Analyse protéomique de l'estomac cardia adénocarcinome humain par l'analyse capture laser microdissection

protéomique du cardia gastrique humaine adénocarcinome par microdissection laser
Résumé de l'arrière-plan
L'incidence de l'adénocarcinome gastrique cardiaque (GCA) a augmenté au cours des deux dernières décennies en Chine, mais les changements moléculaires liés à la cancérogenèse ont pas été bien caractérisée.
Méthodes
dans cette étude, nous avons utilisé une approche protéomique comparative pour analyser les cardia gastrique malignes et non malignes des cellules épithéliales isolées par navigué microdissection par capture laser ( LCM) à partir de prélèvements chirurgicaux paires de GCA humain.: Résultats
Vingt-sept points correspondant à 23 protéines ont été constamment régulés différemment. Quinze protéines se sont avérés être régulés à la hausse, tandis que huit protéines se sont avérés être régulés à la baisse dans les cellules malignes par rapport aux cellules épithéliales bénignes. Les protéines identifiées semblent être impliquées dans le métabolisme, le chaperon, antioxydation, transduction du signal, l'apoptose, la prolifération cellulaire et la différenciation. En outre, les expressions de HSP27, 60 et Prx-2 dans les échantillons GCA ont été confirmées par blot immunohistochimique et de l'ouest des analyses.
Conclusion
Ces données indiquent que la combinaison de LCM navigué avec 2-DE fournit une stratégie efficace pour découvrir des protéines qui sont exprimés de manière différentielle dans GCA. Ces protéines peuvent contribuer à élucider les mécanismes moléculaires de la cancérogenèse GCA. En outre, la combinaison fournit des biomarqueurs cliniques potentielles que l'aide à la détection précoce et de fournir des cibles thérapeutiques potentielles.
Contexte
Diverses analyses de données sur l'incidence du cancer de réforme des pays occidentaux ont révélé une hausse des taux rapide de l'adénocarcinome de l'œsophage et du cardia gastrique dans ces dernières décennies, par rapport aux taux stables et à la baisse pour le carcinome œsophagien spinocellulaire (CSC) et l'adénocarcinome gastrique distal (DGA) [1-3]. Ce phénomène se manifeste aussi en Chine, à l'exception que l'incidence croissante de l'estomac cardia adénocarcinome (GCA) apparaît sensiblement plus élevé que l'incidence du cancer de l'œsophage. Les données indiquent que GCA est une entité clinique distincte que ses pathogenèse et facteurs de risque sont très différents de la DGA. Par conséquent, GCA est beaucoup plus répandue, avec une incidence plus élevée de métastases ganglionnaires et un plus mauvais pronostic que DGA [4]. L'incidence annuelle de GCA est de 50 /100.000 et peut même être aussi élevée que 190 /100.000 dans plusieurs régions de la Chine [5]. La nature relativement asymptomatique dans les premiers stades de la maladie et le manque de tests de dépistage adéquats ont donné lieu à la majorité des patients diagnostiqués GCA être à un stade déjà avancé de la maladie. Ainsi, il est nécessaire de comprendre le mécanisme moléculaire de la carcinogenèse et d'identifier les biomarqueurs pour le diagnostic précoce et le traitement efficace de la GCA humaine.
Récemment, le protéome a émergé comme un composant du complément du génome. La supposition est que cela pourrait considérablement aider à démêler les mécanismes biochimiques et physiologiques des maladies multivariées complexes au niveau moléculaire fonctionnelle. Bien que la mutation génétique et /ou l'expression du gène errant peuvent sous-tendre une maladie, les bases biochimiques pour la plupart des maladies sont causées par des défauts de protéines. Par conséquent, une analyse de l'abondance de la protéine mondiale dans les tumeurs humaines, appelée protéomique du cancer, pourrait offrir de nombreuses opportunités et défis dans l'identification de nouveaux marqueurs tumoraux et des cibles thérapeutiques ainsi que dans la compréhension de la pathogenèse de la tumeur. Actuellement, l'électrophorèse bidimensionnelle gel (2-DE) et la spectrométrie de masse (MS) sont les outils les plus utilisés pour la séparation et l'identification des protéines. Cependant, l'hétérogénéité est toujours une préoccupation dans les études de tissu tumoral humain. Bien que la culture cellulaire est une approche pour résoudre ce problème, il pourrait ne pas représenter avec précision les événements moléculaires qui ont lieu dans le tissu réel à partir duquel ils ont été dérivés [6]. Une comparaison entre les lignées cellulaires prostatiques humaines et des cellules tumorales provenant des mêmes patients a montré que 20% des profils protéiques ont été modifiés [7]. microdissection laser (LCM) est un développement récent qui peut être utilisé pour se procurer sous-population très représentatif de cellules à partir d'échantillons de tissus complexes et hétérogènes [8]. Cette technologie a été utilisée avec succès dans un large éventail d'études utilisant l'analyse en aval, à l'ADN et les taux d'ARN, y compris l'expression génique globale de profilage [9] et des analyses du protéome de la prostate [7], du côlon [10], hépatocellulaire [11 ], du sein [12] et les tumeurs du pancréas [13]. Cependant, la combinaison de 2-DE et MS n'a jamais été appliquée à l'étude de GCA humaine.
