Retrospektive Überprüfung gezielte tiefe Sequenzierung zeigt Mutations Unterschiede zwischen gastro-Kreuzung und Magenkarzinomen

Retrospektive Überprüfung gezielte tiefe Sequenzierung zeigt Mutations Unterschiede zwischen gastro-Kreuzung und Magenkarzinomen
Zusammenfassung
Hintergrund
Adenokarzinome sowohl der gastro-Kreuzung und Magen molekular komplex sind, unterscheiden sich aber in Bezug auf Epidemiologie, Ätiologie und Überleben. Es gibt nur wenige Daten direkt auf die Frequenzen von Einzel-Nukleotid-Mutationen bei Krebs-Genen zwischen den beiden Standorten zu vergleichen. Die Sequenzierung von gezielten Genpanels können bei der Aufdeckung mehrere genomische Aberrationen mit einem einzigen Test.
Methoden
DNA von 92 gastro-Kreuzung und 75 Adenokarzinom des Magens Resektionsproben nützlich sein, wurde aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeproben extrahiert. Gezielte tiefe Sequenzierung von 46 Krebs-Genen wurde durch Emulsions-PCR durchgeführt, gefolgt von Halbleiter-basierte Sequenzierung. Gastro-Kreuzung und Magenkarzinomen wurden in Bezug auf Mutations-Profile gegenübergestellt, die Immunhistochemie und in-situ-Hybridisierung
, sowie entsprechende klinisch-pathologische Daten.
Ergebnisse
gastro-Kreuzung Karzinome mit jüngeren Alter assoziiert waren, häufiger Darm-Typ Histologie, häufigere p53-Überexpression und schlechter krankheitsfreie Überleben auf multivariablen Analyse. Unter allen Fällen wurden 145 Mutationen in Gene 31 detektiert. TP53
Mutationen waren die häufigste Anomalie entdeckt, und waren häufiger in gastroösophagealen Übergang Karzinome (42% vs. 27%, p = 0,036). Mutationen im Wnt-Signalweg Komponenten APC
und CTNNB1
unter Magenkarzinomen wurden häufiger (16% vs. 3%, p = 0,006) und Magenkarzinomen waren eher ≥3 Fahrer Mutationen entdeckt zu haben (11% vs. 2%, p = 0,044). Zwanzig Prozent der Fälle hatten potenziell verwertbare Mutationen identifiziert. R132H und R132C Missense-Mutationen in der IDH1
Gen beobachtet wurden, und sind die ersten berichteten Mutationen ihrer Art in Magenkarzinom. Schlussfolgerungen
Panel-Sequenzierung von Routinepathologie Material
kann auf mehrere Treiber Gene Mutations-Informationen liefern, einige, für die mit gezielten Therapien zur Verfügung stehen. Unterschiedliche Preise von Mutationen und klinisch-pathologische Unterschiede unterstützen, eine Unterscheidung zwischen Adenokarzinomen, die in der gastro-Kreuzung und diejenigen entstehen, die richtige im Magen entstehen.
Schlüsselwörter Magenkrebs gastroösophagealen Übergang Krebs Magenkrebs Genomik Magenkrebs-Sequenzierung hintergrund und Magen Krebs-Konten für mehr als 10.000 Todesfälle pro Jahr in den Vereinigten Staaten [1], und ist die zweithäufigste Ursache der Krebssterblichkeit weltweit [2]. Obwohl haben Karzinome des gastroösophagealen Übergang (GEJ) mit Magenkarzinomen in Krebsregistern und in klinischen Studien für gezielte Therapien [3] gruppiert worden, Läsionen an diesen beiden Standorten haben verschiedene klinische Merkmale. Adenokarzinomen des Magens mit Helicobacter pylori-Infektion
[4] und sinken in der Inzidenz weltweit [1] richtige verursacht. Im Gegensatz dazu sind GEJ Krebsarten die meisten im Zusammenhang mit gastroösophagealen Reflux-Krankheit [2-5] und Adipositas [6], und die Inzidenz von GEJ Karzinome stabil in den letzten 20 Jahren unverändert [7]. Darüber hinaus hat die Prognose von GEJ Karzinomen festgestellt worden, als Magenkarzinomen schlechter zu sein, und es ist unsicher, ob GEJ Karzinome sollten als Magen- oder Speiseröhrentumoren inszeniert werden [8]. In Anerkennung der Unterscheidung zwischen Karzinomen der GEJ, Speiseröhre und Magen kann die Sammlung von aussagekräftigen epidemiologischen Daten zu verbessern und zu einer erhöhten Management Präzision führen [9].
