf autorovih izvorne datoteke za slike 4 suprotstavljenih interesa
Autori izjavljuju da su nema suprotstavljenih interesa. pregled

• Prognostička učinak nacionalnosti, za želučane i raka jednjaka: iskustvo stanovništvo bazi u British Columbia, Kanada
• Identifikacija prognostičkih čimbenika i kirurške indikacija za metastatski rak želuca