Proteomanalyse af menneskelig gastrisk Cardia adenocarcinom med laser capture microdissection

Proteomanalyse af menneskelig gastrisk Cardia adenocarcinom med laser capture mikrodissektion
Abstract
Baggrund
Forekomsten af ​​gastrisk hjertefunktion adenocarcinom (GCA) har været stigende i de seneste to årtier i Kina, men de molekylære ændringer vedrørende carcinogenese er ikke blevet godt karakteriseret. Salg Fremgangsmåder
i denne undersøgelse anvendte vi en komparativ proteomisk tilgang med at analysere de maligne og ikke-maligne gastriske cardia epitelceller isoleret ved navigeres laser capture microdissection ( LCM) fra parrede kirurgiske prøver af human GCA.
Resultater
syvogtyve pletter svarende til 23 proteiner blev konsekvent forskelligt reguleret. Femten proteiner blev påvist at være opreguleret, mens otte proteiner blev vist at være nedreguleret i maligne celler sammenlignet med ikke-maligne søjleformede epitelceller. De identificerede proteiner syntes at være involveret i stofskiftet, chaperone, antioxidation, signaltransduktion, apoptose, celleproliferation og differentiering. Desuden blev udtryk for HSP27, 60 og Prx-2 i GCA prøver yderligere bekræftet ved immunohistokemisk og western blot-analyser.
Konklusion
Disse data indikerer, at kombinationen af ​​navigeres LCM med 2-DE tilvejebringer en effektiv strategi for at opdage proteiner, som udtrykkes differentielt i GCA. Sådanne proteiner kan bidrage til at belyse de molekylære mekanismer i GCA carcinogenese. Desuden kombination giver potentielle kliniske biomarkører, at støtte i tidlig påvisning og give potentielle terapeutiske mål.
Baggrund
Forskellige analyser af kræfttilfælde data hentet fra vestlige lande har afsløret hastigt stigende rater af adenokarcinom i spiserøret og gastrisk Cardia i de sidste par årtier, sammenlignet med de stabile og faldende priser til esophageal planocellulært karcinom (SCC) og distal gastrisk adenocarcinom (DGA) [1-3]. Dette fænomen er også tydeligt i Kina, bortset fra at den stigende forekomst af gastrisk Cardia adenocarcinom (GCA) vises markant højere end forekomsten af ​​kræft i spiserøret. Beviser indikerer, at GCA er en særskilt klinisk enhed som dens patogenese og risikofaktorer er helt forskellige fra DGA. Derfor GCA er langt mere udbredt, med en højere forekomst af lymfeknudemetastase og en dårligere prognose end DGA [4]. Den årlige forekomst af GCA er 50 /100.000 og kan endog være så høj som 190 /100.000 i flere regioner i Kina [5]. Den relativt symptomfri naturen i de tidlige stadier af sygdommen og manglen på passende screeningsundersøgelser har resulteret i et flertal af GCA patienter diagnosticeret til at være på en allerede fremskreden fase af sygdommen. Det er således nødvendigt at forstå den molekylære mekanisme af carcinogenese og identificere de biomarkører til tidlig diagnosticering og effektiv behandling af human GCA.
Nylig har proteomet opstået som en komplement komponent af genomet. Den antagelse er, at det drastisk kunne hjælpe med at udrede de biokemiske og fysiologiske mekanismer i komplekse multivariate sygdomme på det funktionelle molekylære niveau. Selvom genetisk mutation og /eller vildfaren genekspression, kan være afgørende for en sygdom, er de biokemiske grundlag for de fleste sygdomme forårsaget af protein defekter. Derfor kunne en analyse af den globale protein overflod i humane tumorer, kaldet kræft proteomics, tilbyder mange muligheder og udfordringer i at identificere nye tumormarkører og terapeutiske mål samt i forståelsen tumor patogenese. I øjeblikket er todimensional gelelektroforese (2-DE) og massespektrometri (MS) er de mest anvendte værktøjer til adskillelse og identifikation proteiner. Men heterogenitet er altid et problem i undersøgelser af humant tumorvæv. Selvom cellekultur er en fremgangsmåde for at eliminere dette problem, kan det ikke nøjagtigt repræsentere de molekylære begivenheder, der finder sted i selve væv, hvorfra de blev afledt [6]. En sammenligning mellem human prostata-cellelinjer og tumorceller fra de samme patienter viste, at 20% af proteinet profiler blev ændret [7]. Laser capture microdissection (LCM) er en nyere udvikling, som kan anvendes til at skaffe yderst repræsentativt subpopulation af celler fra komplekse heterogene vævsprøver [8]. Denne teknologi er blevet anvendt med stor succes i en bred vifte af undersøgelser under anvendelse af nedstrøms analyse på DNA og RNA-niveauer, herunder global genekspression profilering [9] og analyser af proteom af prostata [7], colon [10], hepatocellulær [11 ], bryst [12], og pancreatiske tumorer [13]. Imidlertid har kombinationen af ​​2-DE og MS aldrig blevet anvendt til studiet af human GCA.