Mehrere Studien haben Unterschiede in den molekularen Eigenschaften von GEJ Karzinomen im Vergleich zu denen darauf hingewiesen, die entstehen, an anderer Stelle in den Magen. TP53
Mutationen sind häufiger in der GEJ als im distalen Magen, während ein Verlust von Heterozygotie des Locus TP53
ist auch häufiger in GEJ Tumoren [10,11]. Signifikante Unterschiede in Promotor-Methylierung Raten von APC
und CDKN2A
wurden ebenfalls beschrieben [12]. Darüber hinaus Unterschiede in APC
Mutationsraten und Proteinexpression, sowie Unterschiede in der globalen Genexpressionsprofile zwischen den beiden Seiten haben auch gezeigt worden, [13-16].
Prüfung von Verstärkungen des ErbB2
( auch als HER2
) Gen in Magen-und gastroösophagealen Übergang Krebs bekannt ist jetzt gängige Praxis in vielen Institutionen [17]. In ähnlicher Weise aktuell informiert Behandlung Prüfung für Fahrer Mutationen, insbesondere Einzel-Nukleotid-Substitutionen, in Onkogenen und Tumorsuppressor-Gene in Adenokarzinomen von anderen Websites wie der Lunge und Dickdarm [18-20]. Als weitere molekulare Targets über Befall entdeckt werden, werden wirksam Assays erforderlich Krebsanfälligkeit gezielte Behandlung zu bestimmen.
Next-Generation-Sequenzierung kann in naher Zukunft verwendet werden, um mehrere Gene in einer einzelnen Probe zu verhören, und diese Daten könnte verwendet werden Kliniker von Fahrer Mutationen zu informieren und gezielte Behandlung führen. Gezielte Panel-Sequenzierung ist eine Form der nächsten Generation Sequenzierung, wo Einzel-Nukleotid-Varianten in einer begrenzten Anzahl von zuvor bestimmten genomischen Loci detektiert werden, die durch die Absicht oft prognostisch und therapeutisch kritisch. Panel-Sequenzierung ermöglicht Multiplexen von Proben und tiefen Deckungsgrad (> 500x) erleichtert die Analyse von suboptimal Schablonenmaterial von Archivierungs Gewebe und Proben mit geringer Tumor Zellularität. Je enger Satz von Genen ermöglicht auch eine schnellere Probenverarbeitung und bioinformatische Analyse. Somit kann verwertbare Ergebnisse innerhalb von Tagen erhalten werden, anstatt den Wochen, im Vergleich zu ganzen Genoms und Exoms Ansätze. Allerdings sind die Daten durch die von Natur aus vorgespannt Auswahl von Genen beschränkt, und die Unfähigkeit, Kopienzahl ändert, Verlust der Heterozygotie und strukturelle Umlagerungen wie Genfusionen zu erfassen. Somit erfordert die effektive Nutzung von NGS sorgfältige Bewertung von Technologien, Assay Einschränkungen, Template-Anforderungen und die Forschung und klinische Fragen in Betracht. Die Ziele dieser Studie
wurden die Nützlichkeit der Panel-Sequenzierung auf Formalin-fixierten Paraffin- zu sondieren eingebettet (FFPE) Gewebe und klinisch kommentierte GEJ und Magenkarzinomen durch Panel-Sequenzierung der Hotspots von 46 Krebsgene zu vergleichen. Wir versuchten auch die Frequenzen von Mutationen, die mit Panel-Sequenzierung von Hotspots gegen Voll Exoms Sequenzierung unter Verwendung von öffentlich verfügbaren Daten aus dem Krebs-Genom-Atlas.
