Har transmission af Helicobacter pylori fra mennesker forårsager et sygdomsudbrud i en koloni af Stripe-faced Dunnarts (Sminthopsis macroura)?

Var transmission af Helicobacter pylori
fra mennesker forårsager et sygdomsudbrud i en koloni af Stripe-faced Dunnarts (Sminthopsis macroura
)?
Abstrakt
Siden opdagelsen af, at Helicobacter pylori
forårsager en række patologier i maverne af inficerede mennesker, er det blevet klart, at Helicobacters
findes i en bred vifte af dyreart, hvor de er ofte associeret med sygdom. I 2003 og 2004 var der to udbrud af øget mortalitet forbundet med gastrisk blødning og vægttab i et fangenskab koloni af den australske pungdyr, den Stripe-konfronteret Dunnart (Sminthopsis macroura
). Tilstedeværelsen af ​​gastrisk patologi førte til en undersøgelse af potentielle Helicobacter
patogenese i disse dyr. Histologisk undersøgelse afslørede tilstedeværelsen af ​​gastritis, og PCR-analyse bekræftede tilstedeværelsen af ​​Helicobacter
infektion i maver af disse marsupials. Overraskende sekventering af 16S rRNA fra disse bakterier identificeres arten som H. pylori
og PCR bekræftede stamme at være positiv for den vigtige patogenese faktor, CagA
. Vi beskriver derfor, for første gang, en tilsyneladende omvendt zoonotisk infektion af Stripe-faced Dunnarts med H. pylori
. Allerede tilbøjelige til patologiske virkninger af stress (som erfarne i yngleperioden), vises samtidig H. pylori
infektion at være en mulig afgørende, men ikke tilstrækkelig co-faktor i prototypisk gastrisk blødning og vægttab i disse marsupials. Den Stripe-faced Dunnart kunne repræsentere en ny model til undersøgelse Helicobacter
-driven gastrisk patologi. Infektioner fra deres menneskelige handlere, specielt af H. pylori
, kan være en potentiel risiko for fangenskab kolonier af pungdyr.
Introduktion
Opdagelsen af ​​Helicobacter pylori
sidste ende førte til en erkendelse af, at infektion i menneskelige mave med denne bakterie er en afgørende ætiologisk faktor i udviklingen af ​​mavesår sygdom og gastrisk adenocarcinom [1-3]. En anden vigtig konsekvens af denne opdagelse har været den efterfølgende identifikation af en stadigt voksende, tilsyneladende allestedsnærværende familie af Helicobacter
arter, der inficerer mavetarmkanalen hos næsten alle undersøgte dyr. Faktisk er mange Helicobacter
infektioner menes at være patogene og eventuelt ansvarlig for en lang række betingelser i en lang række dyrearter (gennemgået i [4, 5]). For eksempel har naturlige Helicobacter
infektioner været forbundet med gastritis i små og store katte, hunde, svin og fritter [6-10], abort hos får [11], colitis og hepatitis i rhesusaber [12], sår i delfiner og hvaler [13] og diarré hos katte og papegøjer [14, 15].
i denne rapport beskriver vi to udbrud af dødsfald i fangenskab koloni af en australsk pungdyr, den Stripe-konfronteret Dunnart (Sminthopsis macroura
), der var forbundet med blødning i maven muligvis på grund af infektion med det humane patogen, H. pylori
.