Cette étude vise à décrire la carcinogenèse de GCA et d'identifier des protéines associées à des maladies GCA spécifiques en tant que biomarqueurs cliniques potentiels pour la détection précoce et de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons effectué navigué LCM pour enrichir les cellules gastriques cardiaques épithéliales malignes et non malignes de prélèvements chirurgicaux paires de GCA humaine. Les protéines extraites à partir de ces cellules ont été séparées par 2-DE. taches de protéines différentielles ont été identifiés par la masse peptidique empreinte (PMF) sur la base de désorption laser assistée par matrice /ionisation à temps de vol spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS) et la recherche de base de données. La validité de ces résultats a été confirmée par immunohistochimie et western-blot analyse des matériaux de de. Méthodes
bandes IPG (pH 3-10 non linéaire) et des solutions tampons IPG (pH 3-10 non linéaire) ont été achetés auprès de Amersham Pharmacia Biotech (APB, Suède). DTT, l'urée, la thiourée, Tris base, TX-100, CHAPS, la glycine, l'acrylamide, le méthylènebisacrylamide, le SDS, TEMED, le persulfate d'ammonium, le nitrate d'argent, Trypsine (sequencing grade), ACN, et le TFA ont été achetés auprès de Sigma (St. Louis, MO, USA). Enfin, le cocktail complet d'inhibiteurs de protéase est de Roche (Lewes, UK). l'eau de qualité Milli-Q a été utilisé pour toutes les solutions.
échantillons GCA Neuf paires de gastrique cardia adénocarcinome humain et leurs tissus nontumourous adjacents du cardia ont été obtenus dans les 30 minutes après une résection chirurgicale au second hôpital affilié de Xi ' une université Jiaotong en 2005 (tableau 1). Afin d'éviter les zones évidentes de l'ulcère ou de nécrose, les échantillons ont été achetés à partir des bords des tumeurs. Ils ont été immédiatement congelés dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à utilisation. consentements éclairés ont été obtenus à partir de tous les patients. Pendant ce temps, deux pathologistes expérimentés a évalué la classification de la tumeur par un examen microscopique des samples.Table 1 Les données cliniques et histologiques d'échantillons de tumeur du patient
Case

Age

Gender

Locationa)

Size(cm)

Grade

1
58
M
Within 2 cm de GEJ
1,5 × 2
Modérément différencié 2
63
M
Dans les 2 cm de GEJ
5 × 6
Modérément différencié 3
46
M
Dans les 2 cm de GEJ
4 × 5
Modérément différencié 4
60
M
Dans les 2 cm de GEJ
2 × 2,5
bien différencié
5
73
M
Dans les 2 cm de GEJ
3 × 1
bien différencié
6
70
M
Dans les 2 cm de GEJ
2 × 1
bien différencié
7
55
M
Dans les 2 cm de GEJ
2 × 3
mal différenciée 8
51
M
Dans les 2 cm de GEJ
4 × 6
mal différencié
9
63
M
Dans les 2 cm de GEJ
3 × 2,5
mal différenciée
a) Lieu: épicentre de tissu tumoral
préparation des échantillons pour LCM
Sections (8 um d'épaisseur) ont été coupés sur des lames (préalablement nettoyées avec un détergent, lavé avec de l'eau désionisée et trempée dans de l'éthanol) en utilisant un Leica CM 1900 cryostat (température de la chambre -28 ° C). Les coupes ont été soit stockés à -80 ° C ou maintenu dans la chambre de cryostat avant la LCM. Hématoxyline coloration n'a été réalisée que pour le contrôle des coupes de tissus et n'a pas été utilisé en conjonction avec GCV. Les coupes ont été fixées (éthanol à 70% pendant 1 min), l'hématoxyline teinté et déshydraté (éthanol à 70% pendant 45 s, de l'éthanol à 95% pour 45 ans, l'éthanol 2 × 100% pendant 30 secondes, suivi de xylène 2 x pendant 5 min). Pendant ce temps, les sections non colorées ont été utilisées pour LCM. Ils ont été fixés (éthanol à 70% pendant 30 secondes), lavé dans de l'eau déminéralisée pendant 10 secondes, et déshydraté (éthanol à 70% pendant 15 secondes, l'éthanol à 95% pendant 15 secondes, l'éthanol 2 × 100% pendant 15 secondes et suivi de xylène 2 x 1 min ). inhibiteur de protéase complète des comprimés de cocktail ont été
Navigué LCM