Methoden
Fall Auswahl und Abruf von klinisch-pathologische Daten
Institutional Ethik identifiziert zu vergleichen Genehmigung wurde von der University of British Columbia /British Columbia Cancer Agency Forschungsethikkommission (# H07-2807) erhalten und Forschung wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Fälle von Magenkarzinom wurden aus amtlichen Archiven von der British Columbia Cancer Agency (BCAA), einer Provinzreferenzzentrum abgerufen. Einschlusskriterien waren Verweisung an die Agentur zwischen 2004 und 2010 zur Verfügung FFPE Gewebe aus der chirurgischen Resektion des Primärtumors, vollständig klinisch-pathologische Daten einschließlich der klinischen Ergebnisse auf Follow-up, und das Fehlen von Metastasen bei der Präsentation. Biopsie-Proben von primären und metastatischen Läsionen wurden durch das Fehlen von kompletten pathologischen Daten ausgeschlossen. GEJ Lage wurde als Läsionen mit einem Epizentrum innerhalb von 5 cm von dem proximalen Ende der Magen rugal Falten [21] definiert. Kein Unterschied wurde zwischen Tumoren in Bezug auf die Lage ihrer Epizentrum innerhalb der 5 cm des GEJ hergestellt (d.h. Siewert Typ wurde nicht aufgezeichnet) [22]. befindet sich Karzinome wurden ausschließlich innerhalb der Speiseröhre ausgeschlossen, nach den jüngsten WHO-Kriterien [21]. Alle Magentumoren zur GEJ distal wurden für diese Studie binned zusammen. Clinicopathologic Daten wurde von einem Mitglied der klinischen Team nachträglich durch Überprüfung von Patientenkarten gesammelt, sowie durch Überprüfung der Pathologie Berichte.
Tissue Microarray-Konstruktion, Immunhistochemie und in-situ-Hybridisierung

Konstruktion Tissue Microarray wurde unter Verwendung von zwei 0,6 mm Bohrkerne aus zwei getrennten Abschnitten des Tumors durchgeführt. Immunhistochemische Färbung für p53 (1: 100; Klon DO-7, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), Baf250a (1:75, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), und das Mismatch-Reparatur (MMR) Proteine, einschließlich hMLH1 (01.25; Klon ES05, ​​Leica, Wetzlar, Deutschland), MSH2 (1: 5; Klon 25D12, Leica), hMSH6 (1: 300; Klon PU29, Leica) und hPMS2 (1: 150; Klon MOR4G, Leica ) wurde auf der XT Plattform (Ventana) durchgeführt. Expression von p53 wurde als fehlend hat (< 1% Kernfärbung), normal (1-60% Kernfärbung jeder Intensität) oder eine Überexpression (> 60% Kernfärbung jeder Intensität). Baf250a und MMR Proteine ​​wurden als intakt (≥1% Färbung) hat oder negativ (< 1% Anfärbung), bezogen auf die Proteinexpression spezifisch in Tumorzellen (d.h. Immun- und Stromazellen wurde Ausdruck ignoriert). ErbB2 und silber in situ
Hybridisierung (SISH) wurde mit der XT automatische IHC /ISH-Färbung Plattform (Ventana) durchgeführt. Ein ERBB2-
: CEP17 Verhältnis < 2.0 wurde als nicht-amplifizierte klassifiziert, und ein Wert ≥2.0 als verstärkt. Auszählung von SISH Signale wurde auf etablierten Protokollen basieren [17].
DNA-Probe Verarbeitung, Sequenzierung und Variante Aufruf
In jedem Fall Hämatoxylin und Eosin Objektträger wurden verwendet, um Gewebe zu führen macrodissection oder Scrollen von Tumor aus FFPE Folien ab umreißt von Tumoren durch einen anatomischen Pathologe. Tumor-DNA aus jedem Fall wurde unter Verwendung von Qiagen FFPE DNA-Extraktions-Kits (Qiagen, Venlo, Niederlande) extrahiert; wurde keine Keimbahn DNA extrahiert. Heraus DNA wurde unter Verwendung des Qubit-HS dsDNA Assay (Life Technologies Gaithersburg, MD, USA) quantifiziert; Alle Fälle hatten mit einem zuvor berichteten Anforderung für den Assay [21] ein Minimum von 10 ng DNA aus FFPE extrahiert, zu halten. Ein Minimum A260 /280-Verhältnis von 1,8 wurde für jede DNA-Probe erforderlich ist. DNA-Amplikon Bibliothekskonstruktion wurde unter Verwendung von DNA-Primer aus dem Ion Ampliseq ™ Cancer Hotspot-Panel v1 (Life Technologies) durchgeführt. Das Kit besteht aus 207 Primerpaare, die 739 Hotspots in 46 Krebs-Genen (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S1) abdecken. Indizierte Amplikon-Bibliotheken wurden zur Herstellung einer Emulsion Polymerase-Kettenreaktion und Sequenzierung auf dem Ion Torrent PGM-Plattform (Life Technologies) gebündelt. Ein Minimum von mindestens 500x Basenpaar Abdeckung wurde für jeden Fall erforderlich. Variant Berufung wurde mit der Torrent Variant Caller v2.2 (Life Technologies) unter Verwendung des hg19 Referenzgenom durchgeführt. Nur Varianten vorhanden bei Frequenzen ≥5% berücksichtigt wurden. Da Keimbahn DNA zum Vergleich war nicht verfügbar, Varianten wie möglich somatische Mutationen wurden ausgeschlossen, wenn sie als Einzel-Nukleotid-Polymorphismen mit mittleren Allelfrequenzen von >identifiziert wurden;.... 0 in der dbSNP Datenbank (www ncbi NLM nih gov /SNP); ihren Status als Nicht-Keimbahn-Varianten wurde weiter bestätigt eine PubMed-Suche mit (www. ncbi. nlm. nih. gov /pubmed).
