Ekspression af p53, inducerbar nitrogenoxidsyntase og vaskulær endotel vækstfaktor i gastriske præcancerøse og cancerøse læsioner: korrelation med kliniske symptomer

Angivelse af p53, inducerbar nitrogenoxid syntase og vaskulær endotel vækstfaktor i gastrisk forstadier og kræft: korrelation med kliniske funktioner
Abstract
Baggrund
vækst og metastase af tumorer afhænger af udviklingen af ​​en tilstrækkelig blodforsyning via angiogenese. Nylige undersøgelser viser, at den inducerbare nitrogenoxidsyntase (iNOS), vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF), og tumoren suppressor p53 er grundlæggende play-markører for den angiogene proces. Overekspression af iNOS og VEGF er blevet vist at inducere angiogenese i tumorer. P53 undertrykker angiogenese ved nedregulere VEGF og iNOS. Korrelationen af ​​udtryk for p53, VEGF og iNOS og kliniske funktioner i gastrisk carcinogenese har dog ikke været godt karakteriseret.
Metoder
udtryk for p53, iNOS og VEGF i gastrisk forstadier og kræft og dens forbindelse med de kliniske træk blev bestemt med immunhistokemi (avidin-biotin-peroxidase-kompleks metode) på 55 tilfældigt udvalgte GC patienter og 60 symptomfrie fag fra massen undersøgelse i high-forekomst område for GC i Henan, det nordlige Kina.
Resultater
den positive immunostainig satser for p53, iNOS og VEGF i gastriske karcinomer var 51%, 44% og 51%, henholdsvis og korreleret godt med TNM etaper, men viste ikke signifikant forskel mellem grupperne med forskellige grader af gastrisk væg invasion dybde ved GC. En positiv immunfarvning reaktion for iNOS protein blev signifikant korreleret med lymfeknudemetastaser (p = 0,019; Spearman korrelationskoefficient). P53 protein akkumulation var højere i dårligt differentieret gastrisk karcinom end i godt differentieret én. I gastriske biopsier, blev ingen positiv immunosatining observeret for p53, iNOS og VEGF i histologisk normale væv og kronisk overfladisk gastritis (CSG). Imidlertid p53, blev observeret i væv med forskellige sværhedsgrader af læsioner af kronisk atrofisk gastritis (CAG), intestinal metaplasi (IM) og dysplasi (DYS), og de positive satser, iNOS og VEGF positiv immunfarvning steg med læsionen progression fra CAG til IM til dys. En høj tilfældig positiv og negativ immunfarvning sats for p53, iNOS og VEGF blev observeret både i biopsiprøver med KAG, IM og DYS fra symptomfrie fag og i gastrisk kræft væv fra GC patienterne.
Konklusioner
foreliggende resultater indikerede, at p53-protein akkumulering og forøget ekspression af iNOS og VEGF kan være ansvarlig for gastrisk carcinogenese og tumor aggressivitet af gastrisk cancer.
gastrisk adenocarcinom (GC) er en af ​​de mest almindelige ondartede sygdomme i Kina. Selv GC er blevet afvist i sin dødelighed, er det stadig den hyppigste årsag til kræft dødsfald i dette land (Parkin et al, 1992;. World Health Organization, 1994; Nomura A, 1996). Gastrisk carcinogenese betragtes som en flertrins fremadskridende proces. Den tidlig indikator for emnet prædisponeret for GC er unormal hyperproliferation af gastriske epitelceller, såsom kronisk atrofisk gastritis (CAG), DYS og intestinal metaplasi (IM), som er blevet anset som præcancerøse læsioner i GC (Du et al., 1993; Correa P, 1992). Men oplysningerne om den mekanisme af gastrisk carcinogenese er meget begrænset.