Après la fixation et la déshydratation, les sections ont été séchées à l'air non colorées et micro-disséquées en utilisant le système Arcturus PixCellα (Arcturus, Mountain View, CA, USA). LCM microscope imager une section tachée de hématoxyline adjacent à celui de l'intérêt. Cette image a été affichée sur l'écran d'ordinateur de LCM en utilisant LCM logiciel d'analyse d'image (Arcturus, États-Unis) et a été utilisé comme une carte pour délimiter la région pour la dissection sur une section unstained adjacente. Les sections ont ensuite été capturées à l'aide d'un faisceau 15 um laser de diamètre généralement à 50-80 puissance mV avec une durée d'impulsion de 3-10 ms en mode mitrailleuse et avec une fréquence de tir laser de 1 coup par 500 ms. En moyenne, entre 10,000-12,000 images ont été prises par casquette, et environ 25.000-30.000 cellules ont été obtenues par casquette. Chaque bouchon a été capturé dans l'heure. Sur la base d'un examen attentif des coupes histologiques, a été estimé à chaque dissection pour contenir ≥ 95% des cellules souhaitées.
Microdissection bouchons ont été insérés dans 0,5 ml microtubes contenant 50 ul d'un tampon de lyse (urée 7 M, 2 M thiourée, 4% p /v CHAPS, 65 mM de DTT, 0,5% v /VTX-100, 40 mMTris-base, et complète inhibiteur de la protéase cocktail). Ensuite, les cellules ont été solubilisées par inversion des tubes puis vortex le mélange pendant 1 min et une brève impulsion centrifugation à 12 000 x g. Par la suite, les tissus à partir de plusieurs capsules (environ 800.000 ~ 1.000.000 cellules) ont été extraites dans le même tampon de lyse jusqu'à ce que suffisamment de matière a été recueillie. Les échantillons ont été centrifugés à 40 000 x g pendant 1 heure à 4 ° C. Le cas échéant, les surnageants ont été stockés à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. La concentration en protéine a été déterminée par la méthode de Bradford.
2-DE
La première dimension isoélectrique (IEF) a été réalisée sur un système Pharmacia Immobiline IPG DryStrip (Uppsala, Suède). Pour la première dimension de l'électrophorèse, les échantillons contenant 60 ug de protéine pour des gels d'analyse ont été dilués à 250 pi d'une solution de réhydratation (7 M d'urée, 2% p /v de CHAPS, 50 mM de DTT, du tampon 0,5% v /v IPG (pH 3-10 non linéaire), et tracer le bleu de bromophénol) avant le chargement sur 13 cm bandes IPG (pH3-10 non linéaires). IEF a ensuite été réalisée à l'aide IPGphor unité d'électrophorèse selon les instructions du fabricant. Ensuite, les bandes ont été équilibrées avec une solution (6 M d'urée, 30% v /v de glycérol, 2% p /v de SDS et 50 mM de Tris-HCl, pH 8,8), réduit à 1% en poids /volume de DTT pendant 15 min et alkylée avec 2,5% en poids /volume d'iodoacétamide pendant 15 min. Les bandes ont été ensuite rincées dans un tampon d'électrophorèse (25 mM de base Tris, 192 mM de glycine et 0,1% en poids /volume de SDS), appliqué à 11% de gels d'acrylamide, et scellés avec de l'agarose fondu (0,5% en poids /volume d'agarose dans un tampon d'électrophorèse contenant un trace de bleu de bromophénol). SDS-PAGE a été réalisée à l'aide Hoefer SE 600 chambres verticales et un tampon Tris-glycine (Tris 25 mM et de la glycine 192) contenant 0,1% p /v de SDS, avec une séparation initiale à 10 mA /gel constant pendant 30 minutes, suivi par 20 mA /gel. La deuxième dimension SDS-PAGE a été mis au point jusqu'à ce que le marqueur de colorant bleu de bromophénol a atteint le fond du gel. La durée totale de fonctionnement était généralement de 4 à 4,5 heures. Les gels ont été fixés dans 10% v /v d'acide acétique, 40% v /v d'éthanol avant la sensibilisation pendant 30 min dans un tampon contenant 30% v /v d'éthanol, 0,2% en poids /thiosulfate de sodium v ​​et 0,83 M d'acétate de sodium. Cela a été suivi par trois lavages de 15 min dans de l'eau déminéralisée. Les protéines ont ensuite été colorées avec 0,1% en poids /volume de nitrate d'argent pendant 20 minutes, lavées deux fois dans de l'eau déminéralisée pendant 1 minute, et développées dans 2,5% p /carbonate de sodium v ​​contenant 0,04% v /v de formaldehyde (solution à 37%). Le développement a été stoppée avec 1% v /v d'acide acétique, et les gels ont été lavés trois fois dans l'eau.