mit dem Krebs-Genom-Atlas (TCGA) Daten
Kuratiert somatische Mutation fordert 281 TCGA Magen-Adenokarzinom Proben mit bekannten anatomischen Stellen wurden aus dem TCGA Data Portal abgerufen (http:... //TCGA-Daten NCI nih gov /TCGA /) am 19. Februar 2014. Protein-kodierenden in den Regionen Mutationen verstärkt durch das Ion Ampliseq ™ Cancer Hotspot-Panel v1 in jedem der 46 Gene wurden für Fälle erhalten und geschichtet nach Lage (60 Cardia /proximalen und gastro-Kreuzung im Vergleich
221 Fundus /Körper, Antrum /distal und Magen NOS). Die Kopienzahl Daten, RNA-Expressionsdaten und Proteinexpressionsdaten wurden nicht berücksichtigt, wie unsere eigenen Test nur Einzel-Nukleotid-Varianten (SNVs) und kleine Basenpaar-Insertionen /Deletionen (INDELs) erkennt. Die Frequenzen von Mutationen, unabhängig von der Art der Mutation, im Vergleich zu den Hotspot mehrere Panel-Sequenzierung verglichen wurden, die wir durchgeführt.
Datenanalyse
Mann-Whitney-U-Tests und Student t-Tests wurden verwendet, um lineare Variablen zu vergleichen, gegebenenfalls. Fisher genaue und Chi-Quadrat-Tests gegebenenfalls verwendet wurden kategorische Werte zu vergleichen. Überlebensanalysen wurden unter Verwendung von Log-Rank (Kaplan-Meier) und Cox Proportional-Hazards-Tests durchgeführt. Die 46-Panel-Gene wurden auf das Kyoto-Enzyklopädie von Genen und Genomen (KEGG) [22,23] und das Programm Ingenuity® Integrated Pathway Analysis abgebildet (Qiagen) zu identifizieren onkogenen Wege und Netzwerke für Mutationen angereichert und für statistisch signifikante Unterschiede zu testen zwischen gastroösophagealen Übergang Adenokarzinom des Magens und Proben. P
Werte wurden für mehrere Tests mit dem Benjamini-Hochberg (BH) Korrektur [24] korrigiert. Alle statistischen Tests wurden zweiseitig und ein P
Wert von < .05 Wurde als statistisch signifikant angesehen. Statistische Analysen wurden durchgeführt unter Verwendung von SPSS Statistics-Software (v22, IBM, Armonk, New Jersey, USA) und die Statistiksprache R v.2.15.1 (R Core Team (2012) R:.. Eine Sprache und Umgebung für statistische Berechnungen R Stiftung für . Statistical Computing, Wien, Österreich ISBN 3-900051-07-0, URL http:... //www R-Projekt org /)
Ergebnisse
Innerhalb amtlichen Archiven an der BCCA, 229 Resektion Proben von Magen-und GEJ Karzinome wurden von 2004 bis 2010 erhalten und für den Bau eines Tissue Microarray zur Verfügung standen. DNA wurde für 176 Fälle zur Extraktion zur Verfügung. Keine klinisch-pathologische Daten wurden für die Korrelation in 6 Fällen zur Verfügung. Drei Fälle hatte Metastasen innerhalb eines Monats nach der Präsentation dokumentiert, und diese wurden von der Analyse ausgeschlossen. Von den verbleibenden 167 Fällen entstanden 92 in dem gastroösophagealen Übergang und 75 ihren Ursprung in dem Rest des Magens (Abbildung 1). Abbildung 1 Flussdiagramm Fall Detaillierung Auswahl und Ausschluss für die Studie Kohorte.