Vækst og metastase af tumorer afhænger af udviklingen af ​​en tilstrækkelig blodforsyning via angiogenese. Nylige undersøgelser viser, at den inducerbare nitrogenoxidsyntase (iNOS), vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF) og tumor suppressor p53 er grundlæggende play-skaberne af den angiogene proces (Ambs et al, 1994;.. Jekins et al, 1995; Forrester et al, 1996;.. Chiarugi et al, 1998). iNOS er en af ​​isoformerne af nitrogenoxidsynthase, der katalyserer dannelsen af ​​nitrogenoxid, en regulator af vaskulær permeabilitet. VEGF er et dimert glycoprotein og har specifik mitogen aktivitet for endotelceller. Over-ekspressionen af ​​iNOS og VEGF kunne fremkalde angiogenese i tumorer. P53 undertrykker angiogenese ved nedregulere VEGF og iNOS. Mutant p53 potenserer proteinkinase C induktion af VEGF-ekspression (Zhang et al., 2000). I en tumorgenicitet model ved hjælp af humane fibroblastceller, tab af vildtype p53 og transfektion af aktiverede ras ført til øget VEGF-ekspression (Devavrata et al., 1995). Transient transfektion af vildtype p53 og af v-src har vist sig at udøve modsatrettede effekter på human VEGF genpromotor i humane glioblastom og transformerede humane føtale nyreceller (Devavrata et al., 1995). Men fordi vildtype p53 ikke undertrykke hypoxi-induceret transkription af VEGF-genet i stabilt transficerede humane kolorektal carcinom og humane hepatoblastoma celler med en inducerbar p53-estrogen-receptor-fusionsprotein ekspressionssystem (Ambs et al., 1998), det er blevet foreslået, at der er behov for forsigtighed ved fortolkningen p53-funktion på grundlag af celler transient overudtrykker dette protein. Ikke desto mindre har mutant p53 blevet korreleret med forøget VEGF-ekspression i human lungecancer (Ambs et al., 1994), og kolorektal cancer (Ambs et al., 1999) ved immunhistokemisk farvning af kirurgiske prøver. Det er blevet rapporteret, at dysfunktion af p53 /MDM-2 pathway kan findes i mere end to tredjedele af angiosarcomer; således, mutant p53 påvirker udviklingen af ​​angiosarcoma ikke kun ved at påvirke vækst og apoptose kontrol, men også ved opregulering VEGF (Chinrugi et al., 1998). Vi antager, at ændringer af p53, kan iNOS og VEGF-ekspression bidrager til gastrisk carcinogenese og påvirke den kliniske adfærd GC via angiogenese. Korrelationen af ​​udtryk for p53, VEGF og iNOS og kliniske funktioner i gastrisk carcinogenese har dog ikke været godt karakteriseret.
At karakterisere ændringer i p53, iNOS og VEGF-ekspression i human gastrisk carcinogenese blev nærværende undersøgelse forpligtet sig til bestemme protein niveau af p53, iNOS og VEGF i normale væv og væv med forskellige sværhedsgrader af læsioner af CSG, KAG, DYS, IM og GC med og uden lymfeknude metastaser fra kirurgisk resektion menneskelige GC og gastriske biopsier fra symptomfrie emner . Emnerne var fra Linzhou og nærliggende amt Huixian i Henan-provinsen, den høje forekomst område for GC i det nordlige Kina.
Materialer og metoder
Patienter
Nærværende undersøgelse omfattede 55 tilfældigt udvalgte GC patienter og 60 symptom- gratis emner fra massen undersøgelse i high-forekomst område for GC. Fifty-fem GC patienter blev udført mavekræft kirurgi på Linzhou Folkets Hospital (n = 26) og den anden Affiliated Hospital i Henan Medical University (n = 29) fra 1996 til 1998. Før kirurgi, ingen af ​​patienterne fik nogen former for kemiske eller strålebehandling. Gennemsnitsalderen for patienterne var 61 år (30 ~ 77 år). Kræft prøver blev klassificeret baseret på TNM som scenen T1 (19 patienter, 35%), T2 (14 patienter, 25%), T3 (12 patienter, 22%) og T4 (10 patienter, 18%). De tumorer blev histologisk klassificeret som veldifferentieret (15 patienter, 27%), moderat-opdelte (14 patienter, 25%) og dårligt differentierede (26 patienter, 47%). Af de 55 patienter, 35 forekom lokale lymfeknudemetastaser (64%). Gastriske biopsier blev udtaget fra 60 symptomfrie individer, der frivilligt til at deltage i en rutinemæssig endoskopisk screening for esophageal og gastrisk cancer hos Huixian, Kina. Ingen udvælgelsesprocessen var involveret. Af de 60 forsøgspersoner undersøgte, var der 35 hanner og 25 hunner. Den mediane alder af emnerne var 59 år (28 ~ 70 år). De biopsier blev taget hver fra pylorus i maven fra hvert emne.
Tissue behandling