Materialer og metoder
Stripe-faced dunnarts Salg The Stripe-konfronteret dunnarts blev opstaldet på Department of Zoology, University of Melbourne. Kolonien blev holdt inden for bure opretholdt i et formål bygget temperatur reguleres bygning, i et fysisk miljø i forhold typiske for dem til boliger mus, bortset fra at naturlig belysning blev opretholdt. Animal boliger i specialdesignede bure, kosten formuleret til kødædende insektædende pungdyr og reproduktiv overvågning fulgte omridset tidligere [16] givet. Ingen andre dyrearter blev huset i denne bygning. De dunnarts blev forsynet vand ad libitum. Ingen dunnarts blev dræbt specielt til denne undersøgelse; maver kun blev indsamlet fra dyr aflivet enten på grund af sygdom eller til andre eksperimenter er godkendt af University of Melbourne Science, Optometri & Vision Sciences og Land & Miljø dyr etik-komité. Dyrene blev vejet med ugentlige intervaller under rutinemæssig dyrehold
Hurtig urease test (CLO test)
mave biopsier af 1-2 mm blev placeret i gelen af ​​en hurtig urease test (CLOtest;. Kimberly-Clark, Roswell, Georgia, USA). Tests blev overvåget over en 24 timers periode for en farveændring fra gul til rød, som indikerede tilstedeværelsen af ​​en urease-producerende organisme i maven.
Histologisk vurdering af patologi
mave halvdele blev fikseret i 10% neutral pufret formalin , indlejret i paraffin, derefter 4 um-tykke snit skåret og farvet med hematoxylin og eosin.
Påvisning af Helicobacter
infektion med slægten-specifik PCR Hus til vurdering af Helicobacter
infektion ved PCR, fæces var indsamles, eller Dunnart maver blev åbnet langs den indre krumning og hele organ homogeniseres (GmbH Polytron homogenisator, Kinematica, Schweiz). Slimhindeskrab blev også indsamlet fra tarmen (store og små). DNA blev ekstraheret fra afføring og intestinale afskrab bruger QIAamp skammel DNA (Qiagen, Hilden, Tyskland), og fra den homogeniserede maven under anvendelse af QIAamp væv DNA (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. En Helicobacter
slægten PCR rettet mod en 374 bp fragment af 16S rRNA-genet blev udført som tidligere beskrevet [17]. Salg Approaches at dyrke Dunnart gastrisk Helicobacter
Dunnart maver blev opsamlet og homogeniseret i Brain Heart Infusion bouillon (BHI, Oxoid, Basingstoke, UK). Homogenat blev tilsat til hesteblod-agar eller GSSA plader (som tidligere beskrevet [18]), som blev inkuberet i et anaerobt krukke med en mikroaerofil gas-frembringende kit (Oxoid, Basingstoke, UK) i op til 10 dage ved 37 ° C. Til filtrering teknik, blev homogenatet anbragt på 0,65 um Whatman filtrerpapir (GE Healthcare, Rydalmere, Australien), som er tilføjet på HBA-plader og inkuberet ved 37 ° C under mikroaerofile betingelser i 2 timer. Filtre blev derefter fjernet og pladerne inkuberes ved 37 ° C under mikroaerofile betingelser for op til 10 dage.
Gene sekventering af 16S ribosomale RNA
, CagA
og urea
Nine DNA-prøver udvundet Dunnart mave og tarm afskrab blev underkastet sekventering. PCR'er for Helicobacter
gener blev udført som tidligere beskrevet for 16S-rRNA
[17], CagA
[19] og urea
[20]. DNA-sekventering af de positive PCR-produkter blev udført ved hjælp af BigDye terminator kemi (Applied Biosystems, Foster City, USA). Sekventering af både 5'- og 3'-enden af ​​de amplikoner forekom i et volumen på 20 pi bestående af 3,5 pi sekventering puffer, 1 pi BigDye v3.1, 10 pmol /pl af den krævede primer, 40-100 ng DNA, og vand indtil slutvolumenet. Sekventeringen program bestod af 96 ° C i 1 min, 30 cyklusser ved 96 ° C i 10 sekunder, 50 ° C i 5 min og 60 ° C i 4 min. . Sekvenserne blev sammenlignet med gensekvenser af kendte identiteter ved hjælp af BLASTN søge program til rådighed gennem National Center for Biotechnology Information (NCBI) hjemmeside [21]
Resultater
Dødsfald i en stribe-faced Dunnart koloni - 2003
En koloni af Stripe-faced Dunnarts har eksisteret i 26 år, i første omgang på La Trobe University (Melbourne, Australien), og derefter ved Institut for Zoologi, University of Melbourne. Kolonien har normalt mellem 60-100 dyr, hvor kønsfordelingen er 1/1. Døden fra sygdom er sjælden i disse dyr og i et normalt år, forekommer samlede antal dødsfald ved en hastighed på ca. 10% eller mindre af antallet af dyr i kolonien. De fleste dødsfald sker som følge af skader opnået under parring (yngletiden løber fra juli til december) eller alderdom.