Clinicopathologic Unterschiede zwischen GEJ und Magenkarzinomen
Die klinisch-pathologische Merkmale dieser Fälle sind in Tabelle 1 zusammengefasst und anonymisiert klinischen Daten werden in einer zusätzlichen Datei (Weitere Datei 2: Tabelle S2) zur Verfügung gestellt. GEJ Karzinome wurden mit jüngeren Alter bei der Resektion verbunden sind, häufiger Darm-Typ und weniger häufig diffuse Histologie, häufigere p53-Überexpression und weniger häufigen Verlust der p53-Expression, häufigere Stadium III, seltener Stadium I und häufigere Rezidive. Das krankheitsfreie Überleben war signifikant schlechter bei Patienten mit GEJ Karzinomen (2A), obwohl die beiden Kohorten in Bezug auf die Gesamtüberlebenszeit (2B) statistisch nicht unterschiedlich waren. Weitere klinisch-pathologische Merkmale waren zwischen den Tumoren der beiden Standorte, darunter T-Stadium, Resektionsrand Beteiligung, ErbB2
Verstärkung und MMR Proteinverlust (Tabelle 1). Der Anteil der diffusen Karzinome in der Lauren-Klassifikation) war ähnlich zwischen den beiden Standorten. Eine Subgruppen-Analyse von nur Darm-Typ Karzinome zeigten persistente Unterschiede zwischen GEJ und Magenkarzinomen in das krankheitsfreie Überleben und p53-Expression. Unterschiede in Alter, p53-Expression und das Ergebnis beibehalten, wenn nur Darm-Typ Karzinome Betrachtung als auch bei Tumoren in drei Subtypen geschichtet wurden (proximal nicht-diffuse, diffuse und distal nicht diffuse), wie von Shah et al vorgeschlagen. [16] (Weitere Datei 3: Tabelle S3) .Tabelle 1 Zusammenfassung der clinocopathologic Variablen in der klinisch-pathologische Variablen innerhalb Cardia und nicht-Cardia Adenokarzinome Kohorte
Clinicopathologic Variable gastroösophagealen Übergang
(n = 92)
Nicht-Cardia (n = 75)
Insgesamt (n = 167)
p
Alter (Mittelwert, Jahre)
61,5 + /- 9.6 [33-80]
66,3 +/- 11,9 [33-84]
63,7 +/- 10,9 [33-84]
0.001
Sex
0.297
Male
70 (76)
51 (68) 121
(73)
Weiblich
22 (24)
24 (32)
46 (27)
histologische Subtyp (Lauren)
0,008
Intestinale
65 (71) 36
(48)
101 (60)
Diffuse
15 (16)
26 (35)
41 (25)
Mixed
12 (13)
13 (17)
25 (15)
Stufe (AJCC)
0,031
IA-B
10 (11)
19 (25)
29 (17)
IIA-B
60 (65)
45 (60)
105 (63)
III-AC
22 (24)
11 (15)
33 (20) Wahlmöglichkeiten
0.415
gut differenzierten (G1)
4 (5)
10 (6)
mäßig differenzierten (G2)
39 (42)
25 (33)
64 (38)
schlecht differenzierten (G3)
47 (51)
46 (61)
93 (56)
Resektionsrandes
0.306
Unbeteiligten
74 (80)
65 (87)
139 (83)
Beteiligte
18 (20)
10 (13) 28
(17) ERBB2- Verstärkung
0.654
Absent
78 (85)
66 (88)
> 144 (86)
Präsentieren
14 (15)
9 (12)
23 (14)
BAF250a (ARID1A) Ausdruck
0.111
Intact
73 (79)
51 (68)
124 (74)
Absent
19 (21)
24 (32)
43 (26)
p53-Expression
2.8x10 -4
0 - abwesend
32 (35)
47 (63)
79 (47)
1 - normal (1-60%)
17 (19)
14 (19)
31 (19) 2
- erhöht (> 60%)
43 (47)
14 (19)
57 (34)
Mismatch-Reparaturproteine ​​
0.244
Intact
77 (84)
57 (76)
135 (80)
Abnormal
15 (16)
18 (24)
33 (20)
Anzahl der Rezidive
57 (62)
32 (43)
89 (53)
0,019
mediane progressionsfreie Überleben (Monate)
12
18
15
Anzahl der Todesfälle
69 (75)
48 (64)
117 (70)
0.130
Die mittlere Gesamtüberlebenszeit (Monate
) 18,0 23,0

20,0
Abbildung 2 Vergleich der krankheitsfreie Überleben und das Gesamtüberleben zwischen Patienten mit gastro-und Magenkarzinomen. A) Krankheit war freie Überleben signifikant schlechter für gastroösophagealen Karzinomen (durchgezogene Linien) im Vergleich zu Magen-Karzinome (gestrichelte Linien), Log-Rank-Test; p = 0,002, obwohl B) Gesamtüberlebenszeit nicht zwischen den beiden Krankheits Websites (Log-Rank-Test unterschied sich;. p = 0,225)
Bei multivariable Analyse wurde GEJ Standort unabhängig assoziiert mit schlechter krankheitsfreie Überleben (Cox Proportional Hazard = 2,08 [95% Konfidenzintervall: 1,25-3,44], p = 0,005) zusammen mit Marge Status und Mikrosatelliteninstabilität (Weitere Datei 4: Tabelle S4). Alter, Tumorgrad und Marge Beteiligung waren unabhängig Prognose des Gesamtüberlebens (Weitere Datei 5: Tabelle S5).