Alle kirurgisk resektion prøver og biopsi prøver blev fikseret med 10% neutral formalin, indlejret med paraffin, og serielt sektioneret ved 5 pm. Snittene blev monteret på de histostick-coatede objektglas. Fire eller fem tilstødende bånd blev indsamlet til histopatologisk analyse (hæmatoxylin og eosin pletten) og for immunhistokemisk farvning.
Histopatologisk analyse
Histopatologisk diagnose for gastrisk epitel blev foretaget i overensstemmelse med cellulære morfologiske ændringer og væv arkitektur ved hjælp af tidligere fastsatte kriterier (Wang et al, 1994;.. Du, et al, 1993). Kort fortalt CSG: en betændelse manifesteret ved mild lymfocyt og plasma-celle infiltration; CAG: glandulær morfologi forsvandt delvist eller helt fraværende i slimhinden og erstattes af bindevæv, inter-glandulær rum blev infiltreret hovedsageligt af plasmaceller og lymfocytter; DYS: kendetegnet ved nuklear atypi med eller uden arkitektoniske abnormiteter i det gastriske epitel, men uden invasion; IM: bekræftet ved tilstedeværelsen af ​​slimceller i gastrisk mucosa; adenocarcinom (AC):. invasion af neoplastiske gastriske celler gennem basalmembranen
Immunohistokemisk farvning
Anti-p53-antistof er et monoklonalt muse-anti-serum mod p53 af human oprindelse, og genkender både vildtype og mutant p53 ( Ab-6, Oncogene Science, Manhasset, NY). Anti-iNOS antistof er et monoklonalt muse-anti-serum mod det C-terminale domæne af iNOS af human oprindelse (sc-7271, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Anti-VEGF-antistoffet er et polyklonalt kanin-anti-serum mod VEGF af human oprindelse og genkender en aminoterminal epitop fundet i VEGF 121, 165, 189 og 206 (Ab-2, Oncogene Science, Manhasset, NY). Avidin-biotin-peroxidase-kompleks metode blev anvendt til immunfarvning af p53, iNOS og VEGF. Kort fortalt, efter afvoksning, inaktivere endogen peroxidaseaktivitet og blokering krydsreaktivitet med normalt serum (Vectastain Elite Kit, Vector, Burlingame, CA), blev sektionerne inkuberet natten over ved 4 □ med en fortyndet opløsning af de primære antistoffer (1: 1000 for p53, 1: 200 for iNOS og 1: 100 for VEGF). Placering af de primære antistoffer blev opnået ved efterfølgende påføring af et biotinyleret anti-primært antistof, et avidin-biotin kompleks konjugeret til peberrodsperoxidase, og diaminobenzidin (Vectastain Elite Kit, Vector, Burlingame, CA). Glassene blev counter-plettet af hæmatoxylin. Negative kontroller blev fastsat ved at erstatte det primære antistof med PBS og normal mus eller kanin-serum. Kendte Immunofarvning-positive objektglas blev anvendt som positive kontroller.
Specifik farvning for hvert protein blev kategoriseret som enten positive eller negative baseret på tilstedeværelsen af ​​brune-farvning. Mere end 10% celler positivt farvede blev gradueret som positive. Klar farvning for kerner (p53), cytoplasma og cellemembran (VEGF og iNOS) var kriteriet for en positiv reaktion (Wang et al., 1994). Alle immunfarvning slides blev observeret af to patologer (L D Wang og L H Jiao). De slides med forskellige diagnose ved to patologer blev læst igen (mindre end 5%), indtil den aftalte diagnosen blev stillet.
Statistisk analyse
X 2 test blev anvendt til procentdelen af ​​prøver med positive plet . Spearman korrelation test og lineær tendens test blev anvendt til korrelation mellem positive satser og forskellige sværhedsgrader af læsioner (p < 0,05 blev betragtet som signifikant)
Resultater
Histopatologisk, alle de 55 kirurgisk resektion gastriske prøver blev bekræftet som. adenocarcinom. Af de 55 GC patienter, 11 tilfælde forekom invasionen i sub-slimhinde, 44 med hel-muskel lag. Af de 60 undersøgte biopsi-prøver blev 10 diagnosticeret som normal, 15 som CSG, 9 som CAG, 16 som IM med CAG, og 10 som DYS (tabel 1) .table 1 Immunoreaktivitet af p53, iNOS og VEGF i gastrisk normal epitel og epitel med forskellige sværhedsgrader af læsioner