Analyse d'images et d'analyse statistique
ImageScanner Umax (Amersham Biosciences) a été utilisé pour balayer les gels, alors que l'image principale ™ 5.0 du logiciel 2D Platinum Version (Amersham Biosciences) a été utilisé pour la détection de tache, la quantification et l'appariement. L'intensité de chaque tache a été quantifiée par volume%. Les données ont ensuite été analysées en utilisant SPSS 11.5 pour Windows et Excel. de t
-test a été utilisé pour analyser les différences de niveaux de protéines entre les échantillons de GCA et non tumorales, avec un niveau de confiance de 95%.
MALDI-TOF-MS et la recherche de base de données
constamment et significativement différente des étudiants les taches choisies pour l'analyse par MALDI-TOF. taches de protéines d'intérêt ont été excisées et hachées en petits morceaux suivis par décoloration et lavage avec de l'eau déminéralisée à plusieurs reprises jusqu'à ce que la couleur jaune a disparu. morceaux de gel ont ensuite été rincées avec 25 mM de bicarbonate d'ammonium, déshydratés avec ACN, et séchés dans une centrifugeuse sous vide. Par la suite, les protéines dans le gel ont été digérées avec 0,02 ug /ul de trypsine pendant une nuit à 37 ° C. peptides tryptiques ont été ensuite redissous dans une solution contenant 50% v /v d'ACN et 0,2% v /v de TFA. A 2 pl aliquote a été repéré sur une plaque d'échantillon avec 4 pi de solution de matrice CHCA (a-cyano-4-hydroxycinnamique d'acide, 10 mg /mL dans 50% v /v ACN, 0,2% v /v de TFA) et on laisse à l'air sec. Les taches séchées ont ensuite été analysées dans un Voyager DE MALDI-TOF MS (Framingham, MA, USA). Ceci a été suivi par l'exécution du spectromètre dans un mode d'ions positifs et en mode réflecteur avec les paramètres suivants: tension d'accélération de 20 kV; Tension gride, 94%; guider la tension du fil, 0,01%; et un retard de 200 ns. Les spectres ont été acquis manuellement avec l'intensité du laser fixé à 3200 avec 80 coups par spectre. Ensuite, la gamme de masse a été réglée entre m
/z
500 et m
/z
5000. calibration interne a été appliquée à l'aide de l'angiotensine II et de l'insuline B pics de la chaîne à 912,08 Da et 3495,95 Da, respectivement.
les protéines ont été identifiées par le peptide empreintes de masse en utilisant le programme de recherche Aldente [14] avec les paramètres de recherche suivants appliqués: SWISS-PROT et TrEMBL ont été utilisés comme les bases de données de séquences de protéines; une tolérance de masse de 100 ppm et un clivage incomplet ont été autorisés; carboxyamidomethylation, méthionine oxydées, et la phosphorylation ont été considérés comme des modifications possibles; le nombre minimal de peptides appariés est 4; et l'ion peptide était [M + H] + en utilisant des tissus fixés au formol et inclus en paraffine.