Identifizierten Mutationen mit dem Krebs-Panel
Unter allen Fällen 145 Mutationen in 31 Genen nachgewiesen wurden, mit 75 Mutationen entdeckt unter 57 der Tumore aus der GEJ und 70 unter 43 Magentumoren (Abbildung 3) detektiert Mutationen. Keine Mutationen wurden in 35 (38%) und 32 (43%) der Tumoren der GEJ und Magen bzw. detektiert. TP53
war die am häufigsten mutierten Gene, mit identifizierten Varianten in 59 von 167 Fällen (35%). Die nächsten, am häufigsten mutierten Gene waren PI3KCA
(6%), CTNNB1
(5%), K-Ras
(5%) und SMAD4
(4%). Weitere Varianten enthalten Hotspot Mutationen in IDH1
(2 Fälle), JAK3
(3 Fälle) und FLT3
(2 Fälle). Eine einzige Mutation in 70 Fällen festgestellt wurde (42%), 2-Mutationen wurden in 20 Fällen (12%) identifiziert und ≥3 Mutationen wurden in 10 Fällen (6%) identifiziert. Abbildung 3 somatische Mutationen in gastro-Kreuzung und Magenkarzinomen identifiziert. TP53
Mutationen wurden in einem größeren Anteil der gastroösophagealen Übergang Tumoren identifiziert, während Anomalien bei APC
/CTNNB1
häufiger bei Magentumoren. Schwarze Blöcke repräsentieren Mutationen Kürzen, während graue Blöcke Missense-Mutationen darstellen. Fälle und Gene, in denen Mutationen nicht identifiziert wurden, sind nicht enthalten. Keine Mutationen
innerhalb der Hotspot-Regionen von ALK
identifiziert wurden, CSF1R
, EGFR
, FGFR2-
, HNF1A
, HRAS
, JAK2
, MPL
, NPM1
NRB
, SRC
, STK11
oder VHL
. Alle Variante Anrufe sind in den Zusatzdaten (Zusätzliche Datei 6: Tabelle S6).
Unterschiede in der Mutationen zwischen dem GEJ und Magen
TP53
Mutationen wurden in 39 von 92 (42%) identifiziert von GEJ Tumoren und in 20 von 75 (27%) Magentumoren (p = 0,036). Wenn in die von Shah et al vorgeschlagen 3 Subtypen unterteilt. [16], TP53 aufgetreten
Mutationen häufiger in proximal nichtdiffusen Krebs (44%) als in diffuse Krebserkrankungen (37%) und distalen nichtdiffusen Krebserkrankungen (20%; p = 0,024). Diese Klassifizierung zeigte auch häufigere Mutationen in KRAS
innerhalb distalen nichtdiffusen Krebs (12%) gegenüber der proximalen nichtdiffusen (3%) und diffuse (0%) Karzinome (p = 0,12). Keine signifikanten Unterschiede in Mutation Frequenzen vorhanden waren unter den anderen einzelne Gene in der Platte. Zwei Komponenten des Wnt-Signalweg, APC
und CTNNB1
, in waren Aggregat mutiert häufiger in Magenkarzinomen als in GEJ Tumoren (16% vs. 3%, p = 0,006). Magenkarzinomen häufiger Mutationen in 3 oder mehr Gene (; 4 11% gegenüber 2%, p = 0,044) hatte. Keine Unterschiede in der Beteiligung von onkogenen Bahnen wurden zwischen den beiden Seiten angemerkt, basierend auf Mutations-Profilen. Abbildung 4 Proportions von GEJ und Magenkarzinomen mit Zahlen von identifizierten Gesamt und umsetzbare Mutationen. Solide dunkle Bereiche in den Spalten Fällen mit 1 Mutation darstellen, diagonal dunkel ausgekleideten Bereiche repräsentieren Fälle mit 2 Mutationen, und beschmutzte Bereiche Fälle mit 3 oder mehr Mutationen darstellen.