Denne undersøgelse har til formål at skitsere carcinogenese af GCA og identificere GCA-specifikke sygdomsassocierede proteiner som potentielle kliniske biomarkører for tidlig påvisning og nye terapeutiske mål. Vi udførte navigeret LCM at berige både maligne og ikke-maligne gastriske hjerte-epiteler celler fra parrede kirurgiske prøver af human GCA. Proteinerne ekstraheret fra disse celler blev separeret ved 2-DE. Differential proteinpletter identificeredes ved peptidmassefingeraftryk (PMF) baseret på matrix-assisteret laser desorption /ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) og databasesøgning. Gyldigheden af ​​disse fund blev bekræftet ved immunhistokemiske og western-blot-analyser.
Metoder
Materialer
IPG strimler (pH 3-10 ikke-lineær) og IPG bufferopløsninger (pH 3-10 ikke-lineær) blev købt fra Amersham Pharmacia Biotech (APB, Sverige). DTT, urinstof, thiourinstof, Tris-base, TX-100, CHAPS, glycin, acrylamid, methylenbisacrylamid, SDS, TEMED, ammoniumpersulfat, sølvnitrat, Trypsin (sekventeringskvalitet), ACN, og TFA blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Endelig den komplette blanding af proteaseinhibitor var fra Roche (Lewes, UK). Milli-Q kvalitet vand blev brugt til alle løsninger.
GCA prøver
Ni par menneskelig gastrisk Cardia adenocarcinom og deres tilstødende nontumourous Cardia væv blev opnået inden for 30 minutter efter et kirurgisk resektion ved det andet tilknyttede hospital af Xi ' en Jiaotong Universitet i 2005 (tabel 1). For at undgå indlysende områder af ulcus eller nekrose blev prøverne udtages fra kanterne af tumorerne. De blev straks nedfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. I mellemtiden, to erfarne patologer evalueret tumoren grading ved en mikroskopisk undersøgelse af samples.Table 1 Kliniske og histologiske data for patientens tumor prøver
Case

Age

Gender

Locationa)

Size(cm)

Grade

1
58
M
Within 2 cm af GEJ
1,5 × 2
Moderat differentieret
2
63
M
Inden for 2 cm af GEJ
5 × 6
Moderat differentieret
3
46
M
Inden for 2 cm af GEJ
4 × 5
Moderat differentieret
4
60
M
Inden for 2 cm af GEJ
2 × 2,5
Godt differentieret
5
73
M
Inden for 2 cm af GEJ
3 × 1
Nå differentieret
6
70
M
Inden for 2 cm af GEJ
2 × 1
Nå differentieret
7
55
M
Inden for 2 cm af GEJ
2 × 3 fotos Dårligt differentierede
8
51
M
Inden for 2 cm af GEJ
4 × 6
Dårligt differentieret
9
63
M
Inden for 2 cm af GEJ
3 × 2,5
Dårligt differentieret
en) Sted: epicenter tumorvæv
Prøve forberedelse til LCM
Sektioner (8 um tyk) blev skåret over på slides (afrenset med vaskemiddel, vasket med deioniseret vand, og dyppet i ethanol) ved anvendelse af en Leica CM 1900 kryostat (kammer temperatur -28 ° C). Snittene blev enten opbevaret ved -80 ° C eller opbevares i kryostatkammeret forud for LCM. Hæmatoxylin farvning blev udført kun til overvågning af vævssnit og blev ikke brugt i forbindelse med LCM. Snit blev fikseret (70% ethanol i 1 min), hæmatoxylin farves og dehydreret (70% ethanol i 45 s, 95% ethanol i 45s, 2 x 100% ethanol i 30 sekunder, efterfulgt af xylen 2 × for 5 min). I mellemtiden blev ufarvede sektioner anvendes til LCM. De blev fastsat (70% ethanol i 30 sekunder), vasket i deioniseret vand i 10 sekunder, og dehydreres (70% ethanol i 15 sekunder, 95% ethanol i 15 sekunder, 2 x 100% ethanol i 15s, og efterfulgt af xylen 2 × i 1 min ). Komplet proteasehæmmere cocktail tabletter blev
navigeret LCM