immunohistochimique et occidentale analyse par transfert
Pour valider les modèles d'expression de trois protéines dans les tissus GCA, immunohistochimie a été réalisée spécimens qui ont été appariés avec des échantillons 2-dE. Déparaffinés 5 um d'épaisseur des sections ont été traitées avec une peroxydase d'hydrogène à 0,3% pendant 3 min, avec un anticorps de blocage pendant 30 min. Après la récupération de l'antigène de la chaleur à médiation, les sections ont été incubées avec l'anticorps primaire à 4 ° C pendant la nuit comme suit: HSP27 (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1: 500; HSP60 (Santa Cruz, Amérique), 1: 300; et Prx-2 (Santa Cruz, Amérique), 1: 150. Les coupes ont été ensuite mises en incubation avec un anticorps marqué à la peroxydase (1: 500). Développé avec diaminobenzine et contre-coloration à l'hématoxyline
Pour l'analyse par transfert de Western, les échantillons de protéine (30 ug) utilisés dans le 2-DE ont été effectués sur 12% SDS-PAGE, transféré sur des membranes de PVDF, puis bloqué avec du PBS /5% de lait écrémé /0,01% de Tween pendant 2-4 heures à la température ambiante. L'anticorps primaire a été dilué dans du tampon de blocage et on a ajouté ce qui suit: HSP27, 1: 200; HSP60, 1: 300; et Prx-2, 1: 200. Par la suite, il a été mis en incubation avec une peroxydase de raifort (HRP) conjugué avec un anticorps secondaire et un anti GAPDH anticorps /β-actine conjugué à HRP pour confirmer la charge égale de protéines dans chaque voie pendant 1-2 heures à 37 ° C ou à la température ambiante. Les résultats des échantillons ont été lavés et détectés avec chimioluminescence améliorée pour les 30-60 s (Minipore).
différences entre les échantillons Profil de LCM navigué et tissus cryostat undissected entiers
Pour évaluer les effets de LCM navigué sur les profils de protéine du tissu, nous avons effectué 2-dE profils protéiques des tissus cryostat undissected entiers et LCM-échantillons de GCA. La figure 1 montre un exemple du procédé LCM navigué. La majorité des points détectés dans les tissus non tumoraux et tumorales disséqués a pu être observée dans l'ensemble des tissus de cryostat undissected, à l'exception de plusieurs taches. Cependant, il y a encore quelques taches trouvées dans l'ensemble des tissus cryostat undissected qui n'a pu être observée dans les deux échantillons LCM. Ainsi, cette technologie pourrait non seulement enrichir les cellules épithéliales non-cancéreuses et tumorales, mais pourrait aussi diminuer la contamination dans les tissus tels que l'hémoglobine [10, 11]. En outre, le processus de LCM navigué pourrait éliminer les effets de coloration sur la séparation des protéines par 2-DE [15]. Ainsi, nos données confirment la nécessité d'effectuer des naviguée LCM dans les études protéomiques des tissus GCA. La figure 1 Navigated microdissection laser de tissu tumoral. (A) Hématoxyline tachés gastrique cardia adénocarcinome; tissu (B) non marqué GCA; (C) Tumeur tissus après microdissection; (D) Capturé cellules tumorales sur le film de LCM.
Différences Profil dans l'expression des protéines entre les tissus GCA et les tissus non tumoraux environnants
Nous avons effectué un LCM navigué et 2-DE pour des paires de tissus tumoraux et non environnante les tissus tumoraux de patients GCA. Environ 800-1000 spots protéiques ont été détectées par coloration à l'argent. Pour mesurer la reproductibilité, chaque échantillon a subi trois fois l'expérience. Il y a eu 905 ± 74 et 867 ± 51 spots protéiques dans le plan de GCA et le tissu cardiaque gastrique non tumoral, respectivement. Les taches appariées étaient 799 ± 29 et 727 ± 34 séparément, et le taux d'appariement moyen respectif était de 88,2% et 83,8%. En outre, l'écart de position moyen de taches a été appariés 1,031 ± 0,205 ± 1,44 mm et 0,11 mm dans la direction IEF et SDS-PAGE, respectivement. Bien que l'analyse de l'image a montré que ces deux cartes-DE étaient reproductibles, il y avait de légères différences dans l'intensité et le nombre de taches. Néanmoins, une analyse des gels a révélé 27 spots protéiques