I 2003 var der imidlertid en dramatisk stigning i dødeligheden af ​​disse dyr, med 29% af den Dunnarts (30/104; lignende antal af mænd og kvinder) dør i perioden 6 måneder fra juli til december. De døende dyr var 1-2 år, og dødsfaldene var ikke relateret til alderdommen. Dunnarts tabe normalt kropsvægt i ynglesæsonen og dette vægttab blev også steg markant i 2003. Mand Dunnarts typisk mister i gennemsnit 12% kropsvægt fra juli til december, men i 2003 de tabte i gennemsnit 27,7%. Ligeledes kvindelige Dunnarts tabte i gennemsnit 30,3% i samme periode i 2003, sammenlignet med en typisk gennemsnitligt tab på 16%. Figur 1 viser den relative vægttab observeret af disse Dunnarts i 2003, i forhold til vægttab observeret i 2006, et typisk år, hvor der ikke var nogen øget dødelighed. Figur 1 Øget tab i kropsvægt i Stripe-faced Dunnart under sygdomsudbrud. Værdier vist til stede den gennemsnitlige ændring i kropsvægt ± S.E.M. af Stripe-faced Dunnarts i juli-december (beregnet som vægten af ​​de enkelte dyr i september og december som en procentdel af deres vægt i juli). De viste data er fra et år efter sygdomsudbrud (2003; n
= 25) og et normalt år, når der ikke øget dødelighed blev observeret (2006; n
= 35). Både hanner og hunner er inkluderet og kombineret data, som begge køn mistede lignende kropsvægt. Der var ingen signifikant forskel i kropsvægt i september 2003 og 2006. mistede dyrene betydeligt mere vægt i perioden frem til december 2003 i forhold til samme periode i 2006 (* p
< 0,001; ANOVA).
kun indlysende patologi observeret ved post mortem, var, at næsten halvdelen af ​​de dyr, der er døde eller er blevet aflivet på grund af at være meget syg havde alvorlige gastrisk blødning. Bortset fra øget vægttab, syntes de fleste dyr sunde indtil 1-2 dage før døden, selv om nogle få havde sort afføring (i overensstemmelse med gastrointestinal blødning) og tegn på blodmangel (bleg tryne og tandkød).
Dødsfald i en stribe-faced Dunnart koloni - 2004
maveblødning stede i disse dyr rejst muligheden for mavesår som følge af Helicobacter
infektion. Derfor, i maj 2004 maver fra to asymptomatiske kvindelige Dunnarts blev testet for Helicobacter
infektion ved hjælp af CLO test. Disse blev fundet at være positiv, støttende af en gastrisk Helicobacter
infektion. Histologisk analyse af disse maver afslørede tilstedeværelsen af ​​en relativt mild inflammatorisk proces, præget af lymfoide aggregater i lamina propria (figur 2), selv om der kunne observeres nogen koloniserende bakterier i enten spiral eller coccoid form, i disse afsnit. Ingen alvorlig patologi var tydelig i disse særlige afsnit, selv om disse maver blev indsamlet uden for yngletiden, når øget dødelighed og gastrisk blødning ikke var indtruffet. Figur 2 Inflammation i det gastriske lamina propria af en Helicobacter-inficerede Dunnart. Et billede er vist fra en H &E farvet sektion af gastrisk corpus, fra en Helicobacter
inficerede Dunnart (forstørrelse x 100). Maven blev indsamlet i maj 2004.
Mellem juli og december 2004 anden hændelse af øget dødelighed indtraf, med 24 ud af 81 (30%) af Dunnart koloni døende, hvoraf 6 havde gastrisk blødning.