Efter fastsættelse og dehydrering, ufarvede snit blev lufttørret og mikrodissekeres hjælp af Arcturus PixCellα systemet (Arcturus, Mountain View, CA, USA). LCM mikroskop afbildet en hæmatoxylin farvede sektion ved siden af ​​en af ​​interesse. Dette billede blev vist på LCM computerskærmen hjælp LCM billedanalysesoftware (Arcturus, USA) og blev anvendt som et kort til at afgrænse området for dissektion på en tilstødende ufarvet sektion. Sektionerne blev derefter taget med et 15 um diameter laserstråle typisk ved 50-80 mV magt med puls varighed på 3-10 ms i maskingevær mode og med en laser fyring frekvens på 1 skud pr 500 ms. I gennemsnit blev taget mellem 10.000-12.000 skud pr hætte, og blev opnået ca. 25.000-30.000 celler pr hætte. Hver hætte blev fanget inden for en time. Baseret på en nøje gennemgang af de histologiske snit blev hver dissektion skønnes at indeholde ≥ 95% af de ønskede celler. Salg Mikrodissektionsteknikker caps blev indsat i 0,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 50 ul en lysisbuffer (7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 4% w /v CHAPS, 65 mM DTT, 0,5% v /VTX-100, 40 mM Tris-base, og fuldstændig proteaseinhibitorcocktail). Derefter blev cellerne solubiliseret ved inversion af rør efterfulgt af vortex-blanding i 1 min og kortvarig puls-centrifugering ved 12, 000 x g. Bagefter blev væv fra flere hætter (ca. 800.000 ~ 1.000.000 celler) ekstraheret i samme lyseringspuffer indtil tilstrækkeligt materiale var blevet opsamlet. Prøverne blev centrifugeret ved 40.000 x g i 1 time ved 4 ° C. Om nødvendigt blev supernatanter opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved Bradford-metoden.
2-DE
første-dimensional isoelektrisk fokusering (IEF) blev udført på Pharmacia Immobiline IPG DryStrip systemet (Uppsala, Sverige). For første dimension af elektroforese blev prøverne indeholdende 60 ug protein til analyse geler fortyndet til 250 pi med en rehydrering opløsning (7 M urinstof, 2% vægt /volumen CHAPS, 50 mM DTT, 0,5% v /v IPG buffer (pH 3-10 ikke-lineær), og spore bromphenolblåt) før de anbringes på 13 cm IPG strimler (pH3-10 lineære). IEF blev derefter udført under anvendelse IPGphor elektroforese ifølge producentens anvisninger. Derefter blev strimlerne ækvilibreret med en opløsning (6 M urea, 30% vol /vol glycerol, 2% vægt /vol SDS og 50 mM Tris-HCI, pH 8,8), reduceret med 1% vægt /vol DTT i 15 minutter , og alkyleres med 2,5% vægt /volumen iodacetamid i 15 minutter. Strimler blev derefter skyllet i elektroforese-buffer (25 mM Tris-base, 192 mM glycin og 0,1% vægt /vol SDS), påført på 11% acrylamidgeler, og forseglet med smeltet agarose (0,5% vægt /volumen agarose i elektroforese buffer indeholdende en spor af bromphenolblåt). SDS-PAGE blev udført under anvendelse Hoefer SE 600 lodrette kamre og en Tris-glycin-buffer (25 mM Tris og 192 mM glycin) indeholdende 0,1% vægt /vol SDS, med indledende adskillelse ved en konstant 10 mA /gel i 30 minutter efterfulgt af 20 mA /gel. Den anden-dimensional SDS-PAGE blev udviklet indtil bromphenol blå farvestof markør havde nået bunden af ​​gelen. Den totale kørselstid var typisk 4 til 4,5 timer. Geler blev fikseret i 10% v /v eddikesyre, 40% v /v ethanol før sensibilisering i 30 minutter i en buffer indeholdende 30% v /v ethanol, 0,2% vægt /volumen natriumthiosulfat, og 0,83 M natriumacetat. Dette blev efterfulgt af tre 15 minutters vaske i deioniseret vand. Proteinerne blev derefter farvet med 0,1% w /v sølvnitrat i 20 min, vasket to gange i deioniseret vand i 1 min og udviklet i 2,5% vægt /volumen natriumcarbonat indeholdende 0,04% volumen /volumen formaldehyd (37% opløsning). Udviklingen blev standset med 1% volumen /volumen eddikesyre, og gelerne blev vasket tre gange i vand.