dont les intensités varient substantiellement et uniformément entre les non-tumorales et des tissus tumoraux (fig. 2). Les rapports des intensités normalisées spot du cancer aux tissus paraneoplasis pour chacune des protéines d'intérêt ont été calculés. Spots montrant une différence de deux fois et avec une signification statistique (p < 0,05) ont été sélectionnés. Trois des résultats 2-DE ont été confirmés par des analyses par transfert immunohistochimique et de l'Ouest. Figure 2 2-DE carte de tissu cardia gastrique maligne et bénigne. Toutes les cartes affichées sont préparées à partir du même patient. (A) 2-DE carte des tissus cryostat undissected entiers; (B) 2-DE carte de tissu non-tumorale après LCM; (C) 2-DE carte de tissus GCA après LCM. D'identification
Protein
deux entiers spécimens de cryostat undissected et LCM-échantillons ont été utilisés pour l'identification des protéines. Vingt-sept taches de protéines différentes entre les tissus GCA et les tissus non tumoraux environnants ont été excisées. Cependant, seuls les 23 protéines ont été identifiées par MALDI-TOF-MS (tableau 2). Ce phénomène est probablement dû à des modifications post-traductionnelles comme Peroxiredoxin 1 (Prx-1), qui était présent à deux endroits adjacents (Fig. 2, comptant 11). Ces protéines ont été classées dans une des situations suivantes: la prolifération et la différenciation cellulaire (ANXA2, ANXA4, hnRNPA2 /B1), l'apoptose (Prx-1, Prx-2, SGPC, VDAC, ETFB), le métabolisme (ADH1C, AKR1C3, CA2, GATM ), protéase liée (CTSD, PACSIN1), cystoskeleton (actine 1, kératine 8), chaperons (HSP27, 60, 70, PDIA3), et liaison à l'ARN et la transcription (hnRNPH3, PCBP1, ENO1). La figure 3 montre les cartes PMF de HSP60.Table 2 protéines avec l'expression différentielle entre les tissus tumoraux GCA et les tissus adjacents appariés non-tumorales ont été identifiées par MALDI-TOF MS
Up-régulation protéines
Protein spot No.
adhésion No.A)
Mr /pib)
match
Cov (%) c)
test T
Ration (tumeur /non-tumorale) Moyens ± SD 1
protéine de choc thermique bêta-1 (HSP27) *
P04792
23 /6.0
9
54
0,0040
3,4279 ± 2,0727 2
choc thermique de 70 kDa protéine 5 (HSP70)
P11021
70 /5.0
22
42
0,0030
3,2597 ± 1,5314 3
60 kDa protéine de choc thermique (HSP60) *
P10809 de
58 /5.2
12
37
0,0001
2,8308 ± 1,1426 4
Protein disulfure isomérase A3 (PDIA3) *
P30101
54 /5.6
13
41
0,0280 4,2105
± 2,7294
5
Annexin A4 (ANXA4)
P09525
36 /5.8
10
34
0,0140
4,7153 ± 7,3434
6
Annexin A2 (ANXA2)
P07335
38 /7.5
7
26
0.0150
6,0722 ± 5,5431
7
Heterogeneous ribonucléoprotéines nucléaires A2 /B1 (hnRNP A2 /B1 ) *
P22626
37 /9.0
16
43
0,0050
10,7775 ± 9,5547 8
cathepsine D chaîne lourde (CTSD)
P07339
27 /5.6
12
61
0,0012
4,3552 ± 3,7703
9
protéine kinase C et la caséine kinase substrat dans les neurones protein 1 (PACSIN1)
Q9BY11
51 /5.1
5
24
0,0028
2,6026 ± 1,2147
10
glutathion S- transférase P (SGPC) *
P09211
23 /5.4
5
44
0,0026
3,8757 ± 2,2198
11
Peroxiredoxin-1 (Prx-1) *
Q06830
22 /8.3 8
59
0,0140
4,2744 ± 4,1568
12
Poly (rC) liant le protein1 (PCBP1) *
Q15360
37 /6.7
12
63
0,0070
2,7401 ± 0,5321
13
Aldo-céto famille réductase 1member C3 (AKR1C3)
P42330
37 /8.1
7
25
0,0040
2,7762 ± 1,1820
14
Glycineamidinotransferase (GATM)
P50440
44 /6.4 8
23
0,0390
2,7839 ± 0,4680
15
kératine, type II cytosquelette 8 (Keratin 8) *
P05787
54 /5.5
9
25
0,0020
3,5063 ± 0,6423
Down-régulation protéines
16
actine , cytoplasmiques 1 (actine 1) *
P60709
42 /5.3
6
30
0,0160
0,2603 ± 0,1539
17
ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes H3 (hnRNPH3)
P31942
37 /6.4
5
28
0,0015
0,6028 ± 0,6229
18
Peroxiredoxin-2 (Prx-2) *
P32119
22 /5.7
6
24
0,0250
0,2376 ± 0,1202
19
anhydrase2 Carbonic (CA2) *
P00918 de
29 /6.8
6
33
0,0130
0,3675 ± 0,1270
20
Alpha-énolase * (ENO1)
P06733
47 /7.0
16
42
0,0030
0,2898 ± 0,1340
21
alcool déshydrogénase 1C (ADH1C)
P00326
40 /8.6
7
49
0,0280
0,2287 ± 0,1680
22
Electron sous-unité de transfert de flavoprotein b (ETFB)
P38117
28 /8.3
6
26
0,0240
0,2655 ± 0,1415
23
tension dépendant anion canal sélectif (VDAC) *
P21796 de
31 /8.6
7
39
0,0120
0,4474 ± ​​0,0297
a) Swiss-Prot no.