Potenziell umsetzbare Mutationen
Gezielte Therapien zur Verfügung stehen oder in der Entwicklung für vorkommenden Mutationen in den folgenden Gene: AKT
[25], BRAF
[26], ErbB2
[27], ErbB4
[28], FGFR1
[29], FGFR3
[30], FLT3
[31,32], IDH1
[33], JAK3
[31], KDR
[34,35], KRAS
[36], MET
[34], PDGFRA
[37], PIK3CA
[25], PTEN
[25], PTPN11
[38], RET
[39], SMO
[40]. Mutationen in diesen Genen wurden in 32 Fällen (19%), davon 6 Fälle (4%) mit 2 Mutationen und 3 Fällen (2%) mit ≥3 Mutationen identifiziert. Die Verteilung der umsetzbaren Mutationen war nicht signifikant verschieden zwischen GEJ und Magenkarzinomen. (P = 0,327; Abbildung 4)
prognostische Bedeutung von Mutationen
ErbB4
Mutationen mit schlechter krankheitsfreie Überleben (p = 0,018 assoziiert waren ), während es einen Trend hin zu schlechter krankheitsfreie Überleben im Zusammenhang mit Mutationen in ABL1
(p = 0,063) und JAK3
(p = 0,059). Keine dieser Mutationen waren prognostisch signifikant nach Berücksichtigung von Alter, Geschlecht, Lauren-Subtyp, Stadium, Grad und Margin-Status. Mutationen in BRAF
(p < 0,001), FGFR3
(p < 0,001), FLT3
(p < 0,001) wurden mit einer schlechteren Gesamtüberlebenszeit auf univariaten Analyse als Ergebnis eines einzigen Fall assoziiert mit Mutationen in allen drei dieser Gene.). BRAF
Mutation blieb prognostisch signifikant nach Berücksichtigung von Alter, Geschlecht, Lauren-Subtyp, Stadium, Grad und margin-Status (p = 0,002).
Mit TCGA Daten
Wenn die Hotspot-Regionen durch die Ablauftafel abgedeckt Beurteilung die Gesamtzahl der mutierten Gene pro Fall war ähnlich zwischen dem TCGA und Studien Kohorten (p = 0,659), einschließlich wenn entweder GEJ (p = 0,399) oder Magen (p = 0,845) Tumoren Vergleich nur (5A). Ein Trend hin zu häufigeren Fällen mit Mutationen in Genen ≥3 im Magen im Vergleich zu der GEJ wurde auch in den TCGA Daten (12% gegenüber 3%, p = 0,054) beobachtet. Die Gesamthäufigkeit der TP53
Mutationen war nicht anders zwischen der Studienkohorte und der TCGA Kohorte (p = 0,230). Keine Unterschiede in der TP53
, KRAS
und APC
/CTNNB1
Mutationsraten zwischen GEJ und Magenkarzinomen wurden in der TCGA Datensatz (5B-D) beobachtet. Die mutierten Gene in dem Datensatz TCGA sind in den weiteren Datei enthalten 7: Tabelle S7. die Mutationen mit möglichen prognostische Bedeutung in unserer Kohorte betrifft, so wurde ein Trend zu schlechteren Gesamtüberleben im Zusammenhang mit BRAF
Mutationen (p = 0,079), während keine prognostische Assoziation in der TCGA Kohorte in Verbindung mit Mutationen in ErbB4 gefunden wurde
, ABL1
, JAK3
, FLT3 in oder FGFR3
. Figur 5: Vergleich der Häufigkeit von Mutationen innerhalb der Studienkohorte identifizierte Hotspots Panel-Sequenzierung unter Verwendung, im Vergleich zu Mutationen identifiziert unter Verwendung von Voll Exoms Sequenzierung in den TCGA Daten. A) Mutationen über Mutations-Hotspots in den 46 Genen in der Platte, B) Mutationen in TP53
, C) Mutationen in KRAS
und D) Mutationen in der Wnt-Signalkomponenten APC
und CTNNB1
.