Billedanalyse og statistisk analyse
Umax ImageScanner (Amersham Biosciences) blev anvendt til at scanne gelerne, mens Image Master ™ 2D Platinum Version 5.0 software (Amersham Biosciences) blev anvendt til plet påvisning, kvantificering, og matchning. Intensiteten af ​​hver plet blev kvantificeret ved% volumen. Data blev derefter analyseret ved anvendelse af SPSS til Windows 11.5 og Excel. Students t
-test blev anvendt til at analysere forskellene i protein niveauer mellem GCA og ikke-tumor prøver, med et konfidensniveau på 95%.
MALDI-TOF-MS og database Søg
Konsekvent og væsentligt anderledes spots udvalgt til analyse med MALDI-TOF MS. Protein-pletter af interesse blev udskåret og hakket i små stykker, efterfulgt af affarvning og vask med deioniseret vand i flere gange, indtil den gule farve forsvandt. Gelstykker blev derefter skyllet med 25 mM ammoniumbicarbonat, dehydreret med ACN, og tørret i en vakuum centrifuge. Bagefter blev proteiner i-gel spaltet med 0,02 ug /ul trypsin natten over ved 37 ° C. Tryptiske peptider blev derefter genopløst i en opløsning indeholdende 50% v /v ACN og 0,2% v /v TFA. En 2 pi alikvot blev spottet på en prøveplade med 4 pi matrixopløsning CHCA (a-cyano-4-hydroxcinnamic syre, 10 mg /ml i 50% v /v ACN, 0,2% vol /vol TFA) og fik lov til luft tørre. De tørrede pletter blev derefter analyseret i et Voyager DE MALDI-TOF MS (Framingham, MA, USA). Dette blev efterfulgt af køre spektrometer i en positiv ion-mode og i reflektor tilstand med følgende indstillinger: accelerationsspænding, 20 kV; Gride spænding, 94%; guidewire spænding, 0,01%; og en forsinkelse på 200 ns. Spectra erhvervet manuelt med laser intensitet sat til 3200 med 80 skud pr spektrum. Derefter masseinterval blev indstillet mellem m-service /z
500 og m-service /z
5000. Intern kalibrering blev påført under anvendelse af angiotensin II og insulin-B-kæde toppe ved 912,08 Da og 3495,95 Da. Salg proteiner blev identificeret ved peptidmassefingeraftryk hjælp af søgeprogram Aldente [14] med følgende søgeparametre anvendt: SWISS-PROT og TrEMBL blev anvendt som protein sekvensdatabaser; en masse tolerance på 100 ppm og en ufuldstændig spaltning fik lov; carboxyamidomethylation, oxyderede methionin og phosphorylering blev anset som mulige ændringer; det mindste antal matchede-peptider var 4; og peptidet ion var [M + H] +.