P53
iNOS

VEGF

No. af prøver undersøgt
No. af positiv plet n (%)
No. af positiv plet n (%)
No. af positiv plet n (%)
normala
10
0 (0)
0 (0)
0 (0)
CSGB
15
0 (0)
0 (0)
0 (0)
CAGc
9
en (11)
0 (0)
2 (22)
IMD
16
3 (19)
2 (13)
5 (31)
dyse
10
3 (30)
4 (40)
5 (50)
GCF
55
28 (51)
24 (44)
28 (50)
P53: c: fp = 0,02 d :: fp = 0,013; iNOS: c: f p = 0,03 d: f p = 0,015; VEGF: c: f p = 0,014 d: f p = 0,015
positive immunfarvning for p53, blev iNOS og VEGF observeret i den gastriske epitelceller og cancerceller med forskellige satser i læsioner af KAG, DYS, IM og GC. Men den positive immunfarvning for p53, iNOS og VEGF blev ikke observeret i normal gastrisk epitelvæv og CSG. Figur 1, 2 og 3 viser repræsentant p53, iNOS og VEGF immunfarvning i GC. p53 immunreaktivitet blev placeret i kerner, VEGF og iNOS immunreaktivitet var placeret hovedsagelig i cytoplasmaet og cellemembranen. iNOS immunfarvning blev bekræftet ved Western blot på en del af iNOS positive og negative objektglas (tre dias for hver), og konsistente resultater blev opnået for iNOS immunhistokemi og Western Blot (data ikke vist). Den positive immunfarvning sats for p53 var meget lav i KAG, og steg svagt i IM og DYS og øget betydeligt i GC (Tabel 1). Lignende resultater blev observeret i iNOS og VEGF (tabel 1). P53 positive immunosatining sats i veldifferentieret GC var lavere end i dårligt differentieret GC (p = 0,012, tabel 2). iNOS positiv farvning var ens blandt GC med forskellig grad af differentiering. Selvom VEGF immunfarvning sats i dårligt differentieret GC var højere end i veldifferentieret GC, forskellen var ikke signifikant (Tabel 2). Figur 1 immunfarvning af p53 i gastrisk karcinom. Immunoreaktivitet ligger i cellekerner (pile). 20X
Figur 2 immunfarvning af iNOS i gastrisk karcinom. Immunoreaktivitet ligger hovedsageligt i cytoplasmaet og cellekerner membran. 10X
Figur 3 immunfarvning af VEGF i gastrisk karcinom. Immunoreaktivitet ligger i cytoplasmaet og cellemembranen. 10X
Tabel 2 Immunoreaktivitet af iNOS, p53 og VEGF i GC og dets overensstemmelse med forskellige grader af differentiering


P53 *
iNOS
VEGF
Differentiering grad af GC
No. af prøver undersøgt
No. af positiv plet n (%)
No. af positiv plet n (%)
No. af positiv plet n (%)
godt differentiateda
15
5 (33)
7 (47)
6 (40)
Moderat-differentiatedb
14
6 (43)
5 (36)
6 (43)
Dårligt-differentiatedc
26
17 (66)
12 (46)
16 (61)
* a: cp = 0,012
iNOS positiv immunfarvning sats i de tilfælde med dyb invasion af GC (gennem muskel lag) var højere end hos dem med overfladisk invasion (indenfor submucosa), men forskellen var ikke signifikant (tabel 3). P53 og VEGF immunfarvning var ens i GC patienter med overfladisk og dyb invasion.Table 3 Immunoreaktivitet af p53, iNOS og VEGF og dets overensstemmelse med invasion dybde gastrisk karcinom