Diskussion
Diese Studie Einzel-Nukleotid-Veränderungen zu untersuchen den nutzen der Panel-Sequenzierung richtet in routinemäßig verarbeitet Magenresektion Proben zu identifizieren, die verwendet werden könnten gezielte Therapien zu führen. Wir versuchten, in zweiter Linie GEJ und Magenkarzinomen durch gezielte tiefe Sequenzierung eines Panels von 46 Krebs-Genen, um den Kontrast, die einige Unterschiede auf genomischer Ebene ergab, dass klinisch-pathologische Profile unterschiedlicher gelegt werden muss. Schließlich haben wir auch die Frequenzen von Mutationen unter Verwendung dieses Panel mit Ergebnissen aus ganzen Exoms Sequenzierung in Cancer Genome Atlas erhaltenen zu vergleichen gesucht.
Adenokarzinomen des Gastrointestinaltraktes sind molekular heterogene und komplexe [41-44]. In Magenkarzinom, tiefe Sequenzierung von Einzel-Nukleotid-Polymorphismus und RNA-Expressionsarrays haben vor kurzem Anomalien in mehreren Bahnen einschließlich WNT, Igel, Zellzyklus, DNA-Schäden zu reparieren und die epithelial-to-mesenchymale Transition [45] offenbart. Die aktuelle Verwendung von mehreren einzelnen Gen-Tests ist nicht haltbar diese Komplexität, besonders in Gegenwart von einer wachsenden Zahl von gezielten Therapien, eingeschränkte Ressourcen und begrenzte Gewebeverfügbarkeit. Somit ist es wünschenswert, gleichzeitig mehrere Gene zu untersuchen. Panel-Sequenzierung hat eine Empfindlichkeit von annähernd 100% im Vergleich zu herkömmlichen Assays, wie Sanger-Sequenzierung und PCR-basierte Verfahren, sowie eine Fähigkeit SNVs und INDELs bei Allelfrequenzen so niedrig wie 5% und 20% jeweils in beide zu detektieren FFPE [21,46-48] und zytologische Proben [49-52]. Gezielte Panel-Sequenzierung können Abweichungen in der Krebstherapie im Zusammenhang mit Genen in frühen Magenkrebs und Vorstufen Läsionen erkennen [53], und seine tiefe Abdeckung könnte besonders nützlich sein, bei Magenkrebs durch adäquate Ergebnisse trotz spärlichen Biopsiematerials und die Beimischung von Tumorzellen mit Desmoplasie und Entzündungszellen.
Putative Fahrer Mutationen in dieser Studie untersucht wurden, identifiziert in einer Mehrheit von GEJ und Magenkarzinomen. Bei weitem die am häufigsten nachgewiesenen mutierten Gens war TP53
und diese Mutationen wurden auch in einem frühen Stadium und Vorläuferläsionen unter Verwendung des gleichen Assays [53] festgestellt. Mehrere Fahrer Mutationen wurden in mehreren Fällen identifiziert, die Idee verstärken, die mehrere Gene müssen in genomisch komplexen Tumoren wie Magen-Adenokarzinome auf einmal abgefragt werden. Ein Fall mit einer Mutation in BRAF
(sowie FLT3 und FGFR3) wurde mit einer schlechten Gesamtüberlebenszeit sowohl uni- und multivariablen Analyse verbunden. Dieser Befund spiegelt einen Trend in den Daten TCGA zu schlechten Gesamtüberleben in BRAF
-mutated Tumoren beobachtet, was darauf hindeutet, dass in einigen Fällen Panel Sequenzierung eine prognostische Bedeutung haben.
Wir waren auch potenziell umsetzbaren Mutationen zu detektieren können in etwa 20% der Fälle, die entweder Gene oder Wegen beteiligt sind, wo gezielte Therapien verfügbar oder in der Entwicklung sind. Während diese Zahl im Idealfall höher sein würde, nur unser Assay bestimmten Hotspot-Regionen dieser Gene bedeckt, und nicht für die Kopienzahl Änderungen berücksichtigten, die auch nützliche Informationen gewinnen konnte. Eine weitere Verfeinerung solcher Platten ein breiteres Spektrum von Genen und Gen-Segmente umfassen wird, den Anteil der Fälle, in denen Mutationen identifiziert werden wahrscheinlich zunehmen. Obwohl beispielsweise TP53
Mutationen im ganzen Gen auftreten, erstreckt sich die Platte im Wesentlichen die Exons 5-8, und einige der Gensegmente, die nicht sequenziert werden häufiger mit einem Verlust von p53 auf Immunhistochemie assoziiert [54]. Diese Tatsache kann möglicherweise erklären, sowohl die Unterschiede in den Raten von TP53
Mutationen und Muster der immunhistochemischen Expression in der GEJ und Magen beobachtet. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

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