In flere sager i 2003 og 2004, hunner, der blev anset for at være gravid fra reproduktive monitorering havde afbrudt kuldet da de blev undersøgt for at få fostre.
Helicobacter
infektion i Dunnart koloni 2005-2008
i 2005 og i de efterfølgende år, dødeligheden vendte tilbage til normale niveauer (~ 10% om året), blev observeret og ingen yderligere tilfælde af gastrisk blødning. Men sporadiske forsøg blev gjort for yderligere at undersøge den tilsyneladende gastrisk Helicobacter
infektion i disse dyr. Disse forsøg blev begrænset af tilgængeligheden af ​​dyr til sådanne undersøgelser.
I 2006 tilstedeværelsen af ​​Helicobacter
i fækale prøver indsamlet fra mandlige (n
= 20) og kvindelige (n
= 20) Dunnarts blev vurderet af slægten specifik PCR. Ved hjælp af denne metode, fæces af tilsvarende antal mænd (7/20) og kvindelige (7/20) Stripe-konfronteret Dunnarts viste sig at være koloniseret med Helicobacter
arter, som bevis for tilstedeværelsen af ​​Helicobacters
i mavetarmkanalen af ​​mindst nogle dyr i denne koloni. Forsøg på at dyrke Helicobacter
fra disse prøver var forgæves.
I juli 2007 blev maver og tarm afskrabninger indsamlet fra Dunnarts analyseret af slægten-specifik PCR. Disse viste, at 10/12 af de undersøgte dyr havde gastrisk Helicobacter
infektion. Igen forsøger at dyrke Helicobacter
fra mavens prøver var forgæves.
Arter identifikation af Helicobacter
infektion i Dunnart maven
At identificere, om en kendt eller roman Helicobacter
arter blev inficere Stripe -faced Dunnart koloni, 16S ribosomale RNA
(rRNA) Helicobacter
genet fra disse gastriske prøver blev delvist sekventeret. Dette viste, at 16S-rRNA
gensekvens af Helicobacter
inficere maver Stripe-faced Dunnarts svarede til H. pylori
stammer oprindeligt isoleret fra forskellige regioner i fordøjelsessystemet, herunder maven og tarmen. De identitet procenter opnået med sekvenserne var 100% (Tabel 1) .table en BLASTN hentning af Helicobacter pylori gensekvenser
BLASTN Hent
GenBank nummer
score (bits)
Identitet
E-værdier
Helicobacter pylori
klon P13 16S ribosomale RNA
gen
EF684928.1
699
100%
0,0
Helicobacter pylori
stammen CD2 16S ribosomale RNA
gen
HM243132.1
699
100%
0,0
Helicobacter pylori
stamme HP504 16S ribosomale RNA
gen
GU449115.1
695
100%
0,0
Helicobacter pylori
v225d 16S ribosomale RNA
gen
CP001582.1
695
100%
0,0
Helicobacter pylori
stammen 407D5 16S ribosomale RNA
gen
HM099656.1
695
100%
0,0
Helicobacter pylori
stamme 15818 cytotoksin protein III (CagA
) gen
AF083352.1
1288
96%
0.0
Helicobacter pylori
NCTC 11639 CagA (CagA
) gen
GQ161099 0,1
1282
96%
0,0
Helicobacter pylori
stamme 114C urinstof ( urea) gen
GQ403154.1
630
96-98%
3e-164 1e-177
Helicobacter
genus-specifikke PCR-produkter afledt Dunnart gastrisk DNA ekstrakter blev sammenlignet med H. pylori
Genbank sekvenser, der er anført i tabellen. De Dunnart prøver udviste 100% sekvensidentitet med 16s rRNA fra fem humane kliniske isolater af H. pylori
og 96-98% sekvensidentitet med CagA og urinstof
fra to humane kliniske isolater af H. pylori
.