b ) valeur théorique
c) la couverture de séquence%
* Les protéines ont été trouvées dans le cancer gastrique précédemment.
Figure 3 MALDI-TOF MS identification du point 3 en GCA.
immunohistochimique et analyse par transfert western pour HSP 27, 60 et Prx-2 dans GCA
pour étudier plus si HSP27, 60 et Prx-2 sont exprimés dans les tissus et de déterminer quelles cellules expriment ces protéines, l'analyse immunohistochimique a été réalisée à l'aide fixés à la formaline et paraffin- des échantillons de tissus intégrés qui ont été appariés avec des échantillons 2-dE. L'expression de l'HSP27 et 60 pouvait être observée dans tous les cytoplasmes des cellules de carcinome, alors il pourrait être considéré dans certains des cytoplasmes de épithélial (Fig. 4A-D) dans les tissus non tumoraux. En revanche, PRX-2 était presque pas trouvé être exprimé dans les cellules de carcinome, mais dans certains des cytoplasmes des cellules épithéliales (Fig. 4E, F). Pour examiner ces niveaux d'expression de protéine, l'analyse par transfert de Western a également été réalisée en utilisant les mêmes tissus (fig. 5). Comme prévu, HSP27 et 60 se sont avérés être toujours fortement exprimé dans le tissu tumoral, alors que PRX-2 a été supprimée. Figure 4 L'analyse immunohistochimique pour HSP27, 60 et Prx-2 dans cardia gastrique normale humaine et GCA. Les expressions de HSP27 (A), 60 (C), et PRX-2 (E) sont dans le cytoplasme des cellules tumorales; Expressions de HSP27 (B), 60 (D) et Prx-2 (F) ont été trouvés dans le cytoplasme des cellules épithéliales normales; Grossissements: A-F × 40, de contraste avec l'hématoxyline
Figure 5 analyse par Western blot pour valider l'expression accrue de HSP27, 60, et une diminution de l'expression de Prx-2 dans les tissus GCA.. . Rapport de GAPDH et β-actine ont été utilisés comme références
Cardia est la frontière anatomique entre l'œsophage et l'estomac; par conséquent, il existe une controverse constante au sujet de leur relation en termes d'épidémiologie, les caractéristiques cliniques, et la classification entre l'adénocarcinome oesophagien (EA), GCA, et la DGA. Pour comparer leurs profils de protéines, nous avons cherché la littérature pour trouver ces protéines. protéines Treize des 23 ont été trouvés dans DGA précédemment (tableau 2). Parmi eux, HSP27, 60, 70, PDIA3 et CA2 ont le même profil d'expression dans GCA et la DGA. En revanche, une expression de faible niveau de HSP27 a été trouvé dans EA [16-20]. Par conséquent, la tumorigenèse de GCA est différent de EA et la DGA, et donc GCA doit être une entité pathologique distincte.
Hétérogénéité cellulaire a été un obstacle important à l'analyse moléculaire des tissus normaux et malades. D'abord décrit par Emmert-Buck et al. en 1996, microdissection laser est une technique puissante et précise utilisée pour étudier les changements de protéines dans un sous-ensemble particulier de cellules dans un système à faible maintenance qui est facile à utiliser [8]. Comme d'habitude, diverses taches histochimiques de la section de tissu sont utilisés pour guider le processus de dissection. Cependant, plusieurs cas ont montré modéré à des effets dramatiques de coloration sur la séparation des protéines par 2-DE [21, 22]. Pour éliminer la coloration comme un effet néfaste potentiel, naviguée LCM a été développé récemment. Il utilise une coupe colorée pour guider la dissection du spécimen adjacents non colorés [23]. Cette technique a été appliquée avec succès dans l'étude des échantillons de cerveau [15]. En outre, en raison des caractéristiques morphologiques typiques de la cellule cardiaque colonnaire superficielle gastrique et la glande cardiaque, ils sont faciles à identifier sur une section déshydratées sans coloration. Par conséquent, LCM navigué est devenu une stratégie optique dans notre approche protéomique. Dans cette recherche, le nombre de cellules bénignes et malignes LCM dérivés varient considérablement et sont souvent de petite taille par rapport à l'ensemble des tissus cryostat undissected, malgré les profils qui étaient très similaires entre les échantillons de LCM et ceux undissected. Ceci indique que le PPCM navigué peut être une approche réalisable pour l'étude du tissu cardiaque gastrique et qu'il est compatible avec le 2-DE et MALDI-TOF.