P53
iNOS
VEGF
invasion dybde af GC
No. af undersøgte prøver
No. af positiv plet n (%)
No. af positiv plet n (%)
No. af positiv plet n (%)
Inden slimhinde
11
5 (46)
3 (27)
6 (55)
Muskel lag
44
23 (52)
21 (48)
22 (50)
iNOS immunosatining sats i de tilfælde med lymfeknude metastaser var højere end i dem uden lymfeknude metastaser (p = 0,014, tabel 4 ). Men der var ingen observeret for p53 og VEGF mellem tilfælde med og uden lymfeknude metastasis.Table 4 Immunoreaktivitet af p53, iNOS og VEGF og dens korrelation med lymfeknude-metastase af gastrisk karcinom


P53
iNOS *
VEGF
lymfeknudemetastase

Ingen. af undersøgte prøver
No. af positiv plet n (%)
No. af positiv plet n (%)
No. af positiv plet n (%)
Ja
35
18 (51)
19 (55)
21 (60)
Ingen
20
10 (50)
5 (25)
7 (35)
* p = 0,014
P53 immunfarvning sats i de tilfælde med TNM klasse T1 var lavere end i dem med TNM klasse T2, T3 og T4 (T1: T3, p = 0,023; T1: T4, p = 0,012). Lignende resultater blev observeret i VEGF (T1: T2 og T2: T3, p = 0,015; T1: T4, p = 0,014; T2: T4, p = 0,01, Tabel 5). Der var dog ingen forskel for iNOS immunfarvning mellem sager med forskellige TNM stages.Table 5 Immunoreaktivitet af p53, iNOS og VEGF og dets overensstemmelse med klinisk TNM klassifikation


P53 *
iNOS
VEGF **
TNM iscenesætter
No. af prøver undersøgt
No. af positiv plet n (%)
No. af positiv plet n (%)
No. af positiv plet n (%)
T1
19
7 (37) en
7 (37)
8 (42) en
T2
14
6 (43) b
4 (29)
4 (29) b
T3
12
8 (67) c
7 (58)
8 ( 67) c
T4
10
7 (70) d
6 (60)
8 (80) d
* a: cp = 0,023, a: dp = 0,012; ** A: b og b: c p = 0,015, a: d p = 0,014, b: d p = 0,01
En højere tilfældig udtryk for p53, iNOS og VEGF i GC blev observeret. Af de 55 undersøgte tilfælde var der 20 tilfælde, der viser positiv farvning for både p53 og iNOS (36%), 23 sager viser negativ farvning for både p53 og iNOS (42%) (p = 0,005, tabel 6), 19 sager viser positiv farvning for både p53 og VEGF (35%) og 18 tilfælde viser negative for både p53 og VEGF (33%) (p = 0,01, tabel 7). De korrelationer var significant.Table 6 tilfældige udtryk for p53 og iNOS protein i gastrisk karcinom

p53 (+)
p53 (-)

n (%)
n (%)
iNOS (+)
20 (36)
4 (7)
iNOS (-)
8 (15)
23 (42)
X2 = 15,68, p = 0,005
tabel 7 tilfældige udtryk for p53 og VEGF protein i gastrisk karcinom

p53 (+)
p53 (-)

n (%)