vigtige H. pylori
virulens faktor, CAG
PAI (CAG
patogenicitet ø) koder en type-IV sekretion system med CagA. Ikke alle H. pylori
stammer besidder denne virulensfaktor, og individer inficeret med cag
PAI positive stammer udvikler typisk mere alvorlig gastritis, og har en stærkt forøget risiko for udvikler sig til sygdom. Urease, et enzym består af to subunits ureA
og ureB
, er afgørende for patogenesen af ​​H. pylori
i den menneskelige mave på grund af dens evne til at neutralisere mavesyre gennem produktion af bicarbonat. Analyse ved hjælp af specifikke PCR primere viste, at inficere Helicobacter
var CagA
og urinstof
positiv, og gen-sekventering afslørede 96% identitet med CagA
og 96-98% identitet med urea
fra H . pylori Hotel (tabel 1).
Naturlig tab af H. pylori
infektion i Stripe-faced Dunnart koloni
Når prøver blev indsamlet fra 18 kvindelige Dunnarts i juli 2008 overraskende, alle disse dyr var Helicobacter
negative angiver kolonien havde mistet infektionen. Der er ingen indlysende forklaring på tabet af H. pylori
infektion i disse dyr, da der ikke var nogen ændring i dyrehold, var heller ikke Dunnarts i behandling med antibiotika i denne periode.
For klarhedens skyld en kronologi over den ovenstående begivenheder er sammenfattet i tabel 2. Dunnart koloni i zoologi afdeling på University of Melbourne blev lukket i 2009, er til hinder yderligere study.Table 2 Kronologisk oversigt over begivenheder
Dato
begivenhed
juli til dec 2003
Øget dødelighed hos Dunnart koloni med gastrisk blødning.
maj 2004
Two Dunnart maver blev testet og har vist sig at være Helicobacter
positivt af CLO-test. Histologi afslørede mild gastritis.
Juli til Dec 2004
Øget dødelighed hos Dunnart koloni med gastrisk blødning.
2006
Dunnart afføring vist sig at være Helicobacter
positiv ved PCR.
2007
Dunnart maver vist sig at være Helicobacter
positiv ved PCR. Infektionen blev vist at være H. pylori
ved delvis sekventering af 16S-rRNA
, CagA
og urinstof
.
2008
Dunnart koloni viste sig at være Helicobacter
negative ved PCR af gastrisk væv.
diskussion
To udbrud af øget mortalitet i en koloni af den australske pungdyr, den Stripe-faced Dunnart i 2003 og 2004 var forbundet med gastrisk blødning og opstod sammenfaldende med en forbigående infektion i maver dyr i denne koloni med det humane patogen, H. pylori
. Især dette inficerende stamme besad virulensfaktor CagA
, hvilket antyder tilstedeværelsen af ​​cag
PAI type IV secerneringssystem, forbundet med en øget risiko for at udvikle gastrisk cancer eller mavesår hos mennesker. Mens kun fem af de ni Dunnart analyserede prøver var CagA
og urea
positiv, kan dette forklares ved den lave mængde af Helicobacter
DNA i disse prøver, selv om muligheden for heterogenitet i de inficerende stammer ikke kan være udelukket.
det var uheldigt, vi var ude af stand til at dyrke Helicobacter
fra Dunnart maver, da det kan have givet os mulighed for at studere graden af ​​heterogenitet, om nogen, af disse bakterier i kolonien. De første forsøg på at dyrke Helicobacter
blev udført i Perth, Western Australia, på prøver, der sendes fra Melbourne. Forsinkelsen skyldes indsamling og overførsel af disse prøver kan have begrænset vores evne til at isolere de inficerende bakterier. Men i senere undersøgelser vi forsøge at dyrke dem fra frisk gastrisk væv. Forsøg på frisk væv ved hjælp af HBA-plader mislykkedes, ikke for overraskende, på grund af svampeangreb tilgroning. Hvornår blev anvendt selektive GSSA plader, gjorde vi formår at oprindeligt kultur en bevægelig bakterie, men dette var efterfølgende overgroet af en coccoid organisme. Vi har forsøgt næste en filtrering tilgang, som med succes begrænset forurening med den coccoid organisme, men desværre heller ikke tillade os at isolere Helicobacter
. Dette kan tyde på Helicobacter
stede i Dunnarts enten havde dårlig motilitet (et vigtigt træk kræves for migration af bakterier gennem filtrerpapiret) eller kun var til stede i lave niveauer.