Nous avons obtenu le profil protéique de GCA en comparant les changements dans la protéine les profils des tissus environnants non tumorales. Pour réduire les différences individuelles, des échantillons de tissus ont été obtenus à partir d'un même patient, qui nous permet d'étudier l'expression différentielle des protéines sous fond génomique similaire. Au meilleur de notre connaissance, nous avons rapporté la première analyse protéomique de GCA. Sur les 27 spots protéiques choisis, 23 protéines dans la plage de masse moléculaire de 15-75 kDa et ayant un point isoélectrique compris entre 3 et 10 ont été identifiés par 2-DE et MALDI-TOF. La plupart de ces protéines ont été décrites précédemment comme exprimé de manière différentielle, soit au niveau de l'ARNm ou au niveau des protéines dans d'autres types de cancer humain.
HSP sont un groupe de protéines de stress induites par les divers types d'agressions de l'environnement et physiopathologiques. Dans cette étude, co-up-règlements de HSP27, 70, et 60 ont été trouvés dans les tissus gastriques tumorales cardiaques. Chaperons, HSP27 et HSP70 peuvent inhiber l'apoptose par interaction avec apoptosome et la caspase activation du complexe [24], sous-tendant leur rôle dans la progression tumorale et une résistance au traitement [25]. De nombreuses études indiquent que HSP27 et HSP70 surexpressions signalent un mauvais pronostic et prédisent une mauvaise réponse à la chimiothérapie. HSP60 semble être un médiateur inflammatoire endogène clé et est probablement libéré par les cellules endommagées. Par ailleurs, en même temps que HSP70, HSP60 a un rôle dans la présentation des antigènes dans les maladies malignes [26]. Les HSP sont également surexprimée dans le sein, colorectal, gastrique, et les carcinomes de la prostate [10, 25]. Par conséquent, la surexpression de HSP27, 70, et 60 peuvent être des biomarqueurs utiles pour la carcinogenèse en GCA et peut être associé avec le degré de différenciation et le pronostic de la GCA.
Parmi les protéines identifiées, deux protéines sont impliquées dans la régulation de la transcription et l'expression de gènes associés à une tumeur. PCBP1, régulée à la hausse dans la GCA, est un régulateur post-transcriptionnel de l'ARN chaperon. Il a été démontré que PCBP1, conjointement avec TBP-1 et hnRNPK, contrôle des gènes du proto-oncogène lié à l'apoptose et l'expression des gènes, tels que le Bag-1, c-myc
, Apaf-1, XIAP, et DAP5, en stimulant l'activité du secteur interne d'entrée du ribosome (IRES). PCBP1 est nécessaire pour ouvrir l'ARN dans la région contenant la fenêtre d'entrée du ribosome, tandis que TBP-1 peut être nécessaire pour le recrutement ribosome [27, 28]. Récemment, Pickering, B.M. et al. décrit que les parties glycanes de PCBP1 pourraient être liées à la capacité métastatique et pourraient jouer un rôle dans le carcinome hépatocellulaire métastases [27]. Ensuite, la régulation positive des PCBP1 peut réguler le mécanisme de plafonnement indépendant initiation de la traduction des gènes associés aux tumeurs cardiaques dans le développement de la GCA. En tant que suppresseur de tumeur, l'alpha-énolase peut réguler l'activité du promoteur c-myc sous la forme d'une protéine de liaison de c-myc (MBP-1). MBP-1 peut alors se lier à l'élément de P2 dans le promoteur c-myc et rivaliser avec la protéine de liaison à la boîte TATA (TBP) pour supprimer la transcription de c-myc [29, 30]. D'autre part, la régulation de l'alpha-énolase est en conformité avec les travaux de Chang YS et al.

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