Immunohistokemisk og western blot-analyse
at validere ekspressionsmønstre for tre proteiner i GCA væv, immunohistokemi blev udført under anvendelse formalinfikseret og paraffinindlejret væv enheder, som er matchet med 2-DE-prøver. Afvoksede 5 um tykke snit blev behandlet med en 0,3% hydrogenperoxidase i 3 min og med et blokerende antistof i 30 min. Efter varme-medieret antigen-genvinding blev snit inkuberet med primært antistof ved 4 ° C natten over som følger: HSP27 (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1: 500; HSP60 (Santa Cruz, USA), 1: 300; og Prx-2 (Santa Cruz, USA), 1: 150. Snit blev derefter inkuberet med et peroxidase-mærket antistof (1: 500)., Fremkaldt med diaminobenzine, og modfarvet med hæmatoxylin Hus Til Western blot-analyse blev proteinprøver (30 ug), der anvendes i 2-DE kørt på 12% SDS-PAGE, overført til PVDF-membraner, og derefter blokeret med PBS /5% skummetmælk /0,01% Tween i 2-4 timer ved stuetemperatur. Primært antistof blev fortyndet med blokerende buffer og blev tilsat som følger: HSP27, 1: 200; HSP60, 1: 300; og Prx-2, 1: 200. Derefter blev det inkuberet med et peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof og et HRP-konjugeret anti-GAPDH /β-actin-antistof for at bekræfte lige protein loading i hver bane i 1-2 timer ved 37 ° C eller stuetemperatur. Prøverne blev vasket og detekteres med forøget kemiluminescens i 30-60 s (Minipore).
Resultater
Profil forskelle mellem navigeret LCM prøver og hele undissected frysemikrotomsnit væv
at vurdere virkningerne af navigeret LCM på profiler vævsprotein udførte vi 2-DE-proteinprofiler af hele undissected frysemikrotomsnit væv og LCM-prøver af GCA. Figur 1 viser et eksempel på den navigeres LCM processen. Flertal af de fundne i de dissekerede ikke-tumor og tumorvæv pletter kunne observeres i hele undissected frysemikrotomsnit væv, bortset fra flere steder. Der er dog stadig nogle pletter fundet i hele undissected kryostat væv, der ikke kunne observeres i begge LCM prøver. Således kunne denne teknologi ikke blot beriger ikke-tumor og tumor epitelceller men kan også formindske forureningen i væv, såsom hæmoglobin [10, 11]. Endvidere kunne navigeres LCM proces eliminere virkningerne af farvning på protein separation ved 2-DE [15]. Således støtter vores data behovet for at udføre navigeret LCM i proteomiske studier af GCA væv. Figur 1 navigeret laser capture mikrodissektion af tumorvæv. (A) Haematoxylin-farvet gastrisk cardia adenocarcinom; (B) Ufarvet GCA væv; (C) Tumor væv efter mikrodissektion; (D) Captured tumorceller på LCM film.
Profil forskelle i protein-ekspression mellem GCA væv og de omkringliggende ikke-tumorvæv
Vi udførte en navigeres LCM og 2-DE for matchede par af tumorvæv og det omgivende ikke- tumorvæv fra GCA patienter. Ca. 800-1.000 proteinpletter blev påvist ved sølvfarvning. Til måling reproducerbarhed hver prøve gennemgik eksperimentet tre gange. Der var 905 ± 74 og 867 ± 51 proteinpletter i kortet over GCA og ikke-tumor gastrisk hjertevæv hhv. De matchede pletter var 799 ± 29 og 727 ± 34 hver for sig, og den respektive gennemsnitlige matchrate var 88,2% og 83,8%. Desuden er den gennemsnitlige position afvigelse af matchede pletter var 1,031 ± 0,205 mm og 1,44 ± 0,11 mm i IEF og SDS-PAGE retning hhv. Selv om billedet analyse viste, at disse 2-DE-kort var reproducerbare, var der mindre forskelle i intensiteten og antallet af pletter. Ikke desto mindre en analyse af gelerne viste 27 proteinpletter hvis intensiteter varierede betydeligt og konsekvent mellem ikke-tumor og tumorvæv (fig. 2). Forholdene mellem normaliserede spot intensiteter af kræft til paraneoplasis væv for hver af proteinerne af interesse blev beregnet. Steder viser en to-fold forskel og med statistisk signifikans (p <0,05) blev udvalgt. Tre af de 2-DE-resultater blev bekræftet ved immunohistokemisk og western blot-analyser. Figur 2 2-DE kort over maligne og ikke-malign gastrisk Cardia væv. Alle de kort, der er vist fremstilles ud fra den samme patient. (A) 2-DE kort over hele undissected frysemikrotomsnit væv; (B) 2-DE kort af ikke-tumorvæv efter LCM; (C) 2-DE kort over GCA væv efter LCM.