n (%)
VEGF (+)
19 (35)
9 (16)
VEGF (-)
9 (16)
18 (33)
X2 = 6.56, p = 0,01
diskussion
En interessant observation i denne undersøgelse var, at immunoreaktiviteten af ​​p53, iNOS og VEGF fandt sted i den tidlige fase af gastrisk carcinogenese. De positive immunfarvning celler blev uvægerligt forbundet med celle formere aktivitet. Med læsioner skred fra normal til CSG til KAG at IM til DYS, og GC, de positive Immunofarvning satser for p53, iNOS og VEGF steget markant, den stigende tendens til, p53, iNOS og VEGF havde en god lineær korrelation med læsioner progression. De foreliggende resultater indikerer, at p53-protein akkumulering og forøget ekspression af iNOS og VEGF kan være vigtige molekylære begivenheder, der er involveret i den tidlige fase af gastrisk carcinogenese.
Anden interessant observation var, at en høj tilfældige positive Immunofarvning for p53 og iNOS (36 %) og p53 og VEGF (35%) blev observeret (tabel 6 og 7). Dette resultat var i overensstemmelse med resultaterne i menneskelige lunge- og coloncarcinomer (Ambs et al., 1999). Selvom p53 antistof, der anvendes i denne undersøgelse kunne ikke skelne vildtype p53 fra mutant p53 har tidligere undersøgelser indikerede, at p53-protein påvist ved immunhistokemi forekommer repræsentative mest mutant p53. Akkumulering af p53 er en indikator for et tab af p53 tumor suppressor funktion. Begge mutationer og protein-protein interaktioner kan forårsage en p53 akkumulering (Wang et al., 1994). Overvejer at p53 protein akkumulation var korreleret med dårligt differentiering og T2, T3 og T4 TNM stadie af GC, konkluderede vi, at p53-proteinet ophobning i denne undersøgelse kan føre til tab af celleproliferation kontrol og hæmning for iNOS og VEGF, muligvis på grund af p53-genmutation. Således kan høje tilfældig ekspression af iNOS og VEGF og p53-protein akkumulering være vigtige begivenheder, der kan forbedre gastrisk carcinogenese og dårligt kliniske træk og kan være nyttige biomarkører til vurdering risiko for udvikling af GC. Nylige undersøgelser af japanske GC patienter har vist, at forøget ekspression af VEGF og p53-protein akkumulering er forbundet med intra-tumoral angiogenese (Takeuchi et al, 2000;.. Saito, et al, 1999) og dårlig prognose (Skatani, et al. , 2000; Ikeguchi, et al, 2000;.. Maeda et al, 1998). Rajnkova rapporterede, at øget ekspression af iNOS kan fremme gastrisk kræft progression ved at give en selektiv vækst fordel for tumorceller med ikke-fungerende p53. (Rajnkova, et al., 2001)
tredje observation i denne undersøgelse var, at øget ekspression af iNOS og VEGF og p53-protein akkumulering forekom med en høj frekvens i gastriske biopsiprøver med IM. IM, der kan defineres som udskiftning af maveslimhinden ved kirtler, som har den histologiske, histokemiske og fysiologiske egenskaber tyndtarmen, er blevet stærkt forbundet med mavekræft. De foreliggende resultater viste, at IM var en ustabil fase med aktive molekylære ændringer, og yderligere analyse for at sammenligne disse ændringer med normal tyndtarm vil giver flere oplysninger om betydningen af ​​IM i gastrisk carcinogenese.
Endelig nærværende undersøgelse viste, at positive Immunofarvning satser iNOS var korreleret godt med GC lymfeknude metastaser, forøget ekspression af VEGF og p53-protein akkumulering var relateret med TNM stadier og GC differentiering. Disse fund indikerer, at p53, iNOS og VEGF kan være nyttige biomarkører for GC aggressivitet. Den molekylære basis for den observerede ekspression af iNOS og VEGF og p53-protein ophobning og deres roller i udviklingen af ​​gastrisk forstadier til kræft og angeogenesis kræver at blive omhyggeligt undersøgt i laboratoriet og opfølgende undersøgelser.
Forkortelser
De forkortelser, der bruges, er:
CSG, kronisk overfladisk gastritis
CAG:
kronisk atrofisk gastritis
DYS:
dysplasi
GC:
gastrisk adenocarcinom
iNOS:
inducerbare nitrogenoxidsyntase

IM:
tarm metaplasi
VEGF:.
vaskulær endotel vækstfaktor
erklæringer
Taksigelser
Dette arbejde blev støttet delvist af:. National Outstanding Young Scientist Award of China 30025016, stat Key Project for Basic Research G1998051206 (Kina) og Foundation of Henan uddannelsesudvalg
Forfattere 'oprindelige indsendt filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 12885_2001_28_MOESM1_ESM.doc Forfatternes oprindelige fil til figur 1 12885_2001_28_MOESM2_ESM.doc Forfatternes oprindelige fil til figur 2 12885_2001_28_MOESM3_ESM.doc Forfatternes oprindelige fil til figur 3

• Support vektor maskine model for diagnose af lymfeknude metastaser i mavekræft med multidetektor computertomografi: en foreløbig study
• Kombinerede funktioner baseret på MT1-MMP udtryk, CD11b + immunocytter tæthed og LNR forudsige kliniske resultater af mavekræft