Som H. pylori
infektion gør ikke at være en del af den normale flora af disse dyr (som det spontant ryddet mellem 2007 og 2008) vi teoretisere, at H. pylori
kan have indtastet denne koloni som en infektion fra deres menneskelige handlere. Samtidig tilstedeværelse af mave infektion med H. pylori dele på tidspunktet for de maveblødning hændelser tyder stærkt denne bakterie kan have bidraget til sygdomsudbruddet. Det er klart, H. pylori
infektion alene var tilstrækkelig til at forårsage udbrud som infektionen var til stede under 2005-2007 uden en stigning i dødeligheden. Det kan dog godt have været en vigtig co-faktor i denne proces.
Tabet af H. pylori
infektion mellem 2007 og 2008 er spændende, med årsagen til denne forekomst resterende ukendt. Givet Helicobacter
var til stede i mindst tre år, var det ikke en kortsigtet fænomen, men var til stede over mange ynglende cyklusser. Det er derfor usandsynligt, at tabet af denne infektion skyldtes Helicobacter
blive udkonkurreret af indfødte flora, selv om denne mulighed ikke kan udelukkes. Det er også muligt, at dyrene ikke blev overføre smitten indbyrdes, men måske blev konstant inficeret med en human handling. Hvis dette var tilfældet, kan tabet af infektion har været på grund af en ændring i handleren mellem 2007 og 2008 at bryde infektionen transmission.
Stress synes at have været en vigtig co-faktor i sygdommen ætiologi, da udbruddene skete i yngletiden i disse dyr. Yngletiden er meget stressende for både mandlige og kvindelige Dunnarts, og i et gennemsnitsår, er ledsaget af et betydeligt tab i kropsvægt. Pungdyr kan være bemærkelsesværdigt følsomme over for stress, og det er blevet påvist, at stress begivenheder kan have en stor indflydelse på deres immunsystem [22].
Trods dette skal der være en anden co- eller forårsagende faktor involveret i 2003-2004 udbrud, da de Dunnarts avlet mens inficeret med H. pylori
i 2005-2007 uden nogen stigning i dødeligheden. Denne co-faktor forbliver uidentificeret, men synes ikke at være noget i forbindelse med dyrehold, da der ikke var nogen ændringer i boligforhold i kolonien, der var forbundet med enten sygdomsudbrud eller tab af H. pylori
infektion.
som konklusion foreslår vi, at infektion med human patogen H. pylori
kan have været en væsentlig, men ikke tilstrækkelig co-faktor i et udbrud af gastrisk blødning med døden til følge i en koloni af Stripe-konfronteret Dunnarts. Den tilsyneladende tilfældig infektion af disse pungdyr med deres menneskelige handlere, og foreningen med tilfældig gastrisk patologi, tyder på, at disse dyr kan give en interessant roman dyremodel for studiet af H. pylori
patogenese. Endvidere tyder denne observation en potentiel risikofaktor for fangenskab pungdyr for infektioner båret af deres menneskelige handlere.
Erklæringer
Tak
Forfatterne har nogen konkurrerende interesser. Vi anerkender støtten fra Kamani Nanayakkara, Phil Au, Angela Nation og Ellen Menkhorst for dyrehold og assistance med indsamling af prøver. Kolonien blev støttet af midler fra New Zealand Foundation for Science and Technology.
Forfattere 'originale indsendte filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 13567_2010_22_MOESM1_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 1 13567_2010_22_MOESM2_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 2 konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

• Karakterisering af human gastrisk karcinom-relaterede methylering af 9 miR CpG øer og undertrykkelse af deres udtryk in vitro og in vivo
• Virkninger af glukose insulinotropt polypeptid på ventrikeltømning, glykæmi og insulinaemia under kritisk sygdom: et prospektivt, dobbeltblindet, randomiseret, crossover study