Protein identifikation
Begge hele undissected frysemikrotomsnit prøver og LCM-prøver blev anvendt til identifikation protein. Tyve-syv forskellige protein pletter mellem GCA væv og de omkringliggende ikke-tumorvæv blev skåret. Imidlertid blev kun 23 proteiner identificeret ved MALDI-TOF-MS (tabel 2). Dette fænomen skyldes sandsynligvis post-translationelle modifikationer som peroxiredoxin 1 (Prx-1), som var til stede i to tilstødende pletter (fig. 2, spot 11). Disse proteiner blev klassificeret i en af ​​følgende: celledeling og differentiering (ANXA2, ANXA4, hnRNPA2 /B1), apoptose (Prx-1, Prx-2, GSTP, VDAC, ETFB), metabolisme (ADH1C, AKR1C3, CA2, GATM ), protease relateret (CTSD, PACSIN1), cystoskeleton (Actin 1, Keratin 8), chaperoner (Hsp27, 60, 70, PDIA3), og RNA bindende og transskription (hnRNPH3, PCBP1, ENO1). Figur 3 viser PMF kort over HSP60.Table 2 Proteiner med differentiel ekspression mellem GCA tumorvæv og tilstødende parrede ikke-tumorvæv blev identificeret med MALDI-TOF MS
Up-regulering proteiner
Spot No.
Protein
tiltrædelse No.A)
Hr /PIB)
match
Cov (%) c)
T-test
ration (tumor /ikke-tumor) Betyder ± SD
1
Heat-shock protein beta-1 (HSP27) *
P04792
23 /6.0
9
54
0,0040
3,4279 ± 2,0727
2
Heat shock 70 kDa protein 5 (HSP70)
P11021
70 /5.0
22
42
0,0030
3,2597 ± 1,5314
3
60 kDa varmechokprotein (HSP60) *
P10809
58 /5,2
12
37
0,0001
2,8308 ± 1,1426
4
disulfidisomeraseproteinet A3 (PDIA3) *
P30101
54 /5.6
13
41
0,0280
4,2105 ± 2,7294
5
Annexin A4 (ANXA4)
P09525
36 /5.8
10
34
0,0140
4,7153 ± 7,3434
6
Annexin A2 (ANXA2)
P07335
38 /7,5
7
26
0,0150
6,0722 ± 5,5431
7
Heterogen nukleare ribonucleoproteiner A2 /B1 (hnRNP A2 /B1 ) *
P22626
37 /9.0
16
43
0,0050
10,7775 ± 9,5547
8
Cathepsin D tung kæde (CTSD)
P07339
27 /5,6
12
61
0,0012
4,3552 ± 3,7703
9
protein kinase C og kasein kinase substrat i neuroner protein 1 (PACSIN1)
Q9BY11
51 /5,1
5
24
0,0028
2,6026 ± 1,2147
10
Glutathion S- transferase P (GSTP) *
P09211
23 /5.4
5
44
0,0026
3,8757 ± 2,2198
11
Peroxiredoxin-1 (Prx-1) *
Q06830
22 /8.3
8
59
0,0140
4,2744 ± 4,1568
12
Poly (rC) -bindende protein1 (PCBP1) *
Q15360
37 /6,7
12
63
0,0070
2,7401 ± 0,5321
13
Aldo-keto-reduktase familie 1member C3 (AKR1C3)
P42330
37 /8,1
7
25
0,0040
2,7762 ± 1,1820
14
Glycineamidinotransferase (GATM)
P50440
44 /6,4
8
23
0,0390
2,7839 ± 0,4680
15
Keratin, type II cytoskeletale 8 (Keratin 8) *
P05787
54 /5.5
9
25
0,0020
3,5063 ± 0,6423
nedregulering proteiner
16
Actin , cytoplasmatiske 1 (Actin 1) *
P60709
42 /5,3
6
30
0,0160
0,2603 ± 0,1539
17
Heterogene nukleare ribonucleoproteiner H3 (hnRNPH3)
P31942
37 /6,4
5
28
0,0015
0,6028 ± 0,6229
18
Peroxiredoxin-2 (Prx-2) *
P32119
22 /5,7
6
24
0,0250
0,2376 ± 0,1202
19
Carbonic anhydrase2 (CA2) *
P00918
29 /6,8
6
33
0,0130
0,3675 ± 0,1270
20
Alpha-enolase * (ENO1)
P06733
47 /7.0
16
42
0,0030
0,2898 ± 0,1340
21
Alkohol dehydrogenase 1C (ADH1C)
P00326
40 /8.6
7
49
0,0280
0,2287 ± 0,1680
22
Electron transfer flavoprotein subunit b (ETFB)
P38117
28 /8.3
6
26
0,0240
0,2655 ± 0,1415
23
Spænding-afhængige anion -selektive kanal (VDAC) *
P21796
31 /8.6
7
39
0,0120
0,4474 ± ​​0,0297
a) Swiss-Prot tiltrædelsen nr.
b ) Teoretisk værdi
c) sekvensdækning%
* proteinerne er fundet i gastrisk cancer tidligere.
Figur 3 MALDI-TOF MS identifikation af stedet 3 i GCA.
Immunohistokemisk og western blot-analyse for HSP 27, 60, og Prx-2 i GCA
for yderligere at undersøge, om HSP27, 60 og Prx-2 udtrykkes i væv og at bestemme, hvilke celler udtrykker disse proteiner, blev immunhistokemisk analyse udført under anvendelse af formalin-fikseret og paraffin- indlejrede vævsprøver, der blev matchet med 2-DE-prøver. Ekspressionen af ​​HSP27 og 60 kunne ses i alle cytoplasmaer af carcinomceller, mens det kunne ses i nogle af cytoplasmaer af søjleformede epitel (fig. 4A-D) i ikke-tumorvæv. I modsætning hertil blev Prx-2 næsten ikke fundet at blive udtrykt i de carcinomaceller, men snarere i visse cytoplasmaer af søjleformede epitelceller (fig. 4E, F). For at undersøge disse protein-ekspressionsniveauer blev western blot-analyse også udført under anvendelse af de samme væv (fig. 5). Som forventet blev HSP27 og 60 fundet at være konsekvent stærkt udtrykt i tumorvæv, hvorimod Prx-2 blev undertrykt. Figur 4 Immunohistokemisk analyse for HSP27, 60 og Prx-2 i humant normalt gastrisk Cardia og GCA. Expressions of HSP27 (A), 60 (C), og Prx-2 (E) var i cytoplasmaet af tumorceller; Expressions of HSP27 (B), 60 (D) og Prx-2 (F) blev fundet i cytoplasma af normale søjleformede epitelceller; Forstørrelser: A-F · 40, modfarvet med hematoxylin
Figur 5 Western blot-analyse for at validere forøget ekspression af HSP27, 60, og nedsat ekspression af Prx-2 i GCA væv.. . GAPDH og β-actin blev anvendt som referencer
Diskussion
Cardia er den anatomiske grænselandet mellem spiserøret og maven; derfor, der er konstant uenighed om deres forhold med hensyn til epidemiologi, kliniske funktioner, og klassifikation blandt esophageal adenocarcinom (EA), GCA, og DGA. At sammenligne deres protein profiler, vi søgte litteraturen for at finde disse proteiner. Tretten ud af 23 proteiner er blevet fundet i DGA tidligere (tabel 2). Blandt dem, HSP27, 60, 70, PDIA3, og CA2 har samme ekspressionsmønster i GCA og DGA. I modsætning hertil blev et lavt niveau ekspression af HSP27 findes i EA [16-20]. Derfor tumorudvikling af GCA er forskellig fra EA og DGA, og dermed GCA bør være en særskilt patologisk enhed.
Cellular heterogenitet har været en betydelig barriere for den molekylære analyse af normale og syge væv. Først beskrevet af Emmert-Buck et al. i 1996, laser capture microdissection er en kraftfuld og præcis teknik, der anvendes til at studere protein-ændringer i en bestemt undergruppe af celler i en lav vedligeholdelse system, der er let at betjene [8]. Som sædvanlig er forskellige histokemiske pletter af vævssnittet bruges til at guide dissektion processen. Imidlertid har flere tilfælde vist moderate til dramatiske virkninger af farvning på protein separation ved 2-DE [21, 22]. For at eliminere farvning som en potentiel skadelig virkning, har navigeret LCM er udviklet for nylig. Det bruger en farvet sektion til at guide dissektion af de ufarvede tilstødende eksemplar [23]. Denne teknik er blevet anvendt med succes i studiet af hjerneprøver [15]. Desuden, på grund af de typiske morfologiske karakteristika for den gastriske kardiale overfladiske søjleformet celle og den kardiale kirtel, de er nemme at identificere på en dehydreret sektion uden farvning. Derfor navigeres LCM blev en optisk strategi i vores proteomics tilgang. I denne forskning, antallet af LCM-afledte ikke-maligne og maligne celler varierede væsentligt og ofte var små i forhold til hele undissected frysemikrotomsnit væv, på trods af de profiler, der var meget ens mellem LCM prøver og undissected dem. Dette indikerede, at navigeres LCM kan være en mulig fremgangsmåde til undersøgelse af gastrisk hjertevæv og at det er kompatibelt med 2-DE og MALDI-TOF MS.
Vi opnåede proteinprofilen af ​​GCA ved at sammenligne ændringer i proteinet profiler af omgivende ikke-tumorvæv. For at reducere individuelle forskelle, blev vævsprøver opnået fra den samme patient, så vi kan studere forskellen proteinekspression under tilsvarende genomisk baggrund. Så vidt vi ved, rapporterede vi det første proteomiske analyse af GCA. Af de 27 udvalgte proteinpletter blev 23 proteiner i molekylmasse området fra 15 til 75 kDa og med et isoelektrisk punkt mellem 3 og 10 identificeret ved 2-DE og MALDI-TOF MS. De fleste af disse proteiner blev beskrevet tidligere, som differentielt udtrykt enten på mRNA-niveau eller på proteinniveauet i andre typer af human cancer.
HSP'er er en gruppe af stressproteiner induceret af forskellige typer af miljømæssige og patofysiologiske fornærmelser. I denne undersøgelse blev co-up-forskrifter HSP27, 70, og 60 findes i de gastriske kardiale tumorvæv. Som chaperoner, kunne HSP27 og HSP70 inhiberer apoptose ved at interagere med apoptosome og caspase af aktivering kompleks [24], der ligger til grund deres roller i tumorprogression og modstand mod behandling [25]. Talrige undersøgelser viser, at Hsp27 og HSP70 overexpressions signalere en dårlig prognose og forudsige en dårlig reaktion på kemoterapi. HSP60 synes at være en vigtig endogen inflammatorisk mediator og formentlig frigivet af beskadigede celler. Desuden sammen med HSP70, HSP60 har en rolle i antigenpræsentation i maligne sygdomme [26]. HSP'erne også overudtrykt i bryst-, tyktarms-, gastrisk, og prostata carcinomer [10, 25]. Derfor kan overekspression af HSP27, 70, og 60 være nyttige biomarkører for carcinogenese i GCA og kan være forbundet med graden af ​​differentiering og prognosen for GCA.
Blandt identificerede proteiner, er to proteiner involveret i reguleringen af ​​transkription og ekspression af tumorassocierede gener. PCBP1, opreguleret i GCA, er et RNA chaperone posttranskriptionel regulator. Det er blevet påvist, at PCBP1 sammen med PTB-1 og hnRNPK, styrer nogle proto-onkogen gener og apoptose-relaterede gener ekspression, såsom Bag-1, c-myc
, Apaf-1, XIAP, og DAP5, ved at stimulere aktiviteten af ​​interne ribosom entry segment (IRES). PCBP1 er forpligtet til at åbne RNA i området, der indeholder vinduet post ribosomet, mens PTB-1 kan være påkrævet for ribosom rekruttering [27, 28]. For nylig, Pickering, B.M. et al. beskrevet, at den glycan dele af PCBP1 kan være relateret til metastatisk evne og kan spille en rolle i hepatocellulært carcinom metastase [27]. Derefter opregulering af PCBP1 kan regulere cap-uafhængig mekanisme for translationsinitiering af kardiale tumorassocierede gener i udviklingen af ​​GCA. Som en tumor suppressor, kan Alpha-enolase regulere c-myc promotoraktivitet i form af en c-myc binding protein (MBP-1). MBP-1 kan derefter binde til P2 element i c-myc-promotoren og konkurrere med TATA-box-bindende protein (TBP) til at undertrykke transkription af c-myc [29, 30]. På den anden side, nedregulering af Alpha-enolase er i overensstemmelse med arbejdet i Chang YS et al.

• Klinisk betydning af palliativ gastrektomi på overlevelsen af ​​patienter med uhelbredelig fremskreden mavekræft: en systematisk gennemgang og meta-analyse
• MicroRNA-645, opreguleret i human adencarcinoma af gastrisk esophageal vejkryds, hæmmer apoptose ved at målrette tumor suppressor